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[生物医药论文精品]高效液相色谱法测定胸腺肽α1的氨基酸组成

2017-11-28 6页 doc 27KB 23阅读

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[生物医药论文精品]高效液相色谱法测定胸腺肽α1的氨基酸组成[生物医药论文精品]高效液相色谱法测定胸腺肽α1的氨基酸组成 高效液相色谱法测定胸腺肽α的氨基酸组成 1 摘要 目的: 建立高效液相色谱法测定胸腺肽α的氨基酸组成。方法: 采用OPA试剂柱前衍1 生法测定氨基酸组成。色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse AAA(4.6*150mm,3.5μm),流动相:A相为40mmol/L磷酸氢二钠的水溶液,pH7.2, B相为甲醇?乙腈?水,45?45?10,采用梯度洗 -1脱,流动相B在17min内从0,升至57,;流速:2.0ml?min;检测波长:338nm。 结果...
[生物医药论文精品]高效液相色谱法测定胸腺肽α1的氨基酸组成
[生物医药精品]高效液相色谱法测定胸腺肽α1的氨基酸组成 高效液相色谱法测定胸腺肽α的氨基酸组成 1 摘要 目的: 建立高效液相色谱法测定胸腺肽α的氨基酸组成。方法: 采用OPA试剂柱前衍1 生法测定氨基酸组成。色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse AAA(4.6*150mm,3.5μm),流动相:A相为40mmol/L磷酸氢二钠的水溶液,pH7.2, B相为甲醇?乙腈?水,45?45?10,采用梯度洗 -1脱,流动相B在17min内从0,升至57,;流速:2.0ml?min;检测波长:338nm。 结果:高效液相色谱法测定各氨基酸的线性范围为0.1,5μmol/ml,r=0.999,本方法重复性和精密度良好(RSD<2,)。结论:高效液相色谱法测定胸腺肽α的氨基酸组成,方法简便,结果准确。 1 关键词 胸腺肽α 氨基酸 高效液相色谱法 OPA试剂 衍生 1 Determination of Amino acid Composition of Thymosin αby HPLC 1 Abstract Objective: To establish HPLC method for determination of Amino acid Composition of the Thymosin α. Method:OPA-reagent pre-column derivatization method was used. 1 column: Agilent ZORBAX Eclipse AAA(4.6*150mm,3.5μm);mobile phase A: 40mmol/L NaHPO,pH7.2;mobile phase B:CHOH?CHCN?HO=45?45?10,the gradient elution method 24332 was used that the mobile phase B was increased from 0, to 57, in seventeen minutes; flow -1rate:2.0ml?min;detector wavelength:338nm. Results: There is a good linear relationship with every amino acid with the range of 0.1,5μmol/ml (r=0.999),the repeatability and precision of the method is good(RSD<2,). Conclusion: The method to determine amino acid composition of Thymosin α by 1HPLC is simple and accurate. Key s Thymosin α Amino acid , HPLC,OPA-reagent, derivatization 1, 胸腺肽α(thymosin 1,Tα)是胸腺产生11(批号:080101、080102、080103,本公司自的一种蛋白质和多肽激素,能刺激T淋巴细制)。 [1]胞的成熟。1966年,由Goldstein等最早从 2 色谱条件和系统适用性试验 牛胸腺组织TF5中分离出来,是一种具有热 稳定性的酸性多肽,比原来TF5制备的生物色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse [2]活性高10,1000倍。由于大多数氨基酸在AAA(4.6*150mm,3.5μm)。流动相:A相为紫外区没有吸收,我们采用柱前衍生,使其在 40mmol/L磷酸氢二钠的水溶液,pH7.2; B紫外区有吸收,之后采用HPLC对其氨基酸组 相为甲醇?乙腈?水,45?45?10,采用梯度成的分析方法进行了研究。 1 仪器与试药 洗脱,流动相B在17min内从0,升至57,。 -1Agilent 1200 HPLC(G1322A Degasser; 流速:2.0ml?min;检测波长:338nm。柱温:G1311A Quat Pump; G1329A ALS; G1316A ?。采用柱前衍生的方法,因此必须使用合40 TCC; G1314B VWD) (安捷伦公司);Agilent 适的进样程序,对所得的氨基酸样品进行衍生Chemstation B 03.01色谱工作站(安捷伦公化反应,进样器程序如下: 司);甲醇,乙腈均为色谱级(美国Tedia公1、从1号瓶中吸取2.5μl—硼酸缓冲液司);丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、(0.4mol/L硼酸水溶液,用10mol/L氢丝氨酸、谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸氧化钠调pH为10.2,冷藏) (上海康捷科技发展有限公司);正缬氨酸(安2、从11号瓶中吸取0.5μl样品 捷伦公司);其余试剂均为分析纯;胸腺肽α13、“在空气中”混合3μl,最大速度,2 次 4、等待0.5分钟 图1 HPLC系统适用性适用图谱 5、从2号瓶中吸取0.0μl—水 Fig 1 The suitability test of HPLC 6、从3号瓶中吸取1μl—OPA试剂3 样品处理 (0.4mol/L硼酸缓冲液中含3-巯基丙酸取本品约5mg,精密称定,置硬质瓶中, 和邻苯二甲醛(OPA)各10mg/ml)。 加入6mol/L盐酸溶液1ml,封口,于110?反 7、 在空气中”混合3μl,最大速度,6应24小时,冷却,启封,蒸干,精密加内标 次 贮备液0.5ml和0.1mol/L盐酸溶液4.5ml使溶 8、 4号瓶中吸取0.0μl—乙腈 解,摇匀,作为供试品溶液。 9、 从5号瓶中吸取32μl—水 4 方法学研究 10、“在空气中”混合18μl,最大速度,4.1 线性关系 分别精密量取对照品贮备液 2次 各0.6、0.5、0.5、1、2、4、5ml,分别置50、 11、进样 20、10、10、10、10、10ml量瓶中,然后分 别精密加入5、2、1、1、1、1、1 ml 的内标取丙氨酸(Ala)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸 (Ser)、天冬氨酸(Asp)、赖氨酸(Lys)、谷氨酸贮备液,再用0.1mol/L盐酸溶液分别定容至(Glu)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、缬氨酸(Val)刻度,摇匀,得到一系列溶液。将这一系列溶的对照品适量,加0.1mol/L盐酸溶液制成每液注入高效液相色谱仪,测定峰面积,以浓度1ml中含10μmol的混合溶液,作为对照品贮C(μmol/ml)对峰面积A进行线性回归得方备液。另取正缬氨酸(程(n,6),见下表: Nva)对照品适量,加 水制成每1ml中含10μmol的溶液,作为内标表2 线性试验 贮备液。精密量取内标贮备液和对照品贮备液氨基酸浓度范围 线性方程 r 各1ml,置10ml量瓶中,加0.1mol/L盐酸溶名称 (μmol/ml) 液定容至刻度,摇匀,作为对照品溶液。其分天冬氨y = 0.8017x + 0.9997 5.32,0.13 离度见下表: 酸 0.0339 表1 氨基酸系统适用性试验 y = 0.895x + 谷氨酸 0.9997 5.47,0.13 名称 Asp Glu Ser Thr Ala 0.0274 分离度 , 3.76 11.09 7.46 6.03 y = 0.8513x + 丝氨酸 0.9998 5.19,0.12 名称 Val Nva Ile Leu Lys 0.0148 分离度 12.70 2.11 4.32 2.12 1.93 y = 0.8223x + 苏氨酸 0.9997 5.23,0.13 0.028 y = 0.987x + 丙氨酸 0.9998 5.06,0.12 0.0193 y = 0.9436x + 缬氨酸 0.9996 4.97,0.12 0.0329 异亮氨y = 0.8307x + 0.9997 5.18,0.12 酸 0.0292 4.0 5.8 2.6 2.8 2.9 2.7 1.0 1.0 4.5 y = 0.86x + 080103 亮氨酸 0.9998 5.56,0.13 0.0152 结果表明,各批样品中各氨基酸的相对摩尔比 y = 1.4936x 均在一定范围内,即丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸赖氨酸 0.9998 5.01,0.12 –0.044 2.4,3.6,天冬氨酸、赖氨酸3.2,4.8,谷氨 4.2 精密度试验 将对照品溶液连续进样6酸5.4,6.6,亮氨酸、异亮氨酸0.8,1.2,缬 针,Asp、Glu、Ser、Thr、Ala、Val、Ile、Leu氨酸2.0,3.2。 和Lys峰面积比内标Nva峰面积的RSD分别5 讨论 为0.15%、0.15%、0.09%、0.14%、0.06%、5.1 大多数氨基酸在紫外区没有吸收,本法 0.09%、0.07%、0.08%和0.23%,进样精密度采用柱前衍生,使其在紫外区有吸收,且本柱 良好。 前衍生法简单、方便。 4.3 重复性试验 连续测定6份样品,每种氨5.2 在回收率试验中,丝氨酸和苏氨酸的回 基酸的相对摩尔数的RSD均小于1.2%,说明收率比较低,可能是样品处理过程中被氧化缘 本法测定氨基酸重复性良好。 故。 4.4 回收率试验 精密称取批样品9份,每份参考文献 约5mg,按上述样品处理方法处理后,精密加1 Goldstrein AL, Slater FD, White A, et al 内标贮备液0.5ml和0.1mol/L盐酸溶液4.5mlThymosin: effects on normal human blood 使溶解,摇匀,作为供试品溶液。依照上述色T-cells[J]. Ann NY Acad Sci, 1975,249:300-307. 谱条件进行测定,记录色谱图。氨基酸检查方2 Goldstrein ALLow TL, McAdoo M, McClure 法下Asp的回收率在96.4%,98.9%之间,GluJ, et al Preparation assay and partial purification 的回收率在94.2%,96.7%之间,Ser的回收率of a thymic lymphocytopoietic factor 在84.9%,87.6%之间,Thr的回收率87.8%,(thymonsin) [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1966, 90.1%之间,Ala的回收率在94.9%,97.1%之56(3) : 1010-1017. 间。Val的回收率在94.0%,95.7%之间,Ile 的回收率在95.0%,96.8%之间,Leu的回收 率在95.4%,97.9%之间,Lys的回收率 97.6%,99.9%之间。结果表明,上述的氨基 酸测定方法适用于本品的测定。 5 样品测定 取样品,按上述方法测定,结果如下表: 表3 样品测定 样品中氨基酸相对摩尔数 批号 Asp Glu Ser Thr Ala Val Ile Leu Lys 080101 4.0 5.9 2.6 2.8 2.8 2.7 1.1 1.0 4.5 080102 4.0 5.8 2.6 2.8 2.9 2.7 1.1 1.0 4.5
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