【doc】 富含anthocyanin的水果提取物对血管内皮细胞产生PGE2的影响研究

【doc】 富含anthocyanin的水果提取物对血管内皮细胞产生PGE2的影响研究 富含anthocyanin的水果提取物对血管内皮 细胞产生PGE2的影响研究 第34卷第5期 2005年9月 卫生研究 J0URNALOFHYGIENERESEARCH Vo1.34No.5 Sep.2005581 文章编号:1000—8020(2005)05.0581—04?论着? 富含anthocyanin的水果提取物对血管内皮细胞产生PGE的影响研究 韩光亮李翠梅MazzaG杨晓光 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所,北京100050 摘要:目的研究富含anthocyanin的水果提取物对血管内皮细胞产生PGB的影响.方法将人类正常 的血管内皮细胞CRL-2606在Kaighn’sFl2K培养基中(补加有l0%FBS,0.1mS/ml肝素,0.03mg/ml的ECGS, 50us/ml链霉素和500u/ml青霉素)37?,5%CO的条件下培养至接近融合,然后在含有从水果中提取出的 anthocyanin的F12K培养基中添加或不添加100ng/mlLPS,继续培养 18小时,测定细胞生存率,并将培养液离 心,收集上清液,用STAT-ProstaglandinE2EIAt试剂盒测定培养基上清液中的PGB浓度.结果当CRL- 2606细胞暴露于300US/ml或以上的Chokeberry提取物中时,细胞的生存率低于60%,且现出一定的剂量效 应关系.而50,400US/ml的蓝莓提取物和100,700,ug/ml的黑醋栗提取物未显示细胞毒性.LPS刺激可使细 胞PEG2释放量增加一倍以上,蓝莓提取物可明显抑制由于LPS刺激引起的PGE,释放增加,IOOus/ml的蓝莓 提取物可完全抑制此作用而使其含量维持于正常水平.700,ug/ml的黑醋栗提取物对处于LPS刺激下的CRL- 2606细胞具有一定的抑制PGE,释放作用.而对于处于LPS刺激下的细胞,500uS/ml以上的Ch0keberry提取 物能抑制PGE的释放.结论富含anthocyanin的黑醋栗,蓝莓以及Chokeberry提取物可以抑制由LPS刺激 引起的血管内皮细胞释放PEG2增加的作用,具有一定的抗炎,抗氧化作用. 关键词:内皮细胞PGE2 中图分类号:R54Q25 Anthocyanin 文献标识码:A EffectofanthocyaninrichfruitextractonPGE2 producedbyendotheliacells HanGuang—liang,LiCui—mei,MazzaG,YangXiao-guang InstituteofNutritionandFoodSafety,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100050,China Abstract:0bjectiveTostudytheeffectofanthocyaninrichfruitextractonPGE2producedbyEndotheliaCeHs, MethodsNormalhumanendotheliaceHs,CRL-2606,wereculturedinF12Kmedium(complementedwith10%FBS, 0,1ms/mlheparin,0,03mg/mlECGS,50us/n~streptomycinand500U/mlpenicillin)in5%CO2with95%airat37?. Whenthecellsgrowclosetoconfluence,anthocyaninrichfruitextractwith/without100rIS/mlofLPSwereaddedtothe medium.Afterl8h0ursofincubation.cellswereharvestedandthesupematantwerecollected.Cellviabilitywasassayed. Aftercentrifugation,PGE2concentrationinthesupematantwasmeasuredwiththeSTAT-Pros~glandinE2EIAKit. Results300rtg/mlorhigherChokeberryextractshowedcytotoxicityeffectonCRL-2606cells,theviabilitywaslowerthan 60%andshowedadose—responsemanner.Underusingdosage,Blackcurran textract(100—700,ug/m1)andBlueberry extract(50—400US/ru1)didnotshowanycytotoxicity.WhenstimulatedbyLPS,theproductionofPGE2byendothelial cellswereincreasedtwofold.Blueberryextractinhibitsuchaction.100, ug/mlofBlueberryextractkeepstheproductionof PGE2innormalleve1.700/~gJmLofBlackcurrantextractand500, ug/mlChokeberryextractalsoinhibitthereleasingof PGE2.ConclusionAnthocyaninrichfruitextractfromBlueberry,Blackcurrant,andChokeberryinhibitPGE2produced byendotheliacells,thereexistantiinflammationandantioxidation. Keywords:endothelialcell,PGE2,anthocyanin 研究表明体质指数(BMI)较高同时吃西方膳食的人群发 生心血管疾病(CHD)的危险度较高,而若常吃富含蔬菜,水果 基金项目:国家留学基金资助项目(No.2013024) 作者简介:韩光亮,男,博士,副研究员,现工作单位中国医学科学 院药物研究所 1华北煤炭医学院药物研究所 2加拿大太平洋农业与食品研究中心 的食物,则其危险度较低.一般认为多酚类物质与该效应有 关.Anthocyanins存在于许多蔬菜和水果中,他们认为可能是 其抗氧化或抗感染作用在疾病的预防中发挥着作用….有些 科学家提出了动脉粥样硬化的氧化假说并推荐在膳食中多吃 水果和蔬菜. 越来越多的证据显示了水果和蔬菜在预防心血管疾病和 高血压中的保健作用. 582卫生研究第34卷 动脉粥样硬化是常见的疾病,粥样斑发生在内膜下.在 内皮细胞受到刺激是会释放出一些炎性物质,引起其周围的 氧化应激.血管内皮细胞释放的最常见活性物质是前列腺 素,其中PGE,由PGH2转化而来,而后者可在细胞内由花生 四烯酸通过环氧化酶途径合成.环氧化酶(COX)是一类结合 在质膜上的酶,在由花生四烯酸合成前列腺素的过程中起关 键作用,是形成各种前列腺素的第一步. 至今还不清楚水果提取物在前列腺素的形成中产生什么 样的作用,Anthocyanin作为一大类天然抗氧化物质和最重要 的水溶性色素存在于植物中. 有资料表明人体能以原形的形式吸收Anthocyanin并有部 分能在尿液中原形排出.有人估计在美国,摄人量大约在 180,215mg/d范围. 在本研究中作者选取CRL-2606细胞系来研究水果提取 物和Anthocyanin的活性,该细胞系是近来由ATCC从一个20 岁女性的回肠动脉内皮细胞中分离培养成功的人体正常细胞 系,它与动脉血管内皮细胞相似.在我们的前期体外 实验研究中,发现蓝莓和黑醋栗提取物具有明显的抗氧化作 用,所以,本次研究的目的是研究这些水果提取物质对血管内 皮细胞在有无外来刺激情况下产生PGE,的影响. l材料与方法 脂多糖(LPS,SalmonellaEnteritidis提取物),胶原,内皮细 胞生长因子(ECGS),肝素和DMSO由Sigma化学试剂公司购 买(St.Louis,MO);青链霉素,Kaighn’SF12K培养基,胰蛋白 酶一EDTA及胎牛血清(FBS)由G1BCO生命科技公司购买 (Gaithersburg,MD).Malvidin3一glucosidechloride,和cyanidin3一 glucosidechloride由Extrasynthese购买(Genay,France); lndomethacin(消炎痛)由Cayman购买(Michigan,USA). Blueberry(蓝莓)和blackcurrant(黑醋栗)由PacificCanadianFruit Packers提供(PittMeadows,BCCanada),提取是在作者实验室 中进行的;Chokeberry提取物由一保健品公司提供.STAT— PGE,测定试剂盒(CaymanChemical,Michigan,USA). 1.1实验溶液的配制 用DMSO配制50mmol/l的消炎痛,在平流无菌操作柜中 用0.2um的滤膜过滤形成储备液,无菌保藏.使用前以培养 基稀释为2,l0,30和50~mol/L的工作液.苦味果(Chokeberry) 提取物,蓝莓提取物和黑醋栗提取物分别溶解于培养基中形 成工作液,蓝莓提取物的浓度系列为0,50,100,200和 400~g/ml;Chokeberry提取物和黑醋栗提取物的浓度系列为0, 100,300,500和700,,zg/ml.Malvidin3一glucoside和cyanidin3一 glucoside溶解于培养基中,形成浓度系列为0,5,l5,45和 90tzg/ml,所有操作均在平流无菌操作柜中进行,并用0.2m 的滤膜过滤形成工作液. 1.2细胞培养 由ATCC(Manassas,VA)购买的人类正常血管内皮细胞 CRL一2606在Kaighn’SF12K培养基中在37?下和5%CO,的环 境中培养,在培养基中补加有10%FBS,0.1mg/ml肝素, 0.03mg/ml的ECGS,和50~g/ml链霉素与500U/ml青霉素.每 2,3天更换培养基一次. 实验前,将大约0.8×lO’细胞接种到培养瓶中,每种实 验液同时需要l0培养瓶细胞.所有的细胞在同样的条件下 培养.当细胞铺满表面的6o%以上时,培养基被不同浓度的 加或不加LPS的实验液所代替(5个加有实验液,5个既加有 实验液还加有100ng/ml的LPS).继续培养l8小时后j,收集 培养液,离心,保存于一80?备用. 1.3细胞生存率检验 细胞培养方法同上,只是在收集培养液之后,细胞用 0.05%胃蛋白酶和0.02%EDTA收集,并离心更换培养基,细 胞存放于碎冰中,在1小时内一部分细胞以色素排斥法在血 红细胞计数仪上检测其生存率. 1.4PGE2的测定 用STAT—ProstaglandinE2E1AKit,根据试剂盒的操作说明 进行测定培养基上清液中的PGE2浓度.结果以与对照相比 的相对百分比来表示. 2结果 2.1细胞生存率 2.1.1消炎痛,Cyanidin3一glucoside和Malvidin3一glucoside细胞 在分别暴露于2,50tzmol/L的消炎痛中,5,9C’p.g/ml的 Cyanidin3一glucoside中和5,90/~g/ml的Malvidin3一glucoside 中,结 果表明对细胞的生存率都没有影响. 2.1.2蓝莓提取物在蓝莓提取物中含有85%多酚类物质 (HPLC测定结果,本文未显示,具体内容见参考文献),含有 32%的anthocyanins.在暴露l8小时后细胞的生存率均在 90%以上(图1).在高浓度下对于LPS的刺激表现出一定的 保护作用. 一 甜 翟 暴 _O5O10o2004O0 蓝莓提取物(p.mol/L) 口blueberry?blueberry+LPS 图1CRL一26o6细胞在暴露于蓝莓提取物18小时后的生存率 Fig.1ViabilityofCRL?26068fter18hoursexposingtoBlueberry 2.1.3黑醋栗提取物在黑醋栗提取物中含有47%的多酚 类物质,含有l8%的anthocyanins_6,在暴露l8小时后细胞的 生存率均在80%以上(图2).在300/zg/ml剂量下,细胞的生 存率最低,但没有随剂量的增加而进一步降低. 2.1.4Chokeberry提取物Chokeberry提取物含有40%多酚 类物质,其中10%为anthocyanins,当CRL-2606细胞暴露于 300/zg/ml或以上时,细胞的生存率降低(低于60%),且表现出 一 定的剂量一效应关系(图3).可以认为当Chokeberry提取 物高于300p.g/ml时对CRL-2606细胞有毒性.该毒性是由于 在生产过程中加入的物质引起的还是提取物本身引起的,有 待于今后的进一步研究. ?%%如宕g 第5期韩光亮,等.富含anthocyanin的水果提取物对血管内皮细胞产生PGE:的影响研究583 一 静 烛 基 最 O1OO300500700 blackcurrant(gg/m1) 口blackcurrant?blackcurrant+1PS 图2CRL.2606细胞在暴露于黑醋栗提取物l8小时后的生存率 Fig.2ViabilityofCRL-2606afterl8hoursexposingtoBlackcurrant 一 静 烛 基 最 0100300500700 chokeberry(/.tg/m1) 口chokeberry?hokeberry+LPS 图3CRL-2606细胞在暴露于Chokeberry提取物 l8小时后的生存率 Fig.3ViabilityofCRL一26O6after18hoursexposingtoChokeberry 2.2CRL.26O6细胞培养基上清液中的PGE2测量 2.2.1消炎痛消炎痛是已知的COX抑制剂,其Ic,.据报道 为l0ktmol/L.本实验结果表明对CRL-2606的Ic.低于10ktmol/ L,约在l,2mol/L之间(表1).在较高的浓度下却又具有刺 激作用.在LPS刺激组,能抑制PGE的释放量,并表现出剂 量一效应关系.该结果与消炎痛的作用一致. 表1在暴露于消炎痛l8小时后CRL一2606细胞的PC;E2相对产量 Tahie1PGE2producedbyCRL-2606afterl8hours exposingtoindomethacin% 注:(1),(2),(3),(4)表示经过两两比较之后组问的差异情况,若 两组问没有相同的数字则表示两组问的差异有显着性,P<0.05. 2.2.2蓝莓提取物在100ktg/ml浓度时,蓝莓提取物对CRL一 2606细胞具有刺激作用,可在LPS刺激组在同样的浓度下却 表现出了抑制PGE释放的作用(表2). 表2在暴露于蓝莓提取物l8小时后CRL.26O6 细胞的PC;E2相对产量 Table2PGE2producedbyCRL?26O6afterl8hours exposingtoBlueberry% 注:(1)与100/~g/ml组比较,P<0.05 2.2.3黑醋栗提取物对CRL-2606细胞PGE2的释放,黑醋 栗提取物表现出一定的抑制作用趋势,但没有统计学意义(表 3).对处于LPS刺激下的CRL-2606细胞,黑醋栗提取物在 700ktg/ml时具有抑制PGE2释放的作用. 表3在暴露于黑醋栗提取物l8小时后CRL.2606 细胞的PGE2相对产量 Table3PGE2producedbyCRL?2606afterl8hours exposingtoBlaekcurrant% 注:(1)与700/~g/ml组比较,P<0.05 2.2.4Chokeberry提取物700~g/ml的Chokeberry提取物显 示出可以刺激CRL-2606细胞释放PGE,的作用(表4).而对 于处于I刺激下的细胞,500,700ktg/ml的Chokeberry提取 物能抑制PGB的生产和释放. 表4在暴露于Chokeberry提取物l8小时后CRL?26O6 细胞的PGE2相对产量 Table4PGE2producedbyCRL?26O6afterl8hours exposingtoChokeberry% 注:(1),(2),(3),(4)表示经过两两比较之后组问的差异情况,若 两组问没有相同的数字则表示两组问的差异有显着性,P<0.05. 2.2.5Cyanidin3一glucoside和Malvidin3一glucosideCyanidin3一 glucoside对CRL-2606细胞的PGE2释放无明显作用.在实验 所使用的剂量范围内,无论有无LPS的刺激,Malvidin3一 glucoside对于CRL-2606细胞PGE2生产与释放均无明显作用. 3讨论 无论是通过血液传播的传染病,还是系统性用药,血管内 皮细胞都是第一个接触他们的细胞,这些细胞在对于那些外 如????如0如???柏如0 第34卷第5期 5842005年9月 卫生研究 JOURNALOFHYGIENERESEARCH Vo1.34No.5 Sep.2005 文章编号:1000—8020(2005)05—0584—03?论着? 虾仁中氯霉素的同位素稀释技术GC/ITMS.MS测定方法的建立 杨欣周蕊赵云峰吴永宁’ 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所,北京100050 摘要:目的用氯霉素氘代同位素作为内标,建立虾仁中氯霉素的 GC/~MS—MS检测方法.方法样品 中加入同位素内标,用乙酸乙酯提取,正己烷脱脂肪,经SPEC.8柱净 化,SylonBFT(BSTFA—TMCS)衍生后进 样,采用GC/MS—MS,多级反应离子监测(MRM)检测.结果方法的线 性范围为10,500pg,r=0,9958,测定限 为0.3ng/g;0.3,0,5和1.0ng/g加标水平的平均回收率分别为 104%,lll%和95%,相对偏差小于20%. 结论该方法灵敏度高,准确,可靠,满足虾仁中氯霉素的痕量检测需要. 关键词:氯霉素气相色谱一串联质谱虾仁 中图分类号:TS207.5R155.55文献标识码:B Analysisofchloramphenicolinshrimpsbygaschromatography tandemmassspectrometry YangXin,ZhouRui,ZhaoYun—feng,WuYong—ning NationalInstituteofNumtionandFoodSafety,ChineseCenterforDiseaseCo ntrolandPrevention,Beijing100050,China Abstract:ObjecfiveAsensitivemethodbasedonisotopedilutiongaschromat ography~ndemmassspectrometryis describedforthedeterminationoftheantibioticchloramphenicol(Cap)inshri mptissue.MethodsHomogenizedshrimp 来物质的免疫反应中可能发挥作用.动脉血管内皮细胞的 功能失常在动脉粥样硬化斑的形成中是非常重要的j.实验 显示出培养小鼠的脑小血管内皮细胞在有花生四烯酸存在时 就会产生大量的PGE,,并且生长在微孑L滤膜上的内皮细胞既 能从腔面释放也能从基底面释放,然而基底面的释放量是腔 面的释放量的4倍.这种极性释放表明其前列腺素会影响周 围细胞,并产生重要作用,这也许与高血压的发生有关.为了 解水果提取物与慢性心血管疾病之间的关系和正常血管对这 些提取物的作用,作者用人类的正常血管内皮细胞研究了水 果提取物对它们释放PGE2的影响.根据作者以前的研究, quercetin,m州cetin,黑醋栗和蓝莓提取物可以抑制RAW 264.7巨噬细胞的NO释放量,但由于前两者在培养基中的溶 解性较差,作者在本次实验中没有包括它们.而ehokeberry提 取物是近来在市场上出现的产品,并且cyanidin含量较高,作 者估计它们会有较高的质量稳定性,所以将它列入了研究的 对象.根据实验结果,作者认为在其中含有一些对CRL-2606 细胞有害的物质,但具体是何物还不清楚.其他的那些水果 提取物和化学物质都是较为安全的. 消炎痛是一个已知的环氧化酶抑制剂,只是在作者的实 验中其Ic较报告的值为低,而在高的剂量时还表现出了刺 激的作用,这是否与细胞的直接接触有关,还不得而知.在细 基金项目:北京市自然科学基金重点课题(No.7041004) 作者简介:杨欣,女,硕士,助理研究员 1通讯作者 胞处于刺激的情况下,它显示出了抑制PGE2生产,释放的作 用,这与报道的消炎痛的COX抑制功能相一致. Cyanidin3一glucoside,malvidin3一glucoside及chokeberry提取物 没有表现出抑制PGE,释放的作用,有的在一定的浓度下还表 现出刺激的作用.虽然黑醋栗提取物有一定的抑制倾向,但 没有统计学意义,作者还需要进一步的研究来证实.对于处 在LPS刺激之下的CRL-2606细胞,在一定的浓度时均表现有 抑制PGE释放的作用.在这三种水果提取物中均含有 anthocyanin,而后者包括了一大类非常复杂的化合物,在本实 验中,作者虽然排除了Cyanidin3一glucoside,malvidin3一glucoside 的作用,但仍需要进一步的深入研究,来探明到底是哪一种或 哪几种化合物在起作用. 4参考文献 1MazzaG.Healthaspectsofnaturalcolors.Chap.17.InNaturalColors. NewYork:MareelDekker,2000:289.314 2NetzelM,StrassG,JansenM,eta1.Bioaetiveanthocyaninsdetectedin humanurineafteringestionofblaekeurrantjuiee.JEnvironPathol ToxieolOneol,2001,20(2):115.121 3StephanielL.JamesRoleofnitricoxideinparasiticinfections.Mierobiol Rev,1995,59(4):533—547 4PredimanK.Shah.Plaquedisruptionandcoronarythrombosis:new insightintopathogenesisandoreventionclin.Cardiol,1997,20(Supp1. II):38-44 (2004.08.12收稿)