【WORD可复制编辑】体外培养的嗅鞘细胞能够促进骨髓间充质干细胞分化

【WORD可复制编辑】体外培养的嗅鞘细胞能够促进骨髓间充质干细胞分化 体外培养的嗅鞘细胞能够促进骨髓间充质干细胞分化 1 为神经元样细胞? 张燕青，曾园山 ，张 静 ,丁英 ，闫 清 ，陈穗君 中山大学中山医学院组织胚胎学教研室神经科学研究室～广州,510080, 摘要 目的 探讨体外培养的嗅鞘细胞(OECs)对骨髓间充质干细胞(MSCs) 分化的影响。方法 实验分为OECs+MSCs共培养组和MSCs单独培养组,在7d和 14d两时间点观察MSCs的分化情况。用p75抗体免疫细胞化学染色鉴定OECs细胞 的纯度;用巢蛋白(nestin)、神经丝蛋白(NF)、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质原纤 维酸性蛋白(GFAP)、突触后膜致密区蛋白(PSD)等抗体免疫细胞化学染色鉴定 已分化的细胞表型。结果 体外培养的MSCs经OECs诱导后分化为神经元样细胞, 这些细胞能够表达NF、MAP2和PSD等神经元标记物,而不表达星形胶质细胞标 记物GFAP。在培养7d,MSCs+OECs 7d组的MSCs分化为神经元样细胞的百分率 与MSCs 7d组比较有明显增高。在培养14d,MSCs+OECs 14d组的MSCs分化为神 经元样细胞的百分率与MSCs 14d组比较,也有明显增高。结论 体外培养的嗅鞘 细胞能够促进骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。 关键词 骨髓间充质干细胞;嗅鞘细胞;细胞共培养;细胞分化;神经元样 细胞 Olfactory ensheathing cells may promote the differentiation of neuron-like cells from bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ? CHEN Suijun (Division of Neuroscience, Department of Histology and Embryology, Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China) Objective To investigate the effects of olfactory ensheathing cells (OECs) Abstract cultured on differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs). ?教育部博士学科点专项科研基金(编号:2004558068)资助 ?通信作者(zengysh@mail.sysu.edu.cn) 1 ZHANG Yanqing，ZENG Yuanshan ，ZHANG Jing，DING Ying，YAN Qing， and Methods The cells were divided into two groups: MSCs cultured solely(MSCs) MSCs co-cultured with OECs group(MSCs+ OECs). The purity of OECs was identified by p75 immunocytochemistry staining on the 7th day. Meanwhile, the phenotype of differentiated cells was identified by immunocytochemistry staining for nestin, NF, MAP2, GFAP and PSD, respectively. Results After co-culture,OECs induced MSCs to differentiate into neuron-like cells. The neuron-like cells showed nestin, NF200, MAP2 and PSD immunopositive staining, while GFAP immunonegative staining. On the 7th and 14th day, the percentage of the neuron-like cells in MSCs+ OECs group was all much higher than MSCs group. Conclusion OECs may promote the differentiation of neuron-like cells from bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Bone marrow mesenchymal stem cells;Olfactory ensheathing Key words cells;Co-cultured cells;Cell differentiation;Neuron-like cells 骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是具有自我增殖、多向分 化潜能的细胞,在一定条件下能诱导为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经元 等[1-4]。其中诱导MSCs向神经元分化是近年来成体干细胞的研究热点之一。自体 MSCs容易获取，且分离和培养方法相对成熟。应用其治疗神经系统疾病,不存在 伦理学和免疫排斥等问,这为治疗神经系统疾病提供了新的治疗策略。但是,存 在MSCs向神经元分化比例较少的问题。嗅鞘细胞(olfactory esheathing cell, OECs) 是存在于嗅觉系统的一种特殊类型的神经胶质细胞。许多研究表明,OECs能分泌 多种神经营养因子,促进神经干细胞向神经元分化[5]。本研究采用OECs和MSCs 联合培养的方法,探讨OECs能否具有促进MSCs向神经元样细胞分化的作用,为 OECs联合MSCs移植修复中枢神经损伤提供实验依据。 1 材料与方法 1.1主要材料和试剂 1,2d新生SD乳鼠(由中山大学实验动物中心提供)。DMEM/F12和L-DMEM 均购自Gibco公司。胎牛血清购自中国医学科学院生物工程研究所。小鼠抗 MAP2、小鼠抗NF200、兔抗nestin和兔抗GFAP等抗体均购自Sigma公司。兔抗p75 2 TFITC标记的山羊抗小鼠IgG和TFITC标记的山羊 抗体、生物素化山羊抗兔IgG、 抗兔IgG均购自博士德公司。 1.2嗅鞘细胞的培养和纯度鉴定 1.2.1 嗅鞘细胞的培养 选用1,2d新生SD乳鼠6只,消毒后在无菌条件下断头,取 两侧嗅球及嗅神经,置于无钙镁的D-Hank液中,在解剖显微镜下仔细去除嗅球表 面的毛细血管和软脑膜。将位于嗅球最外层的嗅神经层的嗅小球层以及少量连接 的嗅神经轻轻剥下,用Hank液冲洗两遍,剪碎置于离心管内，离心(1000r/min, 5min)，去上清。用0.25%的胰蛋白酶消化组织碎块(37?，15min),加入含10%胎 牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，离心(1000r/min，5min)，去上清。再加入 10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，用巴氏吸管吹打均匀成细胞悬液，将细胞接 种到铺有多聚赖氨酸的培养瓶中，放入在37?、5%CO2培养箱中培养，6h后将 未贴壁的细胞依入移入另一未铺有多聚赖氨酸的培养瓶中，再6h后换到铺有多聚 赖氨酸的培养瓶中。此后，2-3d半量换液，1周后做细胞鉴定和应用细胞。 1.2.2 免疫组织化学与荧光免疫组织化学鉴定 将培养7d的OECs用4%多聚甲醛 固定30min,0.01mol/L PBS冲洗3次，加10%山羊血清封闭15min后，用p75抗体 (1?100)孵育24h (4?)，0.01mol/L PBS冲洗3次;生物素化羊抗兔IgG孵育1h (37?)，0.01mol/L PBS冲洗3次;应用SABC-Cy3(荧光)显色培养细胞。阴性对照 用PBS代替一抗。 1.3 骨髓间充质干细胞的分离、培养与纯化 脱颈椎快速处死2周的SD幼年雄性大鼠(转染绿色荧光蛋白基因的大鼠)， 无菌条件下取其股骨,置于无钙镁的D-Hank液中，剪去股骨两端，用10%胎牛血 清的L-DMEM冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液。用吸管轻轻吹打成单细胞悬液， 将细胞接种到铺有多聚赖氨酸的培养瓶中,放入37?、5%CO2培养箱中培养。第 4d半量换液，以后2-3d全量换液。大约10d,当细胞接近融合(70%-80%)时按1:3比 例传代(P1代)。同样方法传代至第5代(P5代)。 1.4 嗅鞘细胞与骨髓间充质干细胞共培养及鉴定 1.4.1 嗅鞘细胞与骨髓间充质干细胞共培养 设对照组(MSCs单独培养)和实验组 (OECs+MSCs 共培养)。将培养P5代后的MSCs用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化， 调整浓度为1×104个/ml，放入24孔板中,每孔1ml，用5%胎牛血清的L-DMEM培养 3 液继续培养。将培养7d的OECs用0.25%胰酶消化，浓度为1×104个/ml,加入到24 孔板内的实验组中,与MSCs进行共培养。分别共培养7d、14d后观察MSCs的分化 情况。 1.4.2 骨髓间充质干细胞共培养及分化的检测 用4%多聚甲醛固定培养的7d和 14d对照组和实验组细胞30min，0.01mol/L PBS冲洗3次。加10%山羊血清封闭 20min后，加入一抗，4?孵育过夜,PBS冲洗后加入TFITC标记的山羊抗小鼠 IgG(1?300)和TFITC标记的山羊抗兔IgG(1?300)，37?孵育1h。0.01mol/L PBS 冲洗3次后在倒置荧光显微镜下观察。阴性对照将一抗用0.01mol/L PBS代替，其 余步骤同上。一抗分别是nestin(1?1000;Sigma)，MAP2(1?500;Sigma)、 GFAP(1?500;Sigma)、NF(1?300)和PSD(1?300)。 1.5 数据的统计学处理 在Leica倒置荧光显微镜(200×)下观察每孔培养细胞的染色情况。随机选取15 个非重叠视野进行计数，通过计算染色阳性细胞/细胞总数得出染色阳性细胞百 分比。数据以SPSS软件包进行分析和处理，采用单因素方差分析，比较对照组 与实验组的数据，以P<0.05为有统计学意义。 2 结 果 2.1 OECs的形态及其免疫组织化学鉴定 OECs培养12h后陆续贴壁,24h的细胞呈聚集或散在生长，部分细胞可长出突 起，但胞体大、突起小。培养7d后,可以见有些细胞呈梭形或三角形，突起细长 且直，似针样。细胞核呈不规则形,胞体呈长梭形。另外有少量细胞的胞体扁而 大，立体感差，这些细胞为成纤维细胞。p75免疫组织化学染色显示梭形或三角 形的细胞为阳性染色，其突起细长且着色较深。用Hoechst33342标记细胞核后， 随机选择10个视野，计算阳性染色细胞数与Hoechst33342标记的细胞数目百分 比，取平均值。结果是p75阳性染色的嗅鞘细胞为81%(图1A)。 2.2 MSCs的形态及其免疫组织化学鉴定 原代培养6h后可见圆形、透亮细胞贴壁。培养2d后,这些细胞聚集成小的细 胞克隆。在3d后,这些细胞克隆开始长出突起，大约第6d细胞的形态变为长梭形 或多角形，并形成小集落。当细胞接近融合时，细胞则呈现放射状或旋涡状分布， 4 其形态多为梭形。随着细胞的传代，细胞纯度会增加。P3代后,细胞形态均一， 多为长梭形或纺锤形，细胞核圆形或椭圆形，有1,2个核仁，细胞排列具有一定 的方向性(图1B)。 Fig.1A Arrows indicate p75 positive staining olfactory ensheathing cells cultured in vitro, with nucleus labeled by Hoest33342. Immunofluorescence histochemal staining, fluorescence microscope, Scale bar, 20μm 示体外培养的p75阳性染色嗅鞘细胞(箭)，其细胞核被Hoest33342标记。免疫荧光组 织化学染色，荧光显微镜 标尺= 20μm Fig.1B Showing the fifth generation transgenic MSCs cultured in vitro. Fluorescence microscope, Scale bar, 20μm 示体外培养的第5代转GFP基因的MSCs。荧光显微镜 标尺= 20μm 2.3 共培养细胞的形态及其荧光免疫组织化学鉴定 OECs与MSCs共培养12h后,可见OECs与MSCs重新贴壁生长。培养3d后,观察 到MSCs胞体收缩、变小，呈不规则形或多角形等，并逐渐形成突起。培养7d后， MSCs形成典型的神经元样细胞形态。细胞体呈圆形,突起较长,呈双极或多极形。 在突起末端出现分支，一些突起与相邻细胞的突起连接成网状。MSCs 7d组和 MSCs 14d组的MSCs形态没有明显变化。用荧光免疫组织化学染色检测分化的 MSCs,均能分别呈现nestin、NF、MAP2和PSD阳性染色,而GFAP则呈现阴性染色 (附表,图2)。 5 Fig.2A Showing nestin positive staining MSCs of 14 MSCs day group ( Arrows indicate green nucleus and orange yellow cytoplasm) Immunofluorescence histochemal staining, fluorescence microscope, Scale bar, 20μm 图 2A 示 MSCs 14d 组的 MSCs 呈 nestin 阳性染色(箭，细胞核为绿色，细胞质为橙黄色)。 免疫荧光组织化学染色,荧光显微镜 标尺= 20μm (图 2B、C、D、E 和 F 相同) Fig.2B Showing nestin positive staining MSCs of MSCs+OECs 14 day group (Arrows indicate green nucleus and orange yellow cytoplasm) Immunofluorescence histochemal staining, fluorescence microscope, Scale bar, 20μm 示 MSCs+OECs 14d 组的 MSCs 呈 nestin 阳性染色(箭，细胞核为绿色，细胞质为 图 2B 橙黄色)。 Fig.2C Showing NF positive staining MSCs of MSCs 14 day group (Arrows indicate green nucleus and orange yellow cytoplasm) Immunofluorescence histochemal staining, fluorescence microscope, Scale bar, 20μm 示 MSCs 14d 组的 MSCs 呈 NF 阳性染色(箭，细胞核为绿色，细胞质为橙黄色)。 图 2C Showing NF positive staining MSCs of MSCs+OECs 14 day group (Arrows indicate Fig.2D green nucleus and orange yellow cytoplasm) Immunofluorescence histochemal staining, fluorescence microscope, Scale bar, 20μm 图 2D 示 MSCs+OECs 14d 组的 MSCs 呈 NF 阳性染色(箭，细胞核为绿色，细胞质为橙黄 6 色)。 Fig.2E Showing PSD95 positive staining MSCs of MSCs 14 day group (Arrows indicate green nucleus and orange yellow cytoplasm) Immunofluorescence histochemal staining, fluorescence microscope, Scale bar, 20μm MSCs 14d 组的 MSCs 呈 PSD95 阳性染色(箭，细胞核为绿色，细胞质为橙黄色)。 示图 2E Fig.2F howing PSD95 positive staining MSCs of MSCs+OECs 14 day group ( Arrows indicate green nucleus and orange yellow cytoplasm) Immunofluorescence histochemal staining, fluorescence microscope, Scale bar, 20μm 图2F 示MSCs+OECs 14d组的MSCs呈PSD95阳性染色(箭，细胞核为绿色，细胞质为橙黄 色)。 Table Percentage of 4 groups positive staining cells (nestin、MAP2、NF and PSD) differentiated by MSCs (%, mean?s) 附表 4 组 MSCs 分化为 nestin、MAP2、NF 和 PSD 阳性染色细胞的百分率(%, mean?s) 组 别 nsetin NF MAP2 PSD95 MSCs 7d 组 4.32?2.41 5.16?1.22 6.12?0.78 0.36?0.42 36.25?1.3534.56?2.8833.61?4.13* * * MSCs+OECs 7d 0.56?0.23 组 MSCs 14d 组 6.11?0.86 6.03?2.14 7.09?3.62 1.41?0.64 32.37?3.38# 35.20?8.96# 34.67?4.69# 15.28?4.6# MSCs+OECs 14d 组 Single factor analysis of variance : *P<0.05 compared with MSCs 7 day group ; #P<0.05 compared with MSCs 14 day group 单因素方差分析:*P<0.05, 与MSCs 7d组比较; #P<0.05, 与MSCs 14d组比较 3.讨 论 发现MSCs具有向神经元分化的潜能是神经科学研究的重要进展，它给许多 以前认为是不治之症的脊髓损伤和脑损伤等病患的细胞移植治疗带来新的希望。 由于MSCs的取材较为容易，在体外培养可迅速增殖,可诱导分化为多种细胞。自 体MSCs移植不会引起机体的免疫排斥反应，而且没有伦理道德等问题。 Woodbury等首次报道,MSCs可向神经元样细胞分化。他们在无血清培养基中加入 二甲基亚砜(DMSO)、BHA等化学试剂，发现MSCs被诱导分化为神经元样细胞， 7 这些细胞可以表达神经元标志物，而不表达星形胶质细胞标志物[6]。 随后许多研究均证实，MSCs可分化为神经元样细胞[7]。但是,MSCs分化为神 经元的比例较少。即使是已分化的神经元样细胞是否具有形成突触的潜能，仍是 值得关注的问题。因此,单纯移植MSCs是不能完全替换病变部位缺失的神经元。 因此，有必要在体外探讨MSCs分化为神经元的条件，以便应用MSCs源性神经元 进行移植。目前有许多关于MSCs分化为神经元的体外实验研究报道。在体外诱 导MSCs向神经元分化的试剂主要有: 视黄酸、生长因子(单独或联合使用)、抗 氧化剂、脱甲基试剂、环磷腺苷试剂和中药单体黄芩苷等。Sanchez-Ramos等建 立了在体外诱导MSCs分化为神经元的培养体系，诱导培养7,14d后，用Western Blotting和RT-PCR等技术检测发现MSCs已分化为神经元[8]。而且还发现，将MSCs 与胎鼠中脑细胞和纹状体细胞一起共同培养,能明显提高MSCs向神经元分化的 比例。Woodbery等研究发现，经神经营养因子诱导后，MSCs几乎只向神经元分 化，而不向星形胶质细胞分化[9]。这些研究表明,细胞因子如碱性成纤维细胞生长 因子(bFGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、血小板源性生 长因子(PDGF)、神经营养素-3(NT-3)[10]、胶质源性神经营养因子(GDNF)等都能 够促进MSCs向神经元分化。 已有研究发现[11]，嗅鞘细胞(olfactory esheathing cell, OECs)能够分泌大量不 同种类的细胞活性因子，如PDGF、神经肽Y、S100、NGF、BDNF、NT-3、神 经营养素-4 (NT-4) 和睫状神经营养因子(CNTF)等。嗅鞘细胞也能在其细胞膜上 表达出很多与细胞粘合和轴突生长相关的分子，如PSA-N-CAM、N-CAM、 laminin、fibronectin以及具有促进神经生长作用的nexin。本实验将OECs和MSCs 共培养，发现OECs 能够明显促进MSCs向神经元样细胞分化，而且这些细胞具 有形成突触的潜能。综合其它的研究结果提示，OECs可能是通过分泌多种神经 营养因子(如BDNF、NGF、PDGF、NT-3、NT-4/5和GDNF)等机制来促进MSCs 向神经元分化;此外，OECs还能分泌细胞黏附因子等。这提示OECs也有可能通 过分泌细胞黏附因子以及OECs与MSCs的直接接触[12]等机制促进MSCs向神经元 分化。在中枢神经中成熟神经元的一个主要特点是具有形成突触的潜能，当神经 元出现有突触结构时才称之为有功能的神经元。PSD95的表达常与突触的形成有 密切关系，它能作为提示已分化的神经元样细胞具有形成突触潜能的一种标志物 8 [13] 参考文献: [1]赵宇，陆应麟,乔群,等。培养的人骨髓间充质干细胞向成骨细胞、脂肪细胞 分化。安徽医科大学学报,2004,39(1):22,25 [2]Li Y, Chen J, Wang L, et al. 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