十一酸睾酮对肛提肌骨骼肌卫星细胞雄激素受体的影响

十一酸睾酮对肛提肌骨骼肌卫星细胞雄激素受体的影响 十一酸睾酮对肛提肌骨骼肌卫星细胞雄激 素受体的影响 医学创新2011年月筮鲞筮!!里:垒卫!.::墨: 十一酸睾酮对肛提肌骨骼肌卫星细胞 雄激素受体的影响 曹磊王志莲 【摘要】目的通过体外雄激素对骨骼肌卫星细胞影响的研究,为女性盆底功能障 碍性疾病治疗提供新的思 路.方法通过不同浓度雄激素对原代培养的骨骼肌卫星细胞的作用,测定细胞的数 量和细胞所达雄激素受体的 含量.结果女性生理范围内,随着雄激素浓度的升高,细胞数量增多,增值加快,雄激 素受体表达水平呈逐渐升高 趋势.结论女性正常生理范围内,雄激素促进骨骼肌卫星细胞增殖和雄激素受体的 表达,为雄激素治疗盆底功能 障碍性疾病的研究奠定了基础. 【关键词】骨骼肌卫星细胞;雄激素;受体 Testosteroneundecanoa~toandrogenacceptor'sinfluenceofanuslevatorskeletalmusclesatellitecellCAOLei, WANGZhi— lian.TheSecondHospitalofShanxiMedicalUnwersi~,Taiyuan030001,China 【Abstract】ObjectiveTreatsthrou 【ghinvilroandrogentotheskeletalmusclesatellitecellinfluencdsresearchforthe feminineDoughbottomfunctionbarrierdiseaseprovidesthenewmentality.MethodsThroughthedifferentdensityandrogen totheoriginalgenerationofraise'sskeletalmusclesatellitecell'sfunction,determinationcell'squantityandthecellexpresses theandrogenacceptoFscontent.ResultsInthefemininephysiologicalscope,alongwithandr ogendensity'selevation,cell quantityincreases,theincrementspeedsup,theandrogenacceptorexpressionlevelassumes elevatesthetendencygradually. ConclusionsInthefemininenormalphysiologyscope,theandrogenpromotionskeletalmus clesatellitecellmultiplication andtheandrogenacceptoFsexpression,haslaidthefoundationfortheandrogentreatmenttro ughbottomfunctionbarrier disease'sresearch. 【Keywords】Skeletalmusclesatellitecell;Androgen;Aeceptor 女性盆底功能障碍性疾病(pelvicfloordysfunction, PFD),是中老年女性常见病,发病率约为40%…,主要包括 盆腔器官脱垂(pelvicorganprolapse,POP)及压力性尿失禁 (stressurinaryincontinence,SUI).随着女性年龄的增大,体 内激素水平随之发生变化.女性在青春期后不仅体内雌激 素水平逐渐降低,而且雄激素水平也较前减少,绝经后变化 尤为明显.雄激素具有刺激组织摄取氨基酸,促进核酸与蛋 白质合成,促进肌纤维和骨骼的生长,刺激促红细胞生成素 分泌等重要作用.雄激素主要是通过雄激素受体(andro— genreceptor,AR)发挥作用,而AR在多种组织中分布,与其 他组织相比,骨骼肌中AR表达水平较低.骨骼肌中AR主 要分布在肌源性卫星细胞,成纤维细胞,肌管中,而肌源性卫 星细胞可能是雄激素直接作用的靶细胞J.文献报道,睾酮 (T)的平均水平随年龄增长逐渐降低,4O岁女性T水平大约 是20岁女性的一半.女性绝经期间T水平明显低于月经周 期正常女性,加之脱氢表雄酮和硫酸脱氢表雄酮也随年龄增 基金项目:山西省高校科技研究开发项目(项目编号:20101148) 作者单位:030001山西医科大学第二医院 通讯作者:曹磊 ? 1? 着? 长而逐渐下降,使T水平进一步降低].本研究旨在通过体 外雄激素对骨骼肌卫星细胞影响的研究为PFD治疗提供新 的思路. 1实验 1.1实验动物Wistar雌性大鼠. 1.2主要试剂DMEM高糖培养基,胎牛血清,TritonX一 100,I型胶原酶,胰蛋白酶,左旋多聚赖氨酸,十一酸睾酮注 射液,o—aetin一抗工作液,Desmin一抗工作液,Androgenre— ceptor一抗工作液,FITC—IgG,TRITC—IgG. 1.3培养瓶包被配制好的左旋多聚赖氨酸均匀涂于 25am培养瓶底部,转入细胞培养箱孵育,37?,2h.无菌三 蒸水冲洗后放入培养箱内干燥备用. 1.4实验方法 1.4.1细胞分离,培养大鼠麻醉消毒后在无菌条件下,取 肛提肌约0.5,1g,用PBS抗生素缓冲液冲洗3次.将肌肉 组织剪成1—3inn左右的肌肉碎屑.加人体积为组织体积 5倍的0.1%I型胶原酶溶液,电热恒温水浴箱37?消化 1,1.5h,400目不锈钢筛网滤过,收集筛网上未滤过的肌 束,加入体积为组织体积5倍的0.25%胰蛋白酶一0.2% ? 2?医学创新2011年4月第8卷第l0期 MedicalInnovationofChina,April.20l1.v0I.8No.10 EDTA溶液,37?消化25,35min,加入含10%胎牛血清 DMEM高糖培养基中止消化,用400目不锈钢筛网滤过,收 集滤液,离心,收集获取的细胞.将获取的细胞重悬,接种于 包被的培养瓶,放入37?细胞培养箱中培养1.h,贴壁细胞 ,标记为G1;1h后将未贴壁细胞转入新培养瓶中继续培养 1h,贴壁细胞标记为G2;1h后再将G2中悬浮细胞转入新的 新培养瓶中继续培养24h,不定时的观察细胞贴壁情况,贴 壁细胞标记为G3;24小时后将G3中悬浮的细胞1500r/min 离心5min,移人新的培养瓶中继续培养,标记为G4.原代培 养第1天首次换液,以后隔天换液一次.当细胞生长达 70%一80%融合,用0.25%胰蛋白酶一0.2%EDTA溶液消 化,以1:2的比例进行传代. 1.4.2骨骼肌卫星细胞的鉴定取对数生长期,状态良好的 各时段差速贴壁的活细胞接种于左旋多聚赖氨酸包被的盖玻 片(每个时段均接种双份细胞),制备细胞爬片.将细胞爬片 用4%的多聚甲醛固定30min,再加入0.1%TritonX一100通 透3min,然后加入0.6%甲醇一H0,处理10min,再用三蒸 水清洗.滴加5%BSA封闭液,室温20min,甩去多余BSA液, 向各相同时段的盖玻片分别滴加小鼠抗大鼠结蛋白(desmin) 一 抗工作液和兔抗大鼠骨骼肌肌动蛋白(n—actin)一抗工作 液,放入4?冰箱保存,孵育16—20h.一抗孵育结束后用 PBS缓冲液清洗,分别滴加对应的羊抗小鼠FITC荧光二抗工 作液和羊抗兔TRITC荧光二抗工作液,37?,避光2O, 30min,荧光显微镜下观察. 2结果 2.1细胞培养与分离结果大鼠肛提肌原代分离的骨骼肌 卫星细胞呈小圆形,折光性较强,部分细胞可见小突起,形态 学上与血细胞,成纤维细胞相似.采用差速贴壁法分离过程 中,多数成纤维细胞和杂质细胞在前2次差速贴壁时已基本 完成贴壁,多数骨骼肌卫星细胞在G3培养瓶中完成贴壁,在 G4培养瓶中因细胞数量过于稀少导致培养失败. 2.2MTr法观察骨骼肌卫星细胞体外培养增殖特性 2.2.I雄激素干预前骨骼肌卫星细胞生长曲线取生长状 态良好的骨骼肌卫星细胞制备单细胞悬液,以1×10/ml的 浓度接种于96孔培养板,放入CO培养箱连续观察7d,每 天取6孔细胞实验,用酶联免疫检测仪在492nm波长测定光 吸收值,设空白对照,每孔均测3次,取平均值.以时问为横 坐标,光吸收值为纵坐标绘制生长曲线图.(图1) 骨骼肌卫星细胞体外培养时潜伏期为1,2d,倒置相差 显微镜下可见2,3个或多个细胞成串排列;从第3一第5d, 卫星细胞进入对数生长期,圆形细胞占主导,随着细胞的增 殖,可见多处细胞局部呈簇样生长,细胞拉长变细,同时趋向 第7d进入卫星细胞增殖的平台期. 于平行排列;第6一 2.2.2雄激素干预后骨骼肌卫星细胞生长曲线同样方法 把细胞接种于5个96孔培养板,分别于5个96孑L培养板中 加入不同浓度的雄激素,依次为0.01×10一ng/Ixl,0.04× 10一rig/,0.16×10一rig/Ixl,0.64×10一ng/txl,1× 培期嗡尊间t关) 图1 10,ng/l,放入37?5%的c02培养箱,观察4d,并测定光 吸收值.以时间为横坐标,光吸收值为纵坐标绘制各浓度雄 激素干预后的骨骼肌卫星细胞生长曲线图.(图2) 'h?IM? to.OlXO"~Aa O.txl^d }O.16xl妒|触 tO.车4×1o呵t,破 tI.O×i'l^ 图2 不同浓度雄激素作用于骨骼肌卫星细胞,培养1,2d出 现生长曲线下降,可能是雄激素与卫星细胞不相适应引起, 培养3,4d卫星细胞迅速增殖,在第4天末出现细胞生长缓 慢并且下降,但细胞量仍多于起始细胞数.在5种不同浓度 雄激素的作用下,随着雄激素浓度的升高,刺激增殖作用也 随之增强. 2.3流式细胞术测定骨骼肌卫星细胞雄激素受体(AR) 浓度 2.3.1雄激素干预前骨骼肌卫星细胞AR浓度传第二代, 生长状态良好的骨骼肌卫星细胞制备单细胞悬液,固定,打 孔,加入抗AR一抗工作液,4?过夜,加入FITC标记二抗工 作液,室温20min,避光;重悬细胞于500PBS缓冲液中, 用流式细胞仪检测. 2.3.2雄激素干预骨骼肌卫星细胞后AR浓度的变化传第 二代,生长状态良好的骨骼肌卫星细胞,以0.O1×10ng/, 0.04×10.g/, 0.16×10ng/,0.64×10,ns/,1X 10ng/pJ5种不同浓度雄激素作用于卫星细胞,培养4d,采 用相同细胞处理方法,用流式细胞仪检测. 对照组与5种不同浓度雄激素组测定结果显示,在女性 生理范围内,雄激素作用于骨骼肌卫星细胞可以明显提高其 AR的浓度,且随着雄激素浓度的升高,AR浓度也相应升高. 49婷光餐但 医学创新2011年4月箜8卷簋Medic!!壁of:::: 捌羲黧害辞舯{i坼钇神!瞰蕺羹重-.0}毋?婚^靶}?蝴亡 {, 秽{l碡^蕞妻囊0{臻神砖嘲Hk舢0"辫《 黎 图3对照组和实验组雄激素受体表达量 3讨论 3.1骨骼肌卫星细胞鉴定骨骼肌肌动蛋白(0一Actin)Ls] 为骨骼肌的结构蛋白和功能蛋白,结蛋白(desmin)是肌细胞 内细胞骨架中问丝的构成成分,是鉴定卫星细胞的标志蛋白 之一_6.在骨骼肌组织中含有肌卫星细胞,成纤维细胞, 内皮细胞核血管平滑肌细胞.肌卫星细胞表达骨骼肌肌动 蛋白和结蛋白,而血管平滑肌细胞仅表达结蛋白,形态与肌 卫星细胞类似的成纤维细胞和内皮细胞仅表达骨骼肌肌动 蛋白.实验采用n—Actin免疫荧光染色和desmin免疫荧光 染色,使两种蛋白都荧光表达,对骨骼肌卫星细胞的鉴定结 果更加真实可靠. 3.2雄激素对骨骼肌卫星细胞的作用雄激素是一种促进 合成代谢的激素,能够增加肌肉的体积,力量,肌蛋白的合 成.女性雄激素主要来自卵巢间质细胞和门细胞,肾上腺皮 质网状带,少量在肝脏,脂肪,皮肤等组织转换生成,主要包 括睾酮,雄烯二酮,脱氢表雄酮和硫酸脱氢表雄酮.女性体 内睾酮(T),50%由外周雄烯二酮转化而来,肾上腺皮质分泌 约占25%,仅25%来自卵巢,主要功能是促进阴蒂,阴唇和阴 阜的发育,对雌激素有拮抗作用,对全身代谢有一定影响. 雄激素作用于骨骼肌卫星细胞,可使骨骼肌肥大,增加 肌肉的重量和肌肉力量,骨骼肌卫星细胞在雄激素的 作用下对盆底组织正常形态与功能的维持有积极作用.实 验中雄激素对骨骼肌卫星细胞作用的前后对比发现,虽然雄 激素作用于骨骼肌卫星细胞后细胞浓度略有下降,但随后细 胞迅速增殖,且增殖速度较前明显增快,在一定范围内,随着 雄激素浓度的增加,细胞数也逐渐增多,则随着细胞数量的 ? 3? 增多,骨骼肌受到加强. 雄激素是小分子物质,主要通过扩散进入细胞内,与细 胞内特异性受体结合,形成激素受体复合物,同时引起受体 构型的改变而活化,进而引起活化的受体与细胞核内靶基因 上的特定结合位点相互结合,启动基因转录,翻译生成特异 性蛋白j.当一定量的雄激素与其受体结合时,激素受体复 合物激活肌卫星细胞特定的细胞内途径而发挥积极作用,但 当AR下调时,这种积极作用将受到影响. 文献报道,AR水平的表达与体内雄激素的水平有关,骨 骼肌卫星细胞上的AR只有在低于某一阈值水平时,雄激素 对其具有正相调节作用;当AR高于某一阈值水平时,雄激素 则对其发挥负相调节作用.在血小板和巨核细胞系中, 1,10nmoX/L的低浓度睾酮可以上调AR表达,而浓度达 100nmol/L的睾酮则下调AR水平.也有报道,不同浓度 睾酮(1,4ixmol/L)与血管平滑肌细胞作用24h使细胞内 ARmRNA呈剂量相关性增加12],而关于盆底肌群中适合骨 骼肌卫星细胞增值的最适合雄激素浓度未见相关报道. 实验中,根据腾晓明等..报道正常女性血T浓度青年为 (52.76?27.72)ng/dl,中年为(36.02-i-15.54)ng/dl,老年 为(26.72?25.26)ng/dl,结合我国女性正常雄激素的平均 浓度水平,采用0.01×10一ng/l,0.04×10,v/"is,1,0.16× 10,,-,g/l,0.64×10I3ng/I. d,1×10.rig/5种不同浓度 雄激素作用于卫星细胞,通过雄激素干预骨骼肌卫星细胞比 较AR的变化,结果显示雄激素作用于骨骼肌卫星细胞后细 胞AR浓度明显增多.实验中在女性的正常生理范围内,随 着雄激素浓度的升高,AR表达水平呈逐渐升高趋势,但变化 不明显,说明雄激素可以明显刺激骨骼肌卫星细胞膜上AR 的表达,但在女性雄激素生理水平范围内,不同浓度的雄激 素作用差异不明显.所以通过体外生理剂量雄激素的作用 可以加强女性盆底肌肉力量. 现在肌卫星细胞在疾病治疗方面的研究是研究的热点, 国内外研究均处于起步阶段,实验中骨骼肌卫星细胞在雄激 素的作用下,表现出雄激素促进骨骼肌卫星细胞增殖和AR 的表达,为雄激素治疗盆底功能障碍性疾病的研究奠定了基 础,可能具有广阔的临床应用前景. 参考文献 [1]王建六,张晓红.女性盆底功能障碍性疾病的进展.中国实用妇 科与产科杂志,2008,24(1):30—33. 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(收稿13期:2011—02—15) (本文编辑:王春芸) 消癌平与消癌平联合奥曲肽对肝癌H22 小鼠肿瘤生长影响 陈妍杜秀玉裴毅 【摘要】目的评价消癌平注射液联合奥曲肽与消癌平单药对肝癌H昆明小鼠肿瘤生长的影响.方法采 用H22肝癌细胞混悬液注入小鼠左腋下造模,造模后小鼠,分成单药消癌平组(A组),消癌平注射液联合奥曲肽组(B 组)和空白对照组(C组),A组和B组小鼠再分成造模前4日,造模当日和造模后613三个给药组;造模一周后每日 测量肿瘤大小.采用单因素方差分析比较不同给药时间A组和B组肿瘤体积和瘤重问有无差异性.结果:(1)肿瘤 体积:造模前给药组和造模当日给药组,造模一周后B组<C组(P<0.05),造模两周后B组明显优于A组(P< n05);(2)瘤重:造模前给药组A组,B组均<c组(P<0.05);造模当日给药组与造模后给药组,B组<C组(P< 0.05)且明显优于A组(P<0.05).(3)造模前,中,后三组抑瘤率B组(抑瘤率为68.2%,52.9%,27.5%)优于A组 (抑瘤率为50.4%,36.2%,10.8%).结论消癌平联合奥曲肽对肝癌H2的昆明小鼠的 肿瘤生长抑制作用优于单 药消癌平,且预防作用更优于治疗作用. 【关键词】消癌平;奥曲肽;肿瘤抑制 TheEffectofXiaoaipingandXiaompingCombinedthOctreotideontheTumorgrowth.nHepatomaH22一bearing miceCHENYan,DUXiu一PElYt.ShahxiTumorHospital,Tuiyuan030013China 【Abstract】ObjectiveInordertoassesstheanti— tumoreffectofXiaoaipingandXiaoaipingcombinedwithOctreoti- deonhepatomaH22一 bearingmice.MethodsH22tumormodelinmicewerebuilt.MiceimplantedwithH22we1.edivided intothreegroup,groupAweretreatedwithXiaoaipingalone,groupBweretreatedwithbothXiaoaipingandOctreotide,group Cwerenottreated,meanwhilegroupAandBwerebothmadeupbythreeparts:treatedbeforetheimplantation,onthedayof implantationandafterimplantation.Tomeasurethesizeoftumoreachdayafteraweekfromtheimplantation,thenthetumor tissueswereweighed.Thetumorinhibitoryratesandweightoftumortissueswerecalculatedtoassesstheanti—tumoreffectof XiaoaipingandXiaoaipingcombinedwithOctreotideinmiceimplantedwithtumorcells.Results(1)Tumorvolume:group oftreatedbeforeandtreatedonthedayofimplantation.B<C(P<0.05),andBwBssuperiortoA(P<0.05)whentwo weeksafterimplantation.(2)Weightoftumor:groupAandBweregreatlyreducedcomparedwithC(P<0.05)whentrea- tedbeforeimplantation.groupoftreatedafterandtreatedonthedayofimplantation,B<C(P<0.05),andsuperiortoA (P<0.05).(3)ThetumorinhibitoryratesofallpartsofgroupB(68.2%,52.9%,27.5%)weresuperiortoA(50.4%, 36.2%,10.8%)(P<O.05).ConclusionThecombinationofXiaoaipingandKtretidehadag reatinfluenceontheinhibi? tionoftumoronH22一 bearingmice,whichwassuperiortoXiaoaipingalone,anditwasbettertopreventthanremedy 作者单位:030001山西医科大学(陈妍);山西省忻州市人民医 院(杜秀玉);山西省肿瘤医院(裴毅) 通讯作者:裴毅