浅论左卡尼汀对心肌细胞h2o2损伤的保护作用

浅论左卡尼汀对心肌细胞h2o2损伤的保护作用 浅论左卡尼汀对心肌细胞H2O2损伤的保护作用 浅论左卡尼汀对心肌细胞H2O2损伤的保护作用 作者:戴红良 王洪新 吴国强 王东海【摘要】 目的 研究左卡尼汀对H2O2引起的心肌细胞损伤的保护作用。 利用体外培养乳鼠心肌细胞，0.2 mM H2O2作用 h建立氧化应激损伤模型，观察不同浓度左卡尼汀(50，100，200 mg/L)对心肌细胞活力、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响。结果 与正常组比较，模型组细胞活力下降，细胞MDA含量增加，SOD活性下降(P,0.01);与模型组比较，不同浓度的左卡尼汀可以提高心肌细胞活力，降低细胞MDA含量，增加SOD活性。结论 左卡尼汀对H2O2诱导的乳鼠心肌细胞损伤有保护作用。 【关键词】 左卡尼汀 过氧化氢 心肌细胞 损伤左卡尼汀(L-carnitine, LC)，又名肉碱，广泛分布于体内不同组织细胞，作用是携带长链脂酰CoA通过线粒体内膜，促进三羟酸循环正常进行，协助细胞维持生理活动所需的能量生成。作为一种有效的氧自由基清除剂，左卡尼汀已成功地用于氧化应激损伤性心血管疾病的治疗，显示出其广阔的临床应用前景。本实验旨在通过利用H2O2对乳鼠心肌细胞造成氧化损伤，模拟心肌氧化应激损伤模型，直接从细胞水平上探讨左旋卡尼汀的上述心血管保护作用。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物 出生1,3 d 的Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄兼用，由辽宁医学院实验动物中心提供。动物合格证号:SCXK(辽) 2003—0007。 1.1.2 主要药品和试剂 左卡尼汀，锦州奥鸿药业有限责任公司提供，用前溶于DMEM，配成所需浓度;过氧化氢，纯，购自国药集团化学试剂有限公司;胰蛋白酶(1:250)，Sigma公司;DMEM低糖培养基，Gibco公司;新生牛血清，杭州四季青生物科技有限公司;噻唑蓝(MTT)，Sigma公司; MDA、SOD试剂盒:南京建成生物工程研究所。 1.1.3 主要仪器 79—1磁力加热搅拌器，江南金坛电视大学应用电子厂;OLYMPUS倒置显微镜，日本;800型离心沉淀器，上海手术器械厂;恒温水浴振荡器，江苏金坛中大仪器厂;DG3022A型酶标仪，南京东华电子集团。 1.2 方法 1.2.1 原代心肌细胞培养 无菌操作下取出生1,3 d的SD乳鼠心脏，立即在PBS缓冲液中洗去残血，用眼科剪将心肌剪成约1 mm3 大小的碎块，放入50 mL三角 烧瓶，加入0.08%胰蛋白酶消化液5 mL，在磁力搅拌器上(35,37 ?)进行消化，10 min后取下吹打混匀后静置，吸弃上清，再加入5 mL胰蛋白酶消化液，同样消化8 min后，收集上清于离心管，并向离心管中加入少量DMEM培养基和小牛血清终止消化。上述过程反复进行5,6 次至组织块完全消化，200 目尼龙网过滤后离心收集细胞，重悬于含15,小牛血清的DMEM培养基，置入CO2 孵箱，37 ?静置培养1.5 h，以差速贴壁法纯化心肌细胞,将未贴壁细胞调至密度约5×105/mL，0.4%台盼蓝染色，活细胞比率达90%以上，接种于培养板中。每24小时换液1次，培养48 h后见细胞融合后出现整体搏动，可进行实验。实验前24 h换以0.04%低血清培养[1]。 1.2.2 实验分组 将无血清培养24 h后的细胞分为5 组:?正常对照组:不加任何药物;?H2O2损伤组;?50 mg?L-1 LC保护组;?100 mg?L-1 LC保护组;?200 mg?L-1 LC保护组。损伤组在正常心肌细胞培养48 h后加入终浓度0.2 mmol?L-1的H2O2作用 h;各保护组加入不同浓度的LC孵育1 h后，加入与损伤组相同的处理因素。 1.2.3 心肌细胞活力测定 采MTT比色法检测(设不加细胞只加孵育液的空白)检测细胞活力，将培养的心肌细胞以2.5×105/mL的密度接种于96 孔培养板，每孔200 μL。细胞分5 组，每组8孔，各组分别对应加入处理因素。于测试前4 h，每孔加入20 μL MTT(MTT终浓度0.5 mg?mL-1 );于CO2孵箱中继续培养4 h后弃去培养液，每孔加入二甲基亚砜100 μL，震荡10 min，使结晶物充分溶解。选择570 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(OD)值，可间接反映细胞活性的高低。 1.2.4 心肌细胞SOD、MDA的测定 将培养心肌细胞以5×105/mL，每孔1 mL的密度接种于24 孔培养板，按实验设计程序加入各种处理因素后收集细胞。参照试剂盒说明，MDA采用硫代巴比妥显色法测定，SOD采用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶法测定活性。 1.2.5 统计分析 数据均以x?s表示，应用SPSS 11.5软件包进行统计分析，采用方差分析及LSD-t检验进行统计学处理。 2 结 果 2.1 左卡尼汀对心肌细胞活性的影响 OD值大小可间接反映心肌细胞活力高低。分析数据可知H2O2组比正常对照组细胞活力降低，说明心肌细胞受到损伤;不同浓度左卡尼汀组较损伤组细胞活力增加，随浓度 增加作用明显。说明左卡尼汀能保护H2O2损伤的心肌细胞，并有剂量依赖性，见图1。##P,0.01VS对照组;*P,0.05VS H2O2组;**P,0.01VS H2O2组 图1 各个浓度左卡尼汀对过氧化氢(0.2 mmol/L)损伤乳鼠心肌肉细胞活力的影响(x?s, n=8 )2.2 左卡尼汀对细胞内MDA含量和SOD活性的影响 结果显示，与正常对照组比较，H2O2组MDA含量明显高于正常组，SOD活性明显低于正常组，不同浓度左卡尼汀组较损伤组MDA含量有所降低，SOD活性有所增加，并随浓度增加效果明显，见表1。表1 左卡尼汀对H2O2(0.2 mmol/L)损伤