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蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑缺血再灌注模型的影响

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蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑缺血再灌注模型的影响蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑缺血再灌注模型的影响 蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑缺血再灌注模 型的影响 西部医学2010年3月第22鲞弟—MedjWestChina,M—arch2010,Vo1.22,No.3 蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑缺血再灌注模型的影响 白雪,左英,罗钢,杨思进 (泸州市医学院附属中医院,四川泸州646000) 【摘要】目的观察蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型的影响.方法将150只健康雄性大鼠 随机分为6组,通过线栓法建立大鼠大脑中动脉(MCA)局灶性脑缺血再灌注模型,对照组按成人用量的l...
蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑缺血再灌注模型的影响
蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑缺血再灌注模型的影响 蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑缺血再灌注模 型的影响 西部医学2010年3月第22鲞弟—MedjWestChina,M—arch2010,Vo1.22,No.3 蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑缺血再灌注模型的影响 白雪,左英,罗钢,杨思进 (泸州市医学院附属中医院,四川泸州646000) 【摘要】目的观察蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型的影响.方法将150只健康雄性大鼠 随机分为6组,通过线栓法建立大鼠大脑中动脉(MCA)局灶性脑缺血再灌注模型,对照组按成人用量的lO倍给药每天 一 次,动物经给药1O次,观察蛭龙活血通瘀胶囊对脑缺血大鼠的行为状态,脑组织形态学和胶质细胞源性神经营养因 子(GDNF)蛋白达的作用.结果蛭龙活血通瘀胶囊能明显改善大鼠脑缺血后的行为状态,缩小缺血范围,降低缺血 程度,使病变的脑组织得到明显地改善,减少缺血区神经元的死亡,有明显的保护作用. 【关键词】蛭龙活血通瘀胶囊;脑缺血再灌注;胶质细胞源性神经营养因子 【中图分类号】R285.6【文献标识码】A【文章编号11672'3511(2010)03—0403,03 EffectsofZhilonghuoxuetongyucapsuleOilcerebralischemia-reperfusioninjuryrats BAIXue,ZUOYing,LUOGang,etal 0TheA}}tliatedTraditionalHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,Sichuan) [AbstraetlObjectiveToobservetheprotectiveeffectofZh订onghuoxuetongyucapsule(ZHTC)oncerebralisehe— mia—reperfusioniniuryinrats.MethodsThemodeloffocalcerebra1ischemia—reperfusioninratswasmadebymiddle cerebralarteryocclusion.RatsofeachgroupwerefeedwithdifferentdoseZHTC.Theeffecto fZHTContheratsfor behavioralstate,morphologyofbraintissue,andglialcellline-derivedneurotrophicfactorpr oteinexpressionwereob— served.ResultsZHTCcansignificantimprovebehavioraftercerebralischemia,reducethede greeofcerebralischemia andthedegreeofcerebralisehemiaandimprovethelesionsofbraintissuemarkedly. [Keywords]Zhj1onghuoxuetongyucapsule;Cerebralischemia—reperfusion;Neurobehavioral;Histopatholo— gy;Glialcell1ine-derivedneurotrophicfactor 脑血管病是人类死亡的三大杀手之一[1].脑卒 中是脑血管的主要病种,其中75%为脑梗死].脑梗 死发病率高,病死率高,致残率高,复发率高,严重危 害着人类健康,蛭龙活血通瘀胶囊为纯中药复方制 剂,临床用于急性缺血性脑病和中风后遗症,疗效显 着.本文用阻断大鼠大脑中动脉所致脑缺血再灌注模 型,观察了蛭龙活血通瘀胶囊对脑缺血的治疗作用. 1材料 1.1药物蛭龙活血通瘀胶囊,由泸州医学院附属 中医院制剂室提供,批号:20071213.临用时高,中, 低剂量组分别用温开水配成320mg/ml,160mg/ml, 80mg/ml的混悬液.步长脑心通胶囊:每粒0.4g,咸 阳步长制药有限公司产品,批号:071212,临用时用温 开水配成160mg/ml的混悬液. 1.2动物健康雄性成年SD大鼠,体重(250~300) g,皮肤光滑润泽,呼吸道通畅,清洁级,由泸州医学院 动物实验中心提供,合格证号:川医动字第017号. 1.3仪器HIMAS一2000多媒体彩色病理图文分析 系统(同济医大). 1.4试剂兔抗鼠GDNF多克隆抗体,北京中山生 物试剂有限公司,批号:071218.SP免疫组化试剂盒, 武汉博士德生物工程有限公司,批号:071216.DAB 显色剂,武汉博士德生物工程有限公司,批号: 071213. 2方法 2.1实验分组及模型的建立150只健康雄性SD 大鼠随机分为6组,即假手术组,模型组,蛭龙活血通 瘀胶囊治疗组(高剂量,中剂量,低剂量),步长脑心通 胶囊对照组.大鼠大脑中动脉阻塞(MCA0)模型以 Longa[3法为标准,大鼠造模前禁食不禁水24h. 室温条件下,大鼠称重后,用2戊巴比妥钠(45mg/ kg)腹腔麻醉后,仰卧固定在手术台上,颈部备皮,常 规消毒后行正中切口,分离暴露右侧颈总动脉 (CCA),颈外动脉(ECA),细致分离避免损伤迷走神 经,颈内动脉(ICA),翼腭动脉不予分离,CCA及ECA 近心端分别挂线结扎,微动脉夹暂时夹闭CCA远心 端,眼科剪45.在CCA远端上剪一小口,将制备好的 线栓切口插入,将预先置于CCA上的挂线适度系住 西部医学2010年3*-1第22卷第3期MedJWestChina,March2010,Vo1.22,No.3 防止出血,移去微动脉夹,用眼科镊缓慢推进线栓,视 线栓头端通CCA分叉进入ICA时将栓线弧度调整为 右下方向,遇阻停止,插人深度自CCA分叉处约16, 18ram(根据动物体重而定)即可通过MCA起始端至 大脑前动脉近端闭塞血管将先前的挂线扎紧固定栓 线然后缝合肌肉皮肤,缺血2小时后,拔出线栓,扎 紧备线,固定纤维缝合,切口局部以甲硝唑冲洗消毒, 每只大鼠注射lml(4万单位)庆大霉索以预防感染. 假手术组条件同上,但不插人线栓,仅将颈外动脉游 离.术中体温用烤灯维持在37?-37.5~C.术后单笼 饲养,放置恒温37?,保持体温.造模后的动物在自 然苏醒后,出现右侧Horner征,提尾左前肢内收屈 曲,爬行时向左侧划圈者为手术成功的标志.无神经 损伤动物剔除,并作随机补充. 2.2药物干预蛭龙活血通瘀胶囊成人的临床用药 量为4.8g/d.按人体用量的5,lO,20倍,成人体重按 60公斤计算,换算为动物高,中,低剂量组的用药量, 分别为1.6g/kg/d,0.8g/kg/d,0.4g/kg/d;对照组按 成人用量的10倍给药,即0.8g/kg/d.假手术组及模 型组给予等体积的生理盐水灌胃,每天一次,连续1O 天.每周称量大鼠体重一次,并按体重调整给药量. 2.2指标采集及检测方法 2.2.1对神经行为状态的影响神经系统症状评 分:参考Longa等5分制评分.评分标准:无神经损 伤症状0分;不能完全伸展左侧前爪1分;向左侧转圈 2分;行走时向左侧倾倒3分;不能自发行走,意识昏 迷4分. 2.2.2对脑组织形态学和GDNF蛋白表达的影响 每组随机取5只大鼠,迅速开胸,暴露心脏,用接有注 射器磨钝的1O号针头刺人左心室,迅速剪开右心耳, 以0.9生理盐水200ml快速滴人冲去全身血液;用 4多聚甲醛(pH7.3,PBS配制,40C)灌注固定,先快 后慢,灌注过程可见大鼠四肢抽搐,肌肉颤动,经灌注 3O一45rain后见流出液体基本无色即可,最后快速断头 取脑固定于上述固定液中.取前囱前2mm至前囱后 3ram脑组织,常规脱水,透明,浸蜡,包埋.连续冠状 切片,片厚5fire,备苏木素一伊红和免疫组化染色. 2.2.3统计学方法计量资料以均数?标准差(z? s)表示,使用SPSSI5.0软件进行统计学处理,组问差 异采用方差分析(OneWayAonva),两两对比采用t 检验.P<0.05,具有统计学意义. 3结果 3.1对神经行为状态的影响整个实验期问,假手 术组未出现神经功能损伤症状.模型组及低剂量组 大鼠毛色逐渐失去光泽,状态萎靡,自主活动少,出现 明显神经功能损伤症状如大鼠向瘫痪侧转圈,倾倒甚 至不能站立等症状.而高,中剂量和对照组大鼠精神 状态好转,毛色逐渐光泽,自主活动恢复明显加快,且 神经症状好转,仅对侧前肢不能完全伸展,少数向瘫 痪侧转圈,无倾倒等症状,见表1. 表1各组大鼠神经体征评分的比较(;士s,n=25) Table1Theneurologicalfunctiondefectofrats 组别剂量(g/kg)神经体征 注:与假手术组比较,?P<0.01;与模型组比较,?P<0.05,;与低剂 量组比较,?P<0.05 3.2对脑病理组织形态学的影响结果表明,假手 术组动物脑组织结构正常.模型组:缺血区的脑组织 结构变得疏松,有的神经元呈变性坏死改变,只留有 轮廓,有的神经元胞质呈嗜伊红明显增强,胞核固缩, 溶解或消失.高,中剂量组大鼠变性坏死脑组织的范 围缩小,程度减轻,正常细胞数量比模型组增多. 3.3对脑组织GDNF蛋白表达的影响结果显示: 模型组大鼠脑组织GDNF蛋白表达较假手术组明显 升高(P<O.01);与模型组比较,高,中剂量及对照组 大鼠脑组织GDNF蛋白表达明显升高(P<0.05或P <O.01);与低剂量组比较,高,中剂量组,对照组大鼠 脑组织GDNF蛋白表达均明显升高,有显着性差异 (P<O.05或P<O.01),见表2. 表2各组大鼠脑组织GDNF蛋白表达的比较(i士s,n=5) Table2GDNFexpressionincerebraltissueofrats 组别剂量(g/kg)GDNF蛋白阳性面积 注:与假手术组比较,?P<0.01;与模型组比较,?P<O.05,? P<O.Ol;与低剂量组比较.?P<O.05,?P<O.Ol 4讨论 脑缺血性脑血管疾病是一种多危险因素的疾病, 其多发生在大脑中动脉.本模型与临床人局灶性脑 缺血相类似,因此,可用该模型来评价蛭龙活血通瘀 胶囊对脑缺血再灌注的治疗作用.目前,国内外研究 西部医学2010年3月第22卷第3期—e!塑!!!:兰!: 者大多采用Longa法五分制评分标准,评价动物在局 灶性脑缺血后以偏瘫为主的神经症状[6?.近年研究 表明GDNF与脑缺血关系密切,能通过减小脑梗死体 积,减轻脑水肿程度,抑制神经元凋亡,增加存活神经 元数目在缺血性脑损伤中发挥保护作用[1. 5结论 蛭龙活血通瘀胶囊可明显减轻造模大鼠的神经 症状,能提高模型动物GDNF反应阳性细胞的含量, 以稳定缺血损伤神经元代谢功能,减少因脑缺血导致 的皮层神经元的变性坏死,并能缓解兴奋毒性所致的 神经元损伤,从而起到神经保护作用,在一定程度上 抑制了神经细胞的病理学改变,为临床试验提供了进 一 步参考. 【参考文献】 C1] [2] [3] [4] [5] 刘莹,杨晨.中国精神疾病杂志[刀.2008,(34)12:754—757. 侯熙德.神经病学[M].第3版.北京:人民卫生出版社,2003: 114. LongaEZ,WeinstinPR,CarlsonS,eta1.Reversiblemiddlecere- bralarteryocclusionwithoutcraniectomyinrats[J].Stroke, I989,20(1):84—91. 黄斌,王兴勇.线栓法制备Wistar大鼠局灶性脑缺血模型的 实验研究[J].现代医药卫生,2005,21(15):1935. 刘运泉.线栓法大鼠局灶性脑缺血模型的改进[J].中国f临床解 剖学杂志,2005,23(2):223. ?405? [6]deCourtenMyersGMtKleinholzM,WagnerKR,eta1.Stroke assessment:morphometricinfarctsizeversusneurologicdeficit [J].JNeurosciMethods,1998,83:151—157. 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[13]ChengH,HuangSS,LinSM,eta1.Theneuroprotectiveeffectof glialcellline-derivedneurotrophicfactorinfibringlueagainst chronicfocalcerebralischemiainconsciousratsE1].BrainRes, 2005,1033(1):28—33. (收稿日期:2009—09-21;修回日期:2009—12-20;编辑:张文秀) (上接第402页) 胞活化增殖,IFN一7促进Thl的分化.记忆性T细胞 中存在表达趋化因子受体CCR7差异的亚群,高表达 CCR7的记忆T细胞在遭遇抗原时可快速增殖,为再 次免疫应答提供大量T细胞.提示mBD6一M2e能激 活体内细胞免疫. 4结论 本研究成功构建pcDNA3.1(+)/mBD6一M2e,并 能够在MDCK细胞中表达融合蛋白.小鼠肌注pcD— NA3.1(+)/mBD6一M2e质粒后,刺激体内细胞免疫. 为进一步研究重组疫苗mBD6一M2e对实验动物的免 疫保护作用奠定了基础,也为防御素的抗流感病毒作 用机制研究提供了实验依据. 【参考文献】 [1] [2] KellyML,CookJA,Brown—AuqsburgerP,eta1.Demonstrating theintrinsicionchannelactivityofvirallyencodedproteins[J]. FEBSLetters,2003,552(1):61—67. ZouP,LiuWL?ChenYH.Theepitoperecognizedbyamono— elonalantibodyininfluenzaAvirusM2proteinisimmunogenic andconfersimmuneprotection[J].InterImmunopharmacol, 2005,5:631-635. 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