百令胶囊对肾小管间质纤维化大鼠肾脏α－平滑肌肌动蛋白表达的影响及意义

百令胶囊对肾小管间质纤维化大鼠肾脏α－平滑肌肌动蛋白达的影响及意义 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 百令胶囊对肾小管间质纤维化大鼠肾脏α,平滑肌肌动蛋白表达的影响及意义 (作者:___________单位: ___________邮编: ___________) 【摘要】 目的 观察百令胶囊对肾小管间质纤维化大鼠肾脏α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达的影响,探讨百令胶囊肾脏保护作用的可能机制。方法 雄性3个月龄SD大鼠90只,随机分为,对照组(30只),模型组(30只),预防组(30只),以腺嘌呤灌胃法建立大鼠肾小管间质纤维化模型,预防组加以1,5 g/(kgd)百令胶囊溶于生理盐水灌胃以预防肾小管间质纤维化,对照组以等体积的2%淀粉溶液和生理盐水灌胃。分别于实验第7、12、17周时随机处死10只大鼠,进行血肌酐(creatinine,Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen BUN),24 h尿蛋白定量和尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAG)酶检测,光镜下观察肾组织的病理变化及免疫组织化学法检测肾脏转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta1,TGF-β1)、α-SMA的表达情况。结果 ?功能学变化,与对照组比较,各时相点模型组、预防组大鼠尿蛋白、尿NAG酶、血Cr及血BUN均升高(P0,01),但预防组低 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 于模型组(P0,01),模型组、预防组自身对照各指标均较前一时相点 升高(P0,01)。?病理学变化,7周时模型组、预防组即有肾小管间 质损害,模型组、预防组自身对照肾小管间质损害均较前一时相点加 重(P0,01),但7、12周时预防组肾小管间质损害均较模型组为轻 (P0,01),17周时两组间差异无统计学意义(P=0,670)。?免疫组 化,各时相点模型组、预防组大鼠肾脏TGF-β1、α-SMA的表达均高 于对照组(P0,01),但预防组均低于模型组(P0,01),模型组、预防 组自身对照均较前一时相点升高(P0,01),17周时表达量最高。结 论 百令胶囊可能通过抑制α-SMA,在肾小管间质纤维化早期应用时 起到保护作用。 【关键词】百令胶囊,肾小管间质纤维化,转化生长因子- β1,α-平滑肌肌动蛋白 【Abstract】 Objective To observe the effects of bailing capsules on the expression of α-SMA in the rats with tubulointerstitial fibrosis to explore the possible mechanism of renal-protecting of bailing capsules.Methods 90 male Sprague-Dawley(SD)rats,aged three months,were randomly divided into three groups:control group(n=30),model group(n=30),treatment group(n=30).The renal tubulointerstitial fibrosis model was established by gavage with 150 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 mg/(kgd)adenine solved by a solution of 2 percent starch and bailing capsules solved by normal saline was gave to the rats from treatment group in a dose of 1,5 g/(kgd)and the same volume starch and normal saline were gave to the rats from control group.At week 7,12,17,ten rats of every group were killed,the urinary protein,N-acetyl-β-D-glucosaminidase(NAG)in the urine and renal profile including BUN and serum creatinine were examined.The histological changes of kidney were observed by light microscopy,and the expression of TGF-β1,α-SMA were examined by immunohistochemistry staining.Results At 7,12,17 weeks,the value of urinary protein,urinary NAG,serum BUN and serum Cr of rats from model and treatment group were higher than those of control one(P0,01),but those of treatment group was lower than those of model group(P0,01).The value of urinary protein,urinary NAG,serum BUN and serum Cr of rats from model and treatment group were increase,the highest in the 17th week.Renal interstitium injury was seen in model group and treatment group rats at week 7,and became aggravating after 7 weeks.The degree of renal interstitium fibrosis in rats from treatment group was lighter than that of model group at week 7 and 12(P0,01),but there was not a significantly difference at week 17(P=0,670); the expression of TGF-β1,α-SMA in rats from model DOC格式论文,方便您的复制修改删减 and treatment group were higher than those of control group(P0,01),and treatment group was lower than model group(P0,01).The expression of TGF-β1,α-SMA in rats from model and treatment group were increase,and the highest in the 17th week.Conclusion These results suggest that bailing capsules suppressed fibrogenic events accompanied by a decreased in α -SMAexpression at the early stage of TIF. 【Key words】Tubulointerstitial fibrosis; Transforming growth factor-beta1; α-smooth muscle actin; Cordyceps Sinensis 在肾小管间质纤维化发生发展中肌成纤维细胞出现,并在 细胞外基质过度沉积,该细胞主要表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA),α-SMA是肌成纤维细胞激活的指示性标志 物。本实验观察百令胶囊对肾小管间质纤维化大鼠肾脏α-SMA表达 的影响,探讨应用中药百令胶囊能否防治肾小管纤维化及其可能机制, 现报告如下。 1 材料与方法 1,1 动物模型 选用雄性3个月龄SD大鼠90只,体质 量160~210 g,购自郑州大学医学部动物试验中心。大鼠适应环境1 周后,随机分为对照组(30只),模型组(30只),预防组(30只。模型 组参考文献[1],将腺嘌呤以2%淀粉溶液溶解,制成混悬液,以150 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 mg/(kgd)灌胃,连续17周,制作大鼠肾小管间质纤维化模型,预防组以150 mg/(kgd)腺嘌呤灌胃,同时以1,5 g/(kgd)百令胶囊溶于生理盐水灌胃,对照组以腺嘌呤相同体积淀粉和百令胶囊相同体积生理盐水灌胃,分别于实验第7、12、17周时各组随机处死10只大鼠。取肾脏,经10%多聚甲醛固定,光镜下观察肾组织的病理变化和免疫组织化学法检测肾脏转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta1,TGF-β1)、α-SMA的表达情况。处死前取血,并于各时相点前1 d分别将各组10只大鼠放入代谢笼中留取24 h尿液,进行生化指标检测。 1,2 生化指标检测 血清肌酐(creatinine,Cr)和尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)采用BECKMAN CX-7全自动生化分析仪测定,24 h尿蛋白定量采用考马斯亮蓝法,尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAG)酶采用比色法。 1,3 肾脏组织病理 肾组织HE染色和Masson特染,光镜观察。在IDA-2000高清晰度数码显微图像分析系统下计算肾小管间质纤维化指数。高倍镜(×200)下随机选取10个不重叠视野测定小管间质纤维化面积与同视野小管间质总面积的百分比,进行半定量评分[2]。评分,0分,无病变, 1分,25%,2分:26%~50%,3分,50%。每张切片取10个视野的平均积分,再在各组取平均值。 1,4 免疫组化 采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶(SABC)法检测肾组织中的TGF-β1和α-SMA,操作步骤按SABC试 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 剂盒说明书进行。光镜下组织切片呈棕黄色颗粒性沉积区域为阳性染色部位。TGF-β1和α-SMA染色结果在高倍镜(×200)下随机选择20个不重叠的视野,采用半定量评分[3]。TGF-β1半定量评分标准,0分,无染色,1分,染色面积25%,2分,染色面积25%~50%,3分,染色面积50%~75%,4分,染色面积75%~100%。α-SMA半定量评分标准,0分,无染色,1分,染色面积5%,2分,染色面积5%~25%,3分,染色面积25%~50%,4分,染色面积50%~75%,5分,染色面积75%,弥漫染色。各试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。 1,5 统计学方法 各组数据均采用均值?标准差(x?s)表示,组间比较采用两组独立样本的t检验(双侧)和方差分析,由SPSS 10,0统计软件进行统计学处理。 2 结果 2,1 生化指标检测 实验大鼠24 h尿蛋白、尿NAG酶、血BUN、Cr含量变化,见表1。 2,2 肾脏组织病理改变 对照组肾小管间质基本正常。实验7周时,模型组和预防组大鼠肾脏肾小管扩张,间质单核细胞浸润、水肿,可见间质纤维组织灶性增生。12周时,模型组和预防组肾小管扩张明显,肾小管上皮空泡或颗粒性变性,基底膜断裂,小管间质区域增宽,纤维化明显。17周时,模型组和预防组两组大鼠肾脏病理检查均可见肾小管明显萎缩及消失,间质广泛纤维化。7、12周时,预防组大鼠肾脏病理改变均较模型组轻。17周时,模型组和预防组 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 大鼠肾脏病理改变差异无统计学意义(P=0,670)。各时相点,各时相点模型组和预防组大鼠肾间质损害半定量分析见表2。 2,3 肾组织免疫组化变化,TGF-β1、α-SMA,,见表3。 3 讨论 肾小管间质纤维化的发生是个复杂的病理生理过程,其机制尚未完全清楚。1952年,Philips建立腺嘌呤致大鼠肾功能衰竭模型,现已成为研究肾小管间质纤维化病理机制的理想动物模型。本实验以腺嘌呤150 mg/(kgd)灌胃1次,连续17周。实验第7周时,模型组尿蛋白排泄量、尿NAG酶水平高于对照组。病理改变显示,肾小管有沉积物出现,肾皮质出现异物肉芽肿,灶性小管扩张、间质单核细胞浸润、轻度纤维组织增生,而此时血BUN、Cr 水平和对照组比较无明显差异。随着时间的推移,病情的进展,至12周时,模型组血BUN、Cr等指标进一步增高,肾脏病理改变进一步加重,小管萎缩、扩张,间质纤维组织明显增加。17周时,模型组肾功能明显减退,间质大量纤维组织增生,肾小管结构消失。模型组大鼠肾脏TGF-β1表达量呈增加趋势,实验结果显示,肾小管间质纤维化动物模型制作是成功的,和楚非[1]报道相似。 据文献报告,肾间质纤维化的主要表现有肾脏固有细胞消失、肌成纤维细胞增多、细胞外基质沉积等[4]。肌成纤维细胞在纤维 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 化肾组织的广泛存在及其在的重要意义已为众多实验所证实。所谓肌成纤维细胞是形态上介于成纤维细胞和平滑肌细胞之间的细胞,该细胞表达α-SMA。在人肾组织研究中,发现肾小管间质内α-SMA表达量与肾小管间质纤维化的程度以及肾功能恶化程度呈正相关关系[5]。有文献报道,在实验大鼠肾小管受损和肾间质纤维组织增生较明显区域检测到了α-SMA阳性细胞,表明肌成纤维细胞的积聚发生在纤维组织增生较明显部位,肌成纤维细胞在肾小管间质纤维化中发挥着重要作用,且与肾脏功能有一定相关关系[6-10]。本实验免疫组化结果显示,模型组7周时α-SMA表达已明显增多,12、17周时α-SMA表达量进一步增加。α-SMA的变化与肾病理、肾功能、尿蛋白的变化相一致,即α-SMA高表达者,其病理重、SCr、BUN、尿NAG或尿蛋白值就高。本实验的结果提示,在腺嘌呤致大鼠肾小管间质纤维化模型中,随着病情的进展,α-SMA表达量增加,肾脏病理变化越来越重,标志肌成纤维细胞产生,促进肾小管间质纤维化的发生。预防组血Cr、血BUN、尿NAG及24 h尿蛋白值在第7周时与模型组比较无明显差异,第12周时均低于模型组,并且可见细胞浸润、小管细胞空泡变性及细胞坏死减少。预防组大鼠肾脏TGF-β1表达量均较模型组少,提示百令胶囊治疗对肾小管上皮细胞有保护作用,能有效地改善大鼠的肾损害,减轻肾小管间质纤维化。笔者的实验结果显示预防组大鼠肾脏α-SMA表达量均较模型组少,提示百令胶囊可能通过下调α-SMA表达,抑制肌成纤维细胞增多,使细胞外基质沉积减少,延缓肾小管间质纤维化而发挥其肾脏保护作用。 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 参考文献 ,1, 楚非,邹万忠,孙锁柱,等.大鼠肾小管间质纤维化中肾 小管上皮细胞表型转化的研究.中华肾脏病杂志,2003,19(1):10-14. ,2, Mezzano SA,Droguett MA,Burgos ME,et al.Overexpression of chemokines,fibrogenetic cytokines,and myofibroblasts in human membranous nephropathy.Kidney Int,2000,57:147-158. ,3, Mizuno S,Matsumoto K,Nakamura T.Hepatocyte growth factor suppresses interstitial fibrosis in a mouse model of obstructive nephropathy.Kidney Int,2001,59:1304-1314. ,4, Ng YY,Huang TP,Yang WC,et al.Tubular-epithelial-myofibroblasts transdifferen-tiation in progressive tubuloinstitial fibrosis in 5/6 nephretomized rats.Kidney Int,1998,54:864-876. ,5, 陈楠,王伟铭.肾小管间质纤维化机制及防治进展.肾 脏病与透析肾移植杂志,2001,10(6):551-552. ,6, 刘清娟,何宁,刘淑霞,等.糖尿病大鼠肾小管上皮 细胞转化与肝细胞生长因子和Smad7蛋白的表达.中国危重病急救 医学,2005,17(11),675-678. ,7, 易春霞,廖海强,周于禄,等.替米沙坦对糖尿病肾 病大鼠肾脏α-SMA表达影响的实验研究.中南医学,2006, DOC格式论文,方便您的复制修改删减 4(4):259-261. ,8, 陈威,杨守京,刘彦仿,等.实验性慢性肾缺血模型肾小管-间质细胞α-平滑肌肌动蛋白的表达和意义.肾脏病与透析肾移植杂志,2004,13(1):30. ,9, 王瑞英,姚敏,王绵,等.2型糖尿病大鼠肾小管上皮细胞中α-SMA的表达及其与肾功能的关系.中国老年学杂志,2006,26(5):647-649. ,10, 丁跃玲,丁英钧,赵玉庸.阿霉素肾病大鼠α-SMA表达特点及缬沙坦的干预治疗.中国药理学通报,2005,21(6),730-733.