肛门生殖器区肿瘤组织中HPV的快速检测和分型

肛门生殖器区肿瘤组织中HPV的快速检测和分型 肛门生殖器区肿瘤组织中 HPV 的快速检测和分型 徐钤 ,齐凤菊 ,黄扬中 ()第一军医大学生化教研室 ,广州市 510515 ( ) 摘要 : 迄今已发现的人乳头瘤病毒 HPV型已超过 77 型 ,其中至少有 30 个型与泌尿生殖道肿瘤有关 。所以 HPV 的检测与分型对于泌尿生殖道肿瘤的病因和预后将是非常重要的 。HPV 有 很大的异质性 ,故用常规的诊断技术来测定未知标本中的 HPV 基因型有一定困难 。为此 ,我们应 ( ) 用了反向点杂交法 RDB来检测 HPV 分型 。即用 7 种序列特异性寡核苷酸探针分别对应 7 型 ( ) HPV HPV6B 、11 、16 、18 、31 、33 、35,这些探针被合成后依次固定在一条尼龙膜上形成 7 个点 ,再 与样品 DNA 序列的 PCR 产物进行杂交 。结果 7 型 HPV 中任一型阳性都可以在一条尼龙膜上鉴 ( ) 别出来 。我们收集来自广州各大医院的标本 ,共计 177 例 除 20 例食道癌标本来自河南省外,用 () 86 . 76 %; RDB 来检测 HPV 和分型 。结果如下 :子宫颈癌 86 例 ,其中鳞癌 68 例 , HPV 阳性 59 例 () ( ) 腺癌 18 例 , HPV 阳性 8 例 44 . 44 %;尖锐湿疣 42 例 , HPV 阳性 39 例 92 . 86 %; 慢性宫颈炎 29 () () 例 , HPV 阳性 1 例 3 . 45 %;食道癌 20 例 , HPV 阳性 7 例 35 . 00 %。 关键词 :反向点杂交法 ;人乳头瘤病毒 ;宫颈癌 () 中图分类号 : R373文献标识码 :A文章编号 :1000 - 8721 199904 - 0348 - 06 ( ) ( 人乳头瘤病毒 HPV 是已证明的 DNA 肿瘤病毒之一 , 属乳多空泡病毒科 Papovaviri2 ( ) ) dae。据报道 , HPV DNA 已在 80 %以上的妇女肛 - 生殖区 anogenital regio n的良性和恶性 肿瘤中检测到 。迄今已发现的 HPV 的基因型已超过 77 型 ,其中至少有 30 个型与人泌尿生殖 1 ( ) 道肿瘤有关。目前已证明某些型 HPV 最多见的是 HPV16 和 18可引发子宫颈鳞状细胞2( ) 癌,故 HPV16 和 18 被称为高危病毒 high - risk virus,而 HPV6 和 11 则被称为低危病毒 () ( ) ( ) low - risk virus,常见于尖锐湿疣和轻度宫颈上皮内肿瘤 C IN中 。尖锐湿疣 CA是最常见 3 的病毒性性传播性疾病之一 。它对治疗很顽固 ,极易复发 。据国内报道,局部腐蚀治疗后 , 本病的复发率是 7 %,30 % 。HPV31 、33 、35 也与癌形成有关 ,但发病率较低 。因此我们选择 4 () 了这 7 个型 HPV 6B 、11 、16 、18 、31 、33 和 35,对临床标本进行了检测。 所以 HPV 的检测和分型对于肛 - 生殖区肿瘤的病因和预后将是非常重要的 。然而 ,由 于 HPV 有很大的异质性 ,故用常用的诊断技术来测定肿瘤组织标本中的 HPV 的基因型尚有 一定困难 ,因为只有将 HPV 常见基因型逐个筛选一遍 ,才能最后确定感染的病毒基因型 。因 ( ) 此 ,在检测技术上费时 ,费钱 ,费力 。为此我们改用反向点杂交法 RDB来检测 HPV 和分型 , 获得了较好的结果 。 收稿日期 :1998 - 11 - 17 ,修回日期 :1999 - 06 - 25 ( ) ( ) 作者简介 :徐钤 1924 - ,男 ,原上海圣约翰大学医学院毕业 医学博士。现为广州第一军医大学生物化学教研室教 ( ) 授 ,近十余年来致力于人乳头瘤病毒 HPV的分子生物学研究 。 材料与方法 5 ( 1 肿瘤组织中 HPV DNA 的扩增和探针的制备 按我们以前的方法扩增样品 新鲜肿瘤组织和石蜡包埋) 组织DNA 。简述如下 :由中国科学院上海生物化学研究所合成 3 种 PCR 引物 GP3 、GP4 和 GP5 ,其核苷酸顺 序如下 : GP3 :5’ - GC T GT TA GGCACA TA T T T T - 3’ ; GP4 : 5’ - A GGTACA TA T T GCCC T GC - 3’ ; GP5 : 5’ - AC2 C GT T T TC GGTA GTACC GT T T TC GT T - 3’。 GP5 是 7 个型 HPV DNA 的共用引物 ,其 5’端用生物素标记 。如用 GP5 和 GP4 一对引物可扩增 HPV6B和 11 两型的 DNA 片段 ;用 GP5 和 GP3 一对引物则可扩增 HPV16 、18 、31 、33 和 35 的 DNA 片段 。PCR 的参 数为 94 ?50 秒 ,55 ?50 秒 ,72 ?50 秒 ;共 30 个循环 ,最后一次 72 ?延长至 3 分钟 。7 条探针的序列亦由上海 () 生化所合成 1。 ( ) ( ) 2 反 向 点 杂 交 Reverse dot blot , RDB法 将表 1 对应于 7 型 HPV DNA 的 7 条探针 SSO的序列 ( ) 7 sequence specific oligo nucleotide SSO p robes Table 1 已合成的 7 种探针通过碳二亚胺的介 导 , 固 定 specifically against 7 types of HPV DNA 在尼龙膜条上 ,形成 7 个点 ,然后与经 PCR 扩增 的 标 本 中 HPV DNA 片 段 进 行 杂 交 。膜 条 与 HPV 型别探针序列 Type of HPV Nucleotide sequence of t he p ro be PCR 扩增产物一同浸入 2 ×SSC 液中 , 100 ?水 HPV6B 5’ - TA T GCAC T GTA GCCAAC TC - 3’ 浴变性 10 分 钟 , 立 即 放 入 52 ?水 浴 中 振 摇 30 HPV11 5’ - CACAA TACCCCACCAAA T GA G - 3’ 分钟 ,完成杂交 。然后将膜条 经 洗 涤 后 转 入 链HPV16 5’ - C T GT GTAAA GGT TA GTCA TAC - 3’ 霉素抗 生 物 素 蛋 白 辣 根 过 氧 化 物 酶 溶 液 中 浸 HPV18 5’ - T T T GTACAAC TAC T T TCA T GC - 3’ HPV31 5’ - TA GA T TA TC TA TA TCC T T G - 3’ (泡 ,最 后 用 TMB 显 色 。杂 交 用 的 尼 龙 膜 Bio2 HPV33 5’ - CCA GGT GT GGAC TAACC G - 3’ ) dyne C购自美国 Pall Biosupport 公司 。 HPV35 5’ - CACCACCC TACACA TCC T - 3’ 结果 1 聚丙烯酰胺凝胶电泳 样品从广州市各大医院采集 。将上述 7 种质粒和标本的 PCR 扩增产物在 8 %聚丙烯酰胺 () 凝胶上电泳 图 1,可见这些产物的片段长度与预计的相符合 。 图 1 HPV DNA 经 PCR 扩增片段的 8 %聚丙烯酰 胺凝胶电泳图( ) ( ) 1 . HPV6B 质粒 335bp;2 . 尖锐湿疣患者 HPV6B + ; 3 . ( ) ( ) HPV11 质粒 311bp ; 4 . 尖 锐 湿 疣 患 者 HPV11 + ; 5 . ( ) DNA 分子量 图左侧数字为其各带的数; 6 . HPV18 ( ) ( ) 质粒 246bp;7 . 子宫颈癌患者 HPV18 + ; 8 . HPV16 质 ( ) ( ) 粒 267bp;9 . 子宫颈癌患者 HPV16 + 。 Figure 1 8 % SDS - PA GE of t he PCR p roduct s of HPV DNAs ( ) 1 . HPV 6B plasmid 335bp ; 2 . Patient wit h co ndylo ma ( ) ( ) acuminat um HPV 6B + ; 3 . HPV 11 plasmid 311bp; 4 . ( ) Patient wit h co ndylo ma acuminat um HPV11 + ; 5 . DNA (mar ker at t he lef t side of t he Figure is t he lengt h of DNA in ) ( ) bp; 6 . HPV 18 plasmid 246bp ; 7 . Patient wit h cervical ( ) ( ) carcino ma HPV 18 + ; 8 . HPV 16 plasmid 267bp ; 9 . ( ) Patient wit h cervical carcino ma HPV 16 + . 2 RDB 法的敏感性 分别以不同浓度的 HPV16 质粒 DNA 及阳性标本为模板 ,进行 PCR - RDB 法检测 ,实验 ( 显示 ,只要有 1f g 质粒 DNA 或 5p g 的 HPV 阳性细胞 DNA 存在即可呈现阳性结果 清晰的蓝 3 ) μ 紫色斑点。在实际操作时一般仅取新鲜肿瘤组织 1,2 mm,或用 5m 厚石蜡切片一张即可 。 标本经 PCR 扩增后进行 RDB 检测 ,获得了满意的结果 。图 2 为其中 7 例患者的检测结果 。 图 2 用 PCR - RDB 法检测肛门生殖 器区肿瘤患者 HPV 感染 ( ) 1 . 尖锐湿疣患者 6 HPV6 + ; 2 . 尖 锐 湿 疣( ) ( ) 患者 1 HPV11 + ; 3 . 32 宫 颈 癌 患 者 ( ) HPV16 + ;4 . 宫颈癌患者 12HPV18 + ; 5 . ( ) 阴性对 照 ; 6 . 尖 锐 湿 疣 患 者 17 HPV6 和( ) 11 + ;7 . 宫颈癌患者 15 HPV16 和 18 + 。 注 :括号内为样品号 。 Figure 2 Detectio n of HPV infectio n in patient s wit h ano - genital t umors by PCR - RDB 1 . Patient wit h co ndylo ma acuminat um ( ) Sample no . 6 HPV6 + ; 2 . Patient wit h ( ) co ndylo ma acuminat um Sample no . 1 HPV11 + ; 3 . Patient wit h cervical carcino ma ( ) Sample no . 32HPV16 + ; 4 . Patient wit h ( ) cervical carcino ma Sample no . 12 HPV18 + ; 5 . Negative co nt rol ; 6 . Patient wit h ( ) co ndylo ma acuminat un Sample no . 17 HPV6 + , HPV11 + ; 7 . Patient wit h cervi2 ( ) cal carcino ma Sample no . 15 HPV16 + , HPV18 + . 表 2 广州市肛门生殖器区肿瘤组织中 HPV 基因型的检测结果 Table 2 Genot ypes of HPV detected in ano - genital t umors f ro m patient s in Guangzhou cit y 33 ( ) ( ) HPV + HPV - Po sitive阳性 临床诊断样品样品数HPV 型别 Clinical diagno sis Sample Sample No . HPV genot ype Cases % Cases % Cases % 1 . 子宫颈癌 Cervical carcino ma 鳞癌 58 51 87 . 93 7 12 . 07 16 41 70 . 69 石蜡包埋Squamous carcino maParaffin - embedded 18 7 12 . 07 16/ 18 3 5 . 71 16 6 60 . 00 10 8 80 . 00 2 20 . 00 新鲜组织Fresh tissue 18 2 20 . 00 石蜡包埋 18 8 44 . 44 10 55 . 56 16 3 16 . 67 腺癌Paraffin - embedded Adenocarcino ma 18 5 27 . 78 新鲜组织 2 . 尖锐湿疣 8 40 . 00 20 19 95 . 00 15 . 00 6B Fresh tissue Co ndylo ma acuminat um 11 9 45 . 00 6B/ 11 2 10 . 00 6B 9 40 . 95 22 20 90 . 91 2 9 . 09 宫颈涂片 Cervical smear 11 11 50 . 00 3 . 45 11 1 29 1 3 . 45 28 96 . 56 3 . 慢性宫颈炎 Chro nic cervicitis 4 . 食道癌 35 . 00 20 7 35 . 00 13 65 . 00 16 7 Esop hageal carcino ma ( ) ( ) 3 + 阳性 Po sitive , - 阴性 Negative . 3 临床标本检测和分型 我们收集来自广州市各大医院的标本 157 例和河南省食管癌标本20 例 ,用 RDB 检测 HPV 和分型 ,结果列入表 2 。157 例中子宫颈癌 86 例 ,其中鳞癌 68 例 , () ( ) HPV 阳性 59 例 86 . 76 %;腺癌 18 例 , HPV 阳性 8 例 44 . 44 %;尖锐湿疣 42 例 ,阳性 39 例 () () () 92 . 86 %;慢性宫颈炎 29 例 ,阳性 1 例 3 . 45 %;食道癌 20 例 ,阳性 7 例 35 . 0 %。 讨论 6 我们将 Saiki 等首先提出的 RDB 技术应用在 HPV 不同型别的鉴别和检测上 。RDB 技术的主要特点是多种探针固定在一条尼龙膜上同时参与检测样品 DNA 而又互不干扰 ,能一 次性筛查多种不同的序列 。RDB 方法简便 ,特异性好 ,应用于临床诊断 ,结合快速提取 DNA 技术 ,6 小时之内即可得到结果 。对肛 - 生殖区 HPV 感染进行准确分型是很重要的 ,因为特 别是一些常见的 HPV 感染子宫颈区可以有不同的致病能力 ,因此受到医学界的重视 。 我们 ( ) 测定了共 68 例子宫颈鳞癌 ,结果有 59 例 86 . 8 %为 HPV 阳性 ,这与国内外其他学 者检测的结果相符 。例如 ,伍欣星等用 GP - PCR 法快速检测子宫颈癌样品 55 例 , HPV 阳性 () 占 85 . 3 % 47/ 55,与我们相差不大 ,但伍氏未能分型 。然而我们在 18 例子宫颈腺癌中仅发 () 现有 8 例 44 . 6 %HPV 阳性 ,而且仅 3 例为 HPV16 阳性 。国外研究者亦多发现子宫颈腺癌 8 的 HPV 感染阳性率不高 。例如 L eminen 等用原位杂交法在 106 例子宫颈腺癌中仅有 18 % 9 ) (为 HPV 阳性 。但 1995 年 Duggan 等检测 77 例腺癌 , HPV 阳性者高达 70 % 53 例,检出有 HPV16 、18 和 33 三型 ,而仍以 16 型最多 。Duggan 认为在此之前检出 HPV 阳性率偏低可能 是因为未用 PCR 技术 ,不够灵敏之故 。我们的检出率为 44 % ,且以 HPV18 居多 ,有异于 Dug2 gan 。 用 RDB 法检测 HPV DNA 及其基因型主要的优点在于能一次性筛查多种不同的 DNA 序 10 列 ,而其灵敏度与准确性并不亚于其 他 常 用 方 法 。例 如 , 刘 元 林 等用 PCR 法 检 测 HPV DNA ,再用正向杂交法分型 。结果子宫颈鳞癌检出阳性率为 90 % ,生殖器疣为 95 % 。陈乐真 11 等 用原位杂交法和 PCR 法检测尖锐湿疣组织的 HPV DNA ,仅作 HPV - 6B 和 11 两型 , 12 PCR 法阳性率为 83 . 9 % ,似较低些 。赖晃文等以 HPV - 6B 、11 、16 、18 四型的 DNA 为探针13 进行斑点杂交 , 检 测 尖 锐 湿 疣 患 者 皮 损 , 总 检 出 率 为 87 . 5 % 。陈 嵩 等用 巢 式 PCR 检 测 HPV DNA ,再根据 Rsa ?酶切扩增片段的电泳图谱来分型 ,避免了分子杂交 。结果 35 例子宫 颈癌的阳性检出率为 85 . 75 % ,尖锐湿疣为 96 % 。由上述结果可见 ,用 PCR 法扩增 HPV DNA (特异片段后 ,再加用其他手段进行分型检测 例如 : 正向斑点杂交 、原位杂交 、限制性核酸内切 ) 酶酶切 、巢式 PCR 、等均可得到可信的结果 。对此 ,1992 年 11 月中华皮肤科杂志编辑部曾在 14 广州召开了尖锐湿疣专座谈会。会议认为 , PCR 技术为 HPV 感染提供了一种快速 、敏 感 、特异的方法 。而分子杂交检测法是目前检测 HPV 感染的一种敏感性和特异性很高的技 术 。但是会议又认为 :分子杂交法比较繁琐 ,价格又贵 ,而且需要一定的设备和条件 ,目前尚不 15 能在基层推广应用 。中国医学科学院肿瘤研究所李洁等在一项设计严密的大范围研究中 , 用经典的 So ut her n 印迹杂交法在全国 14 个省 、市 、自治区内共检测 815 例子宫颈癌 , HPV 总 检出率为 53 . 5 % ,其中 HPV - 16 的检出率最高 , 但亦仅为 31 . 9 % ; 而 209 例子宫颈湿疣的 HPV 总检出率为 40 . 8 % ,其中 HPV - 6/ 11 型最高 ,达 33 . 5 % 。他们的结果显然比上述学者 和本文的结果低得多 。我们认为 ,这是由于 So ut her n 印迹杂交法不够灵敏之故 。该文作者也 承认 ,如果采用敏感的 PCR 法 ,子宫颈癌组织中 HPV 检出率可达 90 % 。 我们还收集了 29 份所谓“慢性宫颈炎”的样品 ,以便与肿瘤相比较 。从我们的资料发现 , 慢性宫颈炎 中 HPV 感 染 的 发 病 率 是 很 低 的 。在 我 们 的 系 列 中 仅 为 3 . 45 % 。然 而 陈 伟 丽16 等 报道 ,在她们的系列中发病率可高达 58 . 6 %,81 . 8 % ,几乎与子宫颈癌患者中的一样 。 我们的整个样品系列是由有经验的病理学家诊断的 ,我们不能解释两者差异的原因 。根据国17 外资料 ,慢性子宫颈炎中 HPV 的感染率亦不一致 。例如 ,Ahn 等 ,13 例慢性子宫颈炎 18 () 中 ,有 9 例 HPV 阳性 69 %。而 Nind1 等报告应用巢式 PCR 法检测宫颈上皮有轻度改变 16 () 包括上皮化生 、子宫颈炎等的患者 HPV 阳性率约为 8 %,15 % 。陈伟丽等的报告中 ,均 为有 ?度, ?度子宫颈糜烂的慢性子宫颈炎患者 ,故可能因此而感染率较高 。 () 我们又收集了从中国北方 河南省来的 20 例食道癌作为比较 ,发现 HPV 发病率要低很 19 多 ,仅为 35 % ,虽然感染的 HPV 也是高危型的 HPV16 。日本学者 Mat sukura 等认为 ,下生 殖道 HPV 感染极为复杂 ,异质性很大 。他在 235 例子宫颈活检标本中检出的 HPV 共有 24 ) ( 型 ;仅在 C IN ?级至 ?级中检测到的 HPV 即有 17 型 。但他指出 , HPV6 和 11 型仅见于尖 锐湿疣中 ,存在于其他病灶中者极少 。这点与国内所见相符 。 参 考 文 献 1 Bergero n C , Barresso R , Beaudeno n S , et al . 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However , HPV has great heterogeneit y , so t he detectio n of HPV t ype in an unknow n specimen wit h ro utine diagno stic techniques wo uld be so mew hat difficult . Hence we used t he re2 ( ) verse dot blot RDBtechnique to detect and genpot ype t he infecting HPV s. Seven sequence - ( specific oligo nucleotide p ro bes , co rrespo nding respectively to 7 t ypes of HPV HPV6B , 11 , 16 , ) 18 ,31 ,33 , ,and 35were used. Af ter t he synt hesis of t hese 7 types of p ro bes , t hey were fixed successively in o rder o n a st rip of nylo n membrane to fo r m 7 spot s , t hen t hey were hybridized wit h t he PCR p ro duct s of t he specimen DNA sequences. The result is t hat any o ne of t he 7 t ypes of HPV DNA , if po sitive , can be identified o n o ne nylo n st rip . We collected 177 specimens f ro m ( t he ho spitals in Guangzho u excep t t hat 20 cases of esop hageal carcino ma were f ro m Henan ) Province. RDB technique was used to detect and genot ype t he infecting HPV s and t he result s were as follow s : U terine cervical carcino ma 86 cases , including 68 squamo us carcino mas and 18 ( ) ( adenocarcino mas , t he HPV po sitive numbers were 59/ 68 86 . 76 %of t he fo r mer 47 fo r t ype ) ( ) ( 16 , 9 fo r t ype 18 , 3 fo r t ype 16 , 18 mixed infectio nand 8/ 18 44 . 44 %of t he lat ter 5 fo r ) () t ype 18 , 3 fo r t ype 16; co ndylo ma acuminat um 42 cases wit h 39 HPV po sitive o nes 92 . 86 %of w hich 17 were t ype 6B , 20 of t ype 11 and 2 of mixed infectio n of types 6B and 11 ;chro nic cer2 () vicitis 29 cases , wit h o nly o ne HPV po sitive 3 . 45 %; and finally esop hageal carcino ma 20 cas2 () es , wit h 7 HPV po sitive o nes 35 . 00 %. Key words : Reverse dot blot ; Human papillo mavirus ; Cervical carcino ma