六味地黄汤含药血清对海马神经元突触活动的影响

六味地黄汤含药血清对海马神经元突触活动的影响 六味地黄汤含药血清对海马神经元突触活 动的影响 第9卷第4期 2003年8月 中国实验方剂学杂志 ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae Vo1.9.No.4 Aug.,2003 ? 药理? 六味地黄汤含药血清对海马神经元突触活动的影响 杨胜,刘振伟,周文霞,张永祥(军事医学科学院毒物药物研究所,北京1oo85o) 摘要:目的:研究六味地黄汤益智作用的机理.方法:应用血清药理学和电生理方法,观察六味地黄汤含药血清对原代培 养大鼠海马神经元自发突触活动的影响.结果:含药血清作用48h可明显增加海马神经元自发动作电流(spontaneousactioncur. rent,sAC)和微小兴奋性突触后电流 (miniatureexcitatorypostsynapticcurrent,mEPSC)的产生频率,但并不影响mEPSC的幅度.结 论:六味地黄汤可作用于突触前位点对海马神经元突触活动产生调 节作用,该作用可能是其调节海马神经元的兴奋性进而发 挥益智作用的机制之一. 关键词:六味地黄汤;突触活动;膜片钳;海马 中图分类号:R285.5文献标识码:B文章编 号:1005.9903(2003)04—0022—04 EffectoftheSerumfromLiuweiDihuangDecoction—treatedRats onExcitatorySynapticActivityofmppocampalNeurons YANGSk唱,LlUZhen-wei,ZHOUWen-xia,ZHANGYong-xiang (~ijingInstituteofPharmacologyandToxicology,Beltingmo85o) Abstract:AimToinvestigatethemechanismunderlyingthecognition—enha ncingeffectofLiuweiDihuangdecoction (LW).MethodWhole—cellrecordingtechniquewasusedtoob$ervethespontaneoussynapticactivityofrathippocampal neuronsculturedwitlItheserumfromLW—treatedrats,termedLW—contai ning$elalm(LWCS).ResultsAftertlIehippocam— palneuronsweretreatedwithLWCSfor48h,thefrquencyofspontaneousactioncurrent(sAC)andminiatureexcitatory post—synapticcurrent(mEPSC)weresignificantlyincreased,buttheamplitudeofmEPSCremainedunchanged.Conclusion LWCSenhancedspontaneoussynapticactivityofthehippocampalneuronspossiblybyaffectingthepre—synapticsiteofthe neuronsandthismaycontributetothecognition—enhancingeffectofLW. Keywords:LiuweiDihuangdecoction(LW);synapticactivity;hippocampal ;patchclamp 六味地黄汤(Lw)是中医滋补肾阴的经典代 名方,由熟地,山茱萸,山药,泽泻,牡丹皮及茯苓组 成,用于”滋补肾阴,填补肾精”,主治肝肾阴虚,腰膝 酸软,头晕目眩,耳鸣耳聋,遗精,消渴,盗汗,骨蒸潮 热,小便淋沥等肾阴不足之证.近年来我们从神经 内分泌免疫调节(NIM)网络的角度对LW的药理作 用进行了系统研究,发现Lw具有益智作用….研 究表明,口服给予LW可明显改善快速老化模型小 鼠(SenescenceAcceleratedMouse,SAM)的学习记忆功 能J,对正常及卵巢切除大鼠海马齿状回的诱 发均具有明显增强作用.进一步研究发现,LW 及其活性成分对下丘脑.垂体.肾上腺及性腺轴的平 衡具有调节作用J,对脑内学习记忆功能有关基因 的表达具有调节作用J.聂伟等应用血清药理学方 收稿日期:2003-01.14 基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(G1999054401). ? 22? 法观察了LW含药血清(Lw—containingserum,Lwcs) 对大鼠原代培养海马神经元存活的影响,结果表明, LWCS可提高神经元的存活].以上结果提示,LW 的益智作用是通过多途径,多环节而实现的,其中易 化海马的突出传递过程是重要环节之一.本研究应 用血清药理学和电生理方法,观察LWCS对原代培 养大鼠海马神经元自发突触活动的影响. 1材料与方法 1.1药物六味地黄汤沥剂由本所植化室协助制 备,方中熟地,山茱萸,山药,泽泻,牡丹皮和茯苓按 8:4:4:3:3:3的比例混合,加入6倍量蒸馏水煎煮3h 取煎液,药渣同法再煎煮一次,过滤,与第一次煎煮 滤液混合,减压浓缩至浓度为lg(生药)/na,灭菌后 4?保存备用. 1.2含药血清制备取Wistar大鼠(200,250g)随 机分为对照组和LW给药组,每组6只.给药组口 服给予LW10s/kg,每日1次,连续3d,对照组口服给 第9卷第4期 2003年8月 中国实验方剂学杂志 ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae Vo1.9.No.4 Aug.,2003 予等容积生理盐水.于末次给药后1h股动脉取血, 离心分离血清,56?孵温30min,真空冷冻干燥,然后 用等体积DMEM溶解,过滤除菌,一30~C保存备用. 1.3新生大鼠海马神经元培养出生24h内的 Wistar大鼠冷冻麻醉后,无菌条件下分离海马并投 入冰冷0.01MPBS(含10mM葡萄糖)中,剪碎后用 0.125%胰蛋白酶(Gibco,USA)于37?消化20min,然 后用小牛血清终止反应.用无血清DMEM洗涤神经 细胞后重新悬浮于DMEM培养基(含2ram谷氨酰 胺,25raM葡萄糖,10%胎牛血清和10%马血清)中, 计数后调整细胞浓度.将细胞悬液(30万/m1)加入 预先用50t,g/na多聚赖氨酸(sigma,USA)包被的 35ram培养板中,于37?,饱和湿度,5%CO.95%空 气条件下培养,24h后进行首次换液(DMEM培养液 中含10%胎牛血清),然后每周换液2次.于培养第 4d时加入3trII阿糖胞苷作用48h,以抑制胶质细 胞等非神经元的生长,培养至89d时分别换为对 照正常血清和含药血清,使血清终浓度为10%,继 续培养48h后进行全细胞膜片钳. 1.4全细胞膜片钳记录将培养细胞的饲养液 换为1.5ml细胞外液,其组成(mmol/L)为NaCI140, KC15,CaCI22,MgCl21,HEPES10,Glucose10,用 NaOH将pH值调至7.2—7.4.应用微电极拉制仪 (Pc.10,NarishigeCo.,日本),采用2步法将玻璃管拉 制成尖端开口约2ttm的微电极,经抛光仪(MF.830 型,NarishigeCo.日本)进行抛光处理,使充满电极内 液时玻璃微电极的电极电阻约35MQ.电极内液 的组成(mmol/L)为KC1140,HEPES10,EGTA10, Na2A11P2,调pH为7.2—7.4.在倒置相差显微镜 下,通过微操纵仪将充满电极内液的记录电极轻轻 压向细胞表面,并通过示波器监测电极电阻的变化. 当记录电极一接触到细胞膜表面时,由于电极电阻 的突然增加,此时观察到由刺激器输出到示波器上 显示的封接测试脉冲所代表的电流值下降.然后再 使电极稍稍下降,并迅速通过记录电极内部施加10 — 30cmH2O负压,使电极和细胞表面形成紧密封 接,通常在25Gll左右.在此基础上继续施加负 压或用1.5V5—20ms的短时脉冲击破细胞膜,即形 成全细胞记录,其特征是在示波器上观察到来自整 个细胞膜的跨膜电容电流.全细胞记录状态通常可 维持数分钟到数十分钟. 实验用的膜片钳放大器是Axoelamp2B,(Axon Instrument,美国).采样频率是1KHz.数据采集和 处理数据用的pClamp8.0软件包(AxonInstrument,美 国). 1.5统计学处理所有实验数据均以均数4-标准 差(S)表示,两组间均数的比较采用t检验进行. 2结果 2.1突触活动的基本特点在体外培养7d后,海 马神经元之间由突起形成许多联系通路,表现出较 活跃的突触活动.在本实验条件下,记录到的海马 神经元自发突触活动以兴奋性为主,包含了如下三 个部分:微小兴奋性突触后电流(miniatureexcitatory postsynapticcurrent,mEPSC),自发兴奋性突触后电流 (spontaneousexcitatorypostsynapticcurrent,sEPSC)和 自发动作电流(spontaneousactioncurrent,sAC),另有 少量神经元表现有串放电(burstfiring)现象.mEPSC 幅度很低,是由突触前神经元末梢囊泡中递质释放 所引起的突触后膜反应,通常情况下,其频率增高反 映单位时间内谷氨酸递质随机量子释放的数目增 加,它不受11[.)【的影响;sEPSC是突触前膜由自发动 作电位诱发的递质释放作用于突触后神经元而引起 的突触后膜反应;sAC是神经元自发的动作电流,相 当于电流钳时的动作电位(actionpotential,AP).当 由突触前膜自发动作电位所诱发的递质量子释放量 增大,达到动作电流的阈值时,则突触后膜在sEPSC 的基础上引起神经元兴奋,产生sAC. 2.2增大sAC频率本实验所记录的sAC的幅度 和半数复极时间等参数与文献报道基本一致. LWSC作用48h后,sAC的频率由0.8?0.1Hz增加到 1.6?0.6Hz(P<0.05,n=10),但幅度无明显变化, 对照组与给药组分别为一1833?192和一1792?152, pA(P>0.3,n=10).(图1) 2.3增大mEPSC频率应用Trx(o.5/.tM)阻断sAC 和sEPSC后,可记录到mEPSC.LWSC作用48h后, mEPSC的频率从5.2?0.5Hz增加到6.5?0.7Hz(P <0.05,n=10),其幅度无明显变化,对照组与给药 组pA分别为35.2?16.5和40.0?16.6(P>0.2,n :10).(图2) 3讨论 神经系统活动的特点是能在由神经元及其突起 组成的各级神经环路中进行快速而准确的信息传 输,因此,突触活动是完成各种信息传递的基础.在 体外培养条件下,突触活动的出现是神经元之间形 成功能性突触联系的标志.本实验条件下所记录到 的突触活动主要是由谷氨酸所介导的兴奋性突触活 ? 23? 第9卷第4期 2003年8月 中国实验方剂学杂志 ChineseJoumalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae Vo1.9.No.4 Aug.,2003 A B C 对照组 圈1LWCS对大?海马神经元 自发动作电流的影响 A:对照血清处理组的海马神经元动作电流 图例;B:LWCS处理组的海马神经元动作电 流图例;c:自发动作电流频率比较;与对照 组相比,P<0.05,n=10. 动,应用CNQX(1OmM)可阻断绝大多数的突触活动, 表明AMPA受体亚型介导了所记录到的突触活动, 这种突触活动对于神经系统的生长发育过程是十分 重要的.在神经元兴奋的过程中,神经元之间的突 触更加稳定和成熟,并可激活胞内信号传导途径,启 动一系列细胞生理过程如诱导神经营养因子的分泌 等,进一步促进突起的生长和分枝,形成更多的突触 联系等. 本研究应用血清药理学的方法,观察了LWCS 对大鼠原代培养海马神经元突触活动的影响,发现 LWCS能明显增加神经元的sAC发放频率,但不影 响其时程和幅度.神经元突触活动的改变可由多种 原因所引起,如突触前量子释放频率改变,突触后受 体数量或反应性改变等.在含药血清的作用下,海 马神经元mEPSC的产生频率明显增加,但幅度无明 显变化.LWCS的这一作用特点与一些神经营养因 子的作用具有类似之处.McLean等应用原代培养 海马神经元研究了BDNF的作用,发现BDNF使AM一 ? 24? A B C D 霄 士 静 鬟 60 乏40 e 世 馨 20 0 对照组 J对照组 田2LWCS对大?海马神经元mEPSC的影响 A:对照血清处理组的海马神经元mEPSC图例;B:LWCS处 理组的海马神经元mEPSC图例;C:mEPSC频率比较;D: mEPSC幅度比较.与对照组相比,P<0.05,n=10. PA受体所介导的mEPSP幅度明显增加,增强突触的 兴奋性传递过程,导致sAP的发放频率增加.u 等也观察到BDNF可使sEPSC的频率增加1倍, mEPSC的频率增加2倍,而对其幅度无明显影 响?.目前认为,mEPSC频率改变而幅度不变的现 象是由突触前量子释放的频率变化所造成的,LWCS 的作用与BDNF相似,可能也作用于突触前膜,使囊 泡的量子释放增加.因而有理由认为,含药血清中 所含的活性物质作用于神经元的突触前,通过促进 谷氨酸的量子释放而增强兴奋性突触活动,这一作 用可能是LW易化海马的突触传递过程,发挥益智 作用的重要机制之一,进一步的研究正在进行当中. 1???2?O .一zH一*爨 第9卷第4期 2003年8月 中国实验方剂学杂志 ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae Vo1.9.No.4 Aug.,2003 参考文献: 张永祥.六味地黄汤现代药理学及化学的初步研究 [J].基础医学与临床,2000,2o(5):15.19. 周建政,张永祥,周金黄.六味地黄汤对快速老化模型 小鼠(SAM)学习记忆能力的改善作用[J].中国实验方 剂学杂志,1999,5(4):29.33. ZHOUJian.Zheng,ZHANGYong-Xiang,LIUChuan-Gui,et a1.Inhibitoryeffectofcotticosteroneontheformationoflong- termpotentiationinrathippocampaldentategyr~s[J].Chinese JournalofPharmacolossandToxicology.1999,13(4):241— 244. 聂伟,张永祥,周金黄.雌激素对卵巢切除大鼠海马长 时程增强的影响[J].中国神经科学杂志,2001,17(4): 335.337. 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