基因突变检测新方法的研究进展

基因突变检测新方法的研究进展 鹿 可 ,09 应用化学 09232045, (江苏师范大学 化学化工学院 徐州 221116) 摘要 基因突变的检测在诊断遗传性疾病、确定癌变基因及药物抗性筛选方面发挥着重要作用。近年 来，研究基因突变的检测方法已成为化学及其交叉学科领域的研究热点之一，并已取得了较好的研究 成果。本文综述了近年来检测基因突变的方法，相关的基因突变检测方面的新方法向着安全、快速、灵敏、 易于实现自动化等方向发展。 关键词 基因突变; 检测; 分析技术; 进展 Studies on The Detection of Gene Mutation Lu, Ke (09 Applied Chemistry 09232045) (School of Chemistry and Chemical Engineering, Jiangsu Normal University, Xuzhou 221116) Abstract Methods of detection gene mutations plays an important role in the diagnosis of hereditary diseases, determining the cancerous gene and drug resistance screening. In recent years, the study of gene mutation detection method has become hot spots about the analysis of the chemical and its interdisciplinary fields, also has achieved better results. This paper reviewed recent progress about new methods of detection gene mutations, some new methods become more rapid, sensitive, and easy to automate Keywords gene mutation; detection; analysis techniques; progress 基因变异广义上说就是指基因结构变化而产生的可遗传变异，也即DNA水平上的突变造成的基因改变。这一突变过程的发生可能有很多原因，有自发性的，比如DNA配对过程中的装配错误，也有外源性的诱导因素，如物理，化学，生物因素等造成的染色体结构改变或者基因结构的直接变化。基因突变的检测在该方面发挥着重要作用，对其新技术新方法的研究很有意义。该领域的研究向着安全、快速、灵敏、定量、实现自动化方向发展。基因突变分析检测是确定某一未知基因与某遗传病之间关系的关键步骤，也是临床上对病人进行基因诊断的重要手段，近年来在基因突变检测方法的研究成为分析化学及其相近学科比较年期的研究热点之一，并已取得了较好的研究成果。 1 毛细管电泳-限制性片段长度多态性分析检测胃癌H-ras基因点突变 [1-3]毛细管电泳作为能够快速高效检测限制性内切酶酶切产物的一种方法，使其有望更好地用于基因检测诊断。以甲基纤维素(Methyl cellulose, MC)为筛分介质，用pUC19 DNA/Msp I (Hpa II) MarkerDNA片段为实验对象，通过考察筛分介质的浓度、pH值、毛细管的温度和运行电压优化出分离小于600 bp 的双链DNA片段的最适条件，并将此方法应用于临床胃癌患者肿瘤组织 H-ras 基因12位密码子点突变情况的检测。MC 是一种良好的筛分介质，运用其进行毛细管电泳对于遗传性疾病的诊断将更加快速、准确、简便、灵敏。尽管文献已有报道应用其它的筛分介质对DNA样品进行分离检测，但运用MC作为筛分介质建立的CE-RFLP分析方法检测基因突变点的文献很少报道， [4]利用MC简单、方便、易于得到等优点，建立以MC为筛分介质的CE-RFLP分析方法，克服了用线性聚丙烯酰胺(LPA)做筛分介质时黏度大，容易堵塞毛细管柱，合成困难等缺点，同时证明MC是一种良好的筛分介质， MC为筛分介质建立的CE-RFLP分析方法非常适合检测癌组织中基因突变情况。 2 RNase法 [5-6]其原理是RNase可以识别RNA，DNA或RNA: RNA杂交链中错误配对的碱基并将其切断，经聚丙烯酰胺凝胶电泳将正常链及被切断的含有突变点的链区分开来。杂交方法是将同位素或其它方法标记的正常野生型RNA片段与相对应的待测DNA片段混合，于90?左右变性并在室温下复性形成杂交分子。当待测DNA片段中存在碱基突变时，在该位点上二条链不能正常配对，便成为RNase的识别和切割位点。方法的优点是可以测定较大DNA片段，突变定位较准确，不需用有毒试剂。缺点是检出率较低，约60 % ~ 70 %左右，操作复杂并需用克隆法制备RNA。 3 PCR技术在突变基因检测中的应用 从广义的角度来看，基因突变包括点突变，染色体突变和基因组突变三种形式，只是所涉及的范围不同，后两种基因突变涉及的基因较多，可通过光学显微镜分析细胞有丝分裂中期的染色体而检出，亦可在间期用标记探针检出，点突变通常涉及的范围较少，它是肿癌和遗传病发生的主要分子改变。因此，它是基因分析的主要研究内容， [7]不同类型的基因突变有不同的检测途径，大致方法包括:应用基因探针直接检测;应用PCR技术检测;利用探针技术进行分析。 当基因内缺失时，可用已知的该基因DNA序列在缺失片段的两侧设计一对引物，然后进行PCR，对其产物行琼糖凝胶电泳，EB染色，紫外检测仪下检测有无特异性的扩增产物，即可非常容易的判断待检称本中有无DNA片段的缺失。一对引物PCR检测缺失如果一个基因的DNA序列已经清楚，其缺失部位亦较为固定，即可根据缺失发生区域的DNA序列在缺失片段的两侧合成一对合适的引物进行PCR，然后琼脂糖凝胶电泳及EB染色，短波紫外灯下观察有无特异性的扩增片段，该方法是检测基因片段缺失最为快速的方法，在实际应用中，为了避免因某些原因引起的扩增失败而导致假阴性结果的出现，常在反应体系中加入一对与缺失片段无关的基因引物，同时加以扩增，以确定无特异性扩增带并非因反应体系的原因的引起，如在应用PCR技术进行X地贫Bartα基因胎儿水肿综合征义基因缺失检测时，常用一对引物扩增缺失区域，同时同一对β基因引物扩增β基因的一个片段，然后电泳检测.若同时即有α和β基因的特异性扩增产物，若无α基因的扩增产物则说明DNA中有α基因的缺失，为Bart胎儿水肿综合征。 多对引物的多重PCR检测缺失:对于某些遗传病的致病基因来说，其缺失具有明显的异质性，即在不同患者其缺失片段有所不同，因而难以用一对缺失部位的引物将所有的缺失检出，在这种情况下，我们可设计多对引物检测该基因的不同外显子区域，即用同一PCR体系扩增多个外显子然后用琼糖凝胶电泳检测有无缺失的片段，若某一特异性的扩增产物带缺如，则可判定为该片段的缺失，该检测方法是对已知结构基因有无缺失片段的最快速可行的检测途径，目前已用于多种遗传病基因缺失的检测，如在DMD/BMD缺失型突变的检测中，用23对引物分为三组进行多重PCR可改98%的缺失得以检出，另外还有人用9对物进行两组多重PCR，大约可检出DMD/BMD92%的缺失型突 [8]变，用PCR技术进行杂合性丢失的检测。有报道，PCR技术尚可用于检测杂合性丢失可采用PCR-SSCP及PCR定量技术进行检测。 4 单链构象异构多态分析技术(SSCP) 单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同. 因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差 [9]异的分子分离开.作者称该方法为单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymor-phism，SSCP)分析。 在PCR-SSCP技术中，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性.其基本过程是:?PCR扩增靶DNA;?将特异的PCR扩增 产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子;?将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;?最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果.若发现单链DNA的迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。 该方法简便、快速、灵敏，不需要特 殊的仪器，适合临床实验的需要.但它也有不足之处.例如，只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序;电泳条件要求较严格;另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检. 5 RNA 单链钩象多态性检测(PCR-rSSCP) [10-11]PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:?模板DNA的变性，模板DNA经加热至93?左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备;?模板DNA与引物的退火(复性)，模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55?左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;?引物的延伸，DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环 变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2,4分钟，2,3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 6 双脱氧测序单链片段构象多态性分析(PCR-ddF) 该法将双脱氧末端终止测序法与SSCP结合起来的分析技术，对由双脱氧末端终止的长短不一的单链DNA进行SSCP分析。如果目的片段存在一个突变，则所有大于某一大小对应于突主变位置的双脱氧终止片段无野生型系统，对于每一个突有多次机会检测其迁移率改变，提高了检测突变的效率。ddF方法克服了SSCP分析时因DNA长度影响SSCP显示的困难，通过一种双脱氧核昔酸生产特异性的单链DNA，使其中长度合适的DNA片段显示SSCP [12]改变。 7 限制性内切酶指纹技术(PCR-REF) 该方法的原理是基于序列不同的DNA单链片段，其空间构象亦有所不同，当其在非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时其泳的位置亦发生变化而表现出不同序列单链其电泳迁频率的差异，从而据引判断有无突变存在。对于一段DNA来说，其单链具有特定的空间构象，这种空间构象的形成与该段DNA的碱基序列有关，当这段DNA发生 研究发现，不同空间构象的DNA单链在中性聚丙烯突变，基碱基序列亦发生相应的变化，空间相象亦随之改变。 酰胺凝胶电泳时的迁效率有所不同，这样对于同一段单链DNA来说，这种空间构象的变化及电泳迁移的改变即能 [13]说明其有突变的发生因此，可用经PCR扩增的DNA片段经变性成单链然后在中性胶中电泳，即可检出有无突变。 8 限制性片段长度多态性(RFLP) [14]直接检测限制性内切酶切点的变化PCR产物酶解分析。PCR产物的酶解分析，主要用于检测可引起酶切位点改变，包括所增加的酶切位点及原有的酶切点消失的单碱基置换性点突变。当某一点突变引起DNA片段中酶切位点发生改变时，则可用酶切位点两侧的引物扩增一含该切点的DNA片段，然后用相应的内切酶进行处理，电泳检测，与正常的无改变的片段进行对比分析即可确定有无酶切位点的改变。比如镰状细胞贫血的发生即是由一酶切位点的改变，正常情况下靶DNA的扩增产物为294bp，经OxaNI消化后产生191bp和103bp二个片段，但镰状细胞贫血的突变使该切点消失，OxaNI消化后仍为294bp的片段，而杂合子则是有294、191和103三个片段。用引方法检测突变快速可简便，但必须在突变点涉及到限制性内切酶切关，因此其应用受到限制，反能检出点突变的极少一部分。 9 PCR直接测序 [15]DNA序列分析是检测基因突变最直接最可信的方法，它不仅可确定突变的部队，而且还可确定突变的性质。PCR直接测序是指对PCR产物进行的直接序列分析，而不是家传的测序技术先将DNA待测片段克隆于测序载体上，这不仅大大的简化了操用步骤，节省大量的人力和物力，而且可实现自动化操用，加之新的荧光检测技术的应用，使测序的效率大大提高。采用PCR循环直接测序时，应首先将扩增产物转化为单链测序模板，目前常用的转化方法为不对称PCR，即在反应体系中引物浓度的差异来形成单链DNA，通常侧引物的浓度为100?1，当某一引物被耗尽后，另一引物扩增的片段即为单链然后即可用于测序，此外，获得单链DNA还有磁珠俘获法，外切酶消化法，PCR直接测序的最新发展是将双脱氧络子技术与PCR技术相结合进行循环测序，在PCR反应体系中同时将ddNTP加入，并利用同位素或荧光素标记的引物引导扩增后，得模板的扩增与测序同时进行，其特异在于使用的模板量小且不需分离单链。 10 PCR-寡核苷酸探针斑点杂交(PCR-ASb) 如果一个基因的突变部位，性质经测序分析已经阐明，即可用该方法直接检测突变.该方法的原理即利用人工合成的寡核苷酸片段作为探针，与经PCR扩增获得的靶DNA进行杂交，在严格控制杂交条件的前提下，通过斑点杂交式其它类型的杂交来检测PCR产物中有无对应突变，即探针与靶DNA片段之间只要有一个碱基不相互配对或错[16-17]记，就能检出。 (1)探针一般合成两个，一个为正常序列，另一含有突变位点，前者与正常靶DNA完全互补，后者只与突变DNA互补，该探针称之为等位特异寡核苷酸探针(ASO探针)。 (2)杂交类型，传统的PCR-ASO技术主要是将PCR，占物固定于杂交膜上，然用不同的标记探针检测，亦有将已标记好的探针预先固定于杂交膜上，再使之与PCR产物结合，检测有无完全互补的DNA产物。 (3)探针的标记，最先应用的标记物为放射性物质有32P，34S，半衰期及放射性危害不能普遍应用.PCR技术的引进使可在短时间内获得足够量的靶 DNA片段，因而对探针的要求亦有的降低，因非同位素标记的探针亦可获非常满意的结果，它不仅使ASO探针使用起来更简便，而且无同位素半衰期的限制，操作亦更安全，适合于临床应用.目前已用PKU，β地贫杂的基因突变检测。 11 异质性双链构像多态性分析(HTX) 在同一扩增体系中，若同时含有正常模板和突变型模板时，随着PCR的循环进行，野生型基因片段和突变型片段均可扩增，并形成了异源双链，由于异源双链中未配对区的出现，因而其空间构型亦发生改变，这机型上的差别即形成电泳图谱上的差异，这种方法适合于较小DNA片段的分析，一般在300bp以下，其敏感性与SSCP相似， [18]该技 术简便，适用于快速的突变检出，已用于多种遗传病基因突变的研究。 随机扩增多态性DNA:随机扩增多态性DNA(RAPD)将通常PCR反应中使用的两个特定序列的引物改为单一的由10个碱基构成的随机引物，并运用大量的不同序列的随机引物进行扩增，使基因组DNA多态性充分展现出来。由于RAPD技术允许在事先未知DNA序列的情况下检测基因组中存在的多态性，大大方便和拓宽了对基因组DNA变异的研究，而使这一技术一出现就首先被用于分子系统学研究中。另外，由于RAPD技术可以在一次反应中检测基因组的多个位点，能快速寻找两组或多组DNA样品间的多态性。 12变性梯度凝胶电泳(DGGE) DGGE是检测基因突变故为精确的方法，它不仅可检测单一片段的单点突变，对多点突变的检测亦较容易，该方法与PCR技术相结合，使其能非常快速的对大量标本进行分析. 对于一DNA片段来说，其Tm值与基碱基组或有关，当其碱基组成发生变化时，Tm 值亦改变，因此，对于突变的片段来说，若其在一变性物质线性梯度增加的凝胶上进行电泳时，随着变性剂浓度的增加，当这种浓度达一定值时突变的DNA片段发生解链而形成分叉，其电泳迁移速度变慢.因此突变的DNA片段与正常的DNA片段电泳的迁移位置有差别，研究证明DGGE可检出任何类型的单碱基取代，如果将突变型与正常的DNA片段形成异源双链时，其敏感性大大提高. 13 恒定变性胶电泳(CDGE) [19-20]CDGE是DGGE基础上发展起来的基因突变检测技术，亦是利用突变基因与正常基因片段间Tm值的差异来检测突变的方法，该方法与DGGE的区别在于聚丙烯酰胺中的含的变性剂浓度相当于含突变基因片段的Tm值，而且浓度恒定，而不是线性递增.为了提高DGGE和CDGE的检测敏感性，通常在一侧引物的5'端设计一含GC的区域，避免了DNA的完全解链，从而提高了突变的检出率，可达100%。 14 温度梯度凝胶电泳(TGGE) 该方法是将PCR扩增的产物量一中性聚丙烯酰胺凝胶上，在一温度线性梯度上升的电场中进行电泳，当DNA双链到达其Tm时，双链解开，形成分叉，而影响电泳迁移 率，突变的扩增产物其Tm值与野生型有明显不同，因而有不同的解链区，从而造成电泳迁移效率的差别，据此可判断检材中DNA有无突变.除上述的几种以PCR为基础的突变检出技术外，还有错配碱基化学裂解法，PCR产物的RNA酶检出法及引物竞争法用于基因突变的检出，化 [21]学裂解法以期敏感性高，检测片段长而应用更为广泛。 15 基因芯片、SNP位点检测 测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交(Southern Blotting 和 Northern Blotting 等)技术操作繁杂、自动化程度低、 [22-25]操作序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有 多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。 结束语 以上就是目前比较常见的基因变异的分析方法。其中比较有前途，且发展比较迅速的技术有基因芯片，DHPLC， [26-30]MLPA，FISH等。总之，以PCR技术为基础建立的基因突变检测技术有多种，而且各有其优缺点，但目前较为广泛应用的为PCR-SSCP，PCR-ASO及PCR循环直接测序。从基因表达产物入手，进行间接检测基因突变的方法，如蛋白质截断实验(PTT)，体外合成蛋白质测定(LVSP近来发展应用于与人类疫病有潜在联系的基因突变的检测(运用这一试验。几种基因突变，包括剪切点变换、框外缺失、插入突变和大于25hp的框内缺失以及无义夹变都可在大片段cDNA中快速而敏感地分析出来，使用了一个包括RNA聚台酶启动子和真核生物翻译起始信号在内的上游PCR引物，这一经修饰的引物允许PCR产物进行转录和翻译合成的多肽通过SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳进行分析。蛋白质在大小上与野生型相异直接反映了一个突变影响重要蛋白质的长度。S标记的蛋氨酸或其它放射性氮基酸的结合已被用于通过电泳探测翻译产物。随着人们对基因变异的关注度提高，人们对其研究也更加深入，从而对研究方法或者研究技术的需求也不断提升，与此同时，也促进了相应技术的发展，有关基因变异的研究将是一片广阔的天地。 参考文献 [1] Felmlee T A, Oda R P, Persing D A, Landers J P. 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