【doc】 阿莫西林／克拉维酸钾原料及制剂中有关物质测定方法的比较

【doc】 阿莫西林／克拉维酸钾原料及制剂中有关物质测定的比较 阿莫西林,克拉维酸钾原料及制剂中有关 物质测定方法的比较 中国抗生素杂志2005年12月第3O卷第12期?737? 文章编号:1001—8689(2005)12—0737一o4 阿莫西林/克拉维酸钾原料及制剂中有关物质测定方法的比较 周晓溪.顾立素逄涣欢.胡昌勤h冯芳t (1中国药品生物制品检定所,北京100050 2山西省药品检验所,太原030001; 3吉林省药品检验所,长春130062; 4中国药科大学,南京210009)) 摘要:目的建立两种HPLC线性梯度洗脱测定阿莫西林/克拉维酸钾有关物质的方法,并对其进行比较.方法两种方法 均采用Cts柱,流速1.Oral/rain,所用流动相为磷酸盐缓冲液:乙腈色谱系统.方法一中流动相A为0.05mol/L磷酸盐缓冲液 (pH5.O);乙腈(99:1),流动相B为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.O):乙腈(80:20);方法二中流动相A为0.01mol/L磷酸盐 缓冲液(pH6.O),流动相B为0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.O):乙腈(20:80).两种方法的梯度变化不同.方法一和方法二的检 测波长分别为254和215nm.结果两种方法的线性范围,检测限及测定结果基本一致.结论两种方法准确,专属性强,灵敏度 高,适用于阿莫西林/克拉维酸钾中有关物质测定,且方法一的稳定性 优于方法二. 关键词:阿莫西林/克拉维酸钾;有关物质;HPLC 中图分类号:R927.2文献标识码:A Comparativestudiesondeterminationofrelatedsubstancesof amoxicillin-potassiumclavulanateanditspreparations ZhouXiao—xi’,GuLi—SU,PangHuan—huan,HuChang—qinandFengF ang’ (1NationalInstitutefortheControlofPharmaceuticalandBiologicalProducts,Beijing100050; 2ShanxiInstituteforDrugControl,Taiyuan030001; 3JilinInstituteforDrugControl,Changchun130062; 4ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009) ABSTRACT0bjectiveTWOHPICmethodswithIineargradientelutionfordeterminationoftherelated substancesofamoxicillin—potassiumclavulanatewereestablishedandcompared.MethodsInthetwometh— ods,theflowrateswereboth1.0ml/minandtheseparationwascarriedoutusingCl8columnwithmobile phaseofphosphatebuffer—acetonitrile.Inthefirstmethod,themobilephaseAwas0.05mol/Iphosphate buffer(pH5.0):acetonitrile(99:1)andthemobilephaseBwas0.05mol/Iphos phatebuffer(pH5.0): acetonitrile(80:20).Inthesecondmethod.themobilephaseAwas0.01mol/Iphosphatebuffer(pH6.0) andthemobilephaseBwas0.01mol/Iphosphatebuffer(pH6.0):acetonitrile(20:80).Thelineargradient elutioniSdifferentinthetWOmethods.ThedetectionwavelengthsforthetwOmethodswere254nmand 215nm,respectively.ResultsThereisnodistinctdifferencebetweenthetWOmethodsinthelinerrange,the detectionIimitsandthecontentsoftherelatedsubstances.ConclusionThetwomethodsareaccurate,sensi— tiveandsuitableforthestudyontherelatedsubstancesofamoxicillin—potass iumclavulanate.Therepro— ducibilityofthefirstmethodiSbetterthanthesecondone. KEYWORDSAmoxicillin—potassiumclavulanate;Relatedsubstances;H PIC 收稿日期:2005—05—16 作者简介:周晓溪,女,生于1972年,在读硕士研究生.*通讯作 者.E—mail:hucq@nicpbp.org.cn ?738?阿莫西林/克拉维酸钾原料及制剂中有关物质测定方法的比较 周晓溪等 阿莫西林/克拉维酸钾复方制剂包括注射用阿莫 西林钠/克拉维酸钾(5:1)及片剂,干混悬剂等I:I服制 剂(由阿莫西林三水合物和克拉维酸钾组成,中国药典 2005年版中收载的阿莫西林/克拉维酸钾1:1服制剂的 比例有2:1,4:1和7:1三种),克拉维酸钾作为fi- 内酰胺酶抑制剂,可以保护阿莫西林免遭f}I内酰胺酶 的水解. 阿莫西林中可能含有多种相关物质,英国药典 2002年版采用HPIC线性梯度洗脱法对其进行测 定2;文献方法有反相HPIC法.,,凝胶色谱法和 IC—MS法s等.对克拉维酸钾中有关物质的控制英国 药典2002年版.和美国药典28版m中均采用反相 HPIC法.对阿莫西林/克拉维酸钾复方制剂中有关物 质的分析,除文献E6]~b,少有报道;各国药典也均未对 其进行控制.为有效控制阿莫西林/克拉维酸钾制剂的 产品质量,本文建立了两种反相HPIC方法,并对两 种方法进行了与比较. 1仪器与试药 Shimadzu液相色谱系统,包括IC一10AT泵, SPD一10A紫外检测器,SII一10AXI型自动进样器, Class—VP工作站. 阿莫西林对照品(批号为130409—200208,含量 86.2%)由中国药品生物制品检定所提供;4-羟基苯甘 氨酸,阿莫西林噻唑酸,6一氨基青霉烷酸,二酮哌嗪阿 1方法一线性梯度洗脱 AB 0510152O253O354O ,(rain) A:克拉维酸;B:阿莫西林 27.353为阿莫西林闭环二聚体.余为有关物质 图2方法一:阿莫西林/克拉维酸钾(2:1)原料色谱图 莫西林,阿莫西林开环二聚体,阿莫西林闭环二聚体, 阿莫西林三聚体对照品由中国药品生物制品检定所提 供;阿莫西林/克拉维酸钾(2:1)原料由京保药品株式 会社提供;阿莫西林/克拉维酸钾(7:1)干混悬剂由香 港澳美制药厂提供.乙腈为HPIC级,磷酸二氢钾为 AR级. 2方法与结果 2.1方法一 此方法是在英国药典2002年版阿莫西林钠项下 有关物质测定方法.的基础上作改进.该方法中,首先 采用等度洗脱至阿莫西林峰出现,再采用梯度洗脱分 离有关物质.在此系统中克拉维酸先于阿莫西林出峰, 为更好地分离克拉维酸,阿莫西林及其周围的杂质,将 原用等度洗脱部分用梯度洗脱替代.该方法可以较好 地分离出复方制剂中各有关物质. (1)色谱条件和梯度洗脱方式色谱柱Spheri— sorbODS2(4.6mmx200mm,5m)为大连江申公司 产品;流动相A为磷酸二氢钾溶液(0.OSmol/I,用氢 氧化钠试液调节pH值至5.0):乙腈(99:1),流动相 B为磷酸二氢钾溶液(0.05mol/I,pH5.0):乙腈(80 :20),流速1.0ml/min,线性梯度洗脱见表1,检测波 长254nm,进样量50l. 在上述色谱条件下,各杂质峰均分离良好,理论板 数按阿莫西林峰计算不低于2500(图1,图3). A AB 152025303540 f(min) 方法一:克拉维酸钾色谱图 昌/一 吖一 0510152O253O354O ,(rain) A:克拉维酸;B:阿莫西林;C:辅料 27.283为阿莫西林闭环二聚体.余为有关物质 图3方法一:阿莫西林/克拉维酸钾(7:1)干混悬剂色谱图 O l 图 5 O ?740?阿莫西林/克拉维酸钾原料及制剂中有关物质测定方法的比较周晓溪等 (2)方法的专属性试验称取阿莫西林/克拉维酸 钾样品适量,分别在光照,高温,高湿,酸,碱等极性条 件下破坏并依法进行测定.在本法所规定的色谱条件 下,上述各种破坏所产生的降解产物基本达到基线分 离,证明本法用于有关物质测定是可行的,同样高温, 高湿和碱性三种条件更有利于高分子聚合物的形成. (3)线性关系考察取阿莫西林对照品适量,加流 动相A分别制成含阿莫西林为1.0,32.0t~g/ml的一 系列溶液,按2.1项下的方法分别进样测定.以峰面积 为纵坐标,以阿莫西林溶液的浓度c为横坐标,得 线性回归方程如下: A一2.090C一1.084r=0.9992(n一7) 结果表明,在1.028,32.896t~g/ml浓度范围内, 供试品自身对照溶液的浓度与测得的峰面积呈良好的 线性关系. (4)检测限和定量限按信噪比为3:1计算,测 得阿莫西林和阿莫西林闭环二聚体的检测限分别为 0.308和0.6ptg/ml;按信噪比为10:1计算,阿莫西 林和阿莫西林闭环二聚体的定量限分别为1.028和 2.0t~g/ml. (5)精密度一重复性试验取某一批号样品,精密 称取6份,照方法二项下的方法,在一定时问范围内连 续测定,同时取阿莫西林对照品同法测定,按外标法以 峰面积分别计算上述6份样品的有关物质,对本法的 重复性进行考察.结果6份样品的总杂质量分别为 1.54,1.52,1.499/6,1.54,1.509/6和1.549/6,平 均值1.52%,RSD为1.46;最大杂质阿莫西林闭环 二聚体的含量分别为0.749/5,0.72oA,0.71, 0.739/6,0.719/5和0.73oA,平均值0.72,RSD为 1.679/5. (6)稳定性试验在室温约18_C,供试品溶液在 5h内稳定,其峰A面积和峰B面积的RSD分别为 1.05(n=4)和0.39(,2—4). 2.3样品测定 分别用上述两种方法测定阿莫西林/克拉维酸钾 干混悬剂(7:1).精密称取供试品适量,均用流动相A 溶懈并定量稀释制成含阿莫西林为1.0mg/ml的溶 液,阿莫西林自身对照溶液的浓度均为20ptg/ml.按外 标法以阿莫西林标示量计,用两种方法分别计算保留 时问大于阿莫西林的各个杂质含量,不计算峰面积小 于0.05倍对照溶液主峰面积的杂质峰,两种方法的测 定结果(表3)基本一致,但方法一所检出的阿莫西林 主峰后的杂质数目略多于方法二. 3讨论 目前,阿莫西林中有关物质的分离分析方法已基 本成熟,在各种色谱系统中相关物质的洗脱顺序基本 相同[n3,已知结构的相关物质按保留时问从小到大在 阿莫西林主峰前依次有4一羟基苯甘氨酸,阿莫西林噻 唑酸,6一氨基青霉烷酸,主峰后依次有二酮哌嗪阿莫西 林,阿莫西林开环二聚体,阿莫西林闭环二聚体,阿莫 西林三聚体等.阿莫西林/克拉维酸钾复方制剂中的有 关物质,在已有的测定方法中],只检查含量有明显变 化的个别杂质.阿莫西林及克拉维酸相关杂质结构差 异较大,本实验两种方法均采用线性梯度洗脱,以确保 在较短时问内洗脱出所有杂质.梯度洗脱基线噪音大, 对含量微小的聚合体易产生干扰,使用25,30C 柱温,可确保各色谱峰保留时间的相对稳定性.两种方 法均采用C柱,所用流动相均为磷酸盐缓冲液一乙腈 系统,缓冲液中盐浓度,有机相比例及溶液pH略有不 同,同时所选检测波长亦有差异,但两种方法的检测灵 敏度及测定结果基本一致. 方法一开始为梯度洗脱,可较好地分离克拉维酸 及阿莫西林主峰前各个杂质,在阿莫西林出峰阶段为 等度洗脱,当阿莫西林出峰后又运行梯度洗脱,既可以 表3样品测定结果() 方法一030709 O3l2l5 (下转第743页) 睨 OOO 叫眦 OOO 叫叭 OO0 勰 0OO ?? OOO % OOO ? OOO ?%? OOO ??? OOO “_. OOO ?? OOO 叫?? OOO OOO ?叫 OOO ?叫 334 OOO 二 法 方 中国抗生素杂志2005年12月第3O卷第12期?743? 已经合成并申请专利的头孢酯脒同质.在本文HPIC 条件下,保留时间9.448rain. 3讨论 头孢硫脒不稳定,在水溶液中容易水解生成去乙 酰头孢硫脒.临床应用时需注意水溶液配制后立即使 用.因去乙酰头孢硫脒可以进一步降解生成头孢酯脒, 生产和保存过程中应注意防潮保护.冻干法制得的注 射用头孢硫脒由于在制备过程中接触水的时间较长, 头孢酯脒的含量较高因此,如何控制该杂质的含量, 也是该制剂开发过程中必须要解决的问题. 头孢硫脒HPIC图谱中还有保留时间(,)为 5.24和5.67rain的两个色谱峰的面积也较大,可能是 在合成过程中产生的,需对其进行进一步的研究并确 证其结构,明确头孢硫脒中的有关物质,并对其进行有 效的控制. 参考文献 [1]周红华,马仁玲,沈文斌,等.加替沙星注射液光降解产物 的LC—MS分析[J].中国药学杂志,2004,39(3):224 [2J魏君,王维贤,高立军,等.格列美脲原料药中有关物质及 降解产物的研究[J].药物分析杂志,2003,23(3):207 [3]牛长群,刘进怀,祝仕清.林可霉素相关物质的LC—ESI? MS研究[J].中国抗生素杂志,2003,28(2):76 [4]王颖,盛龙生,张正行,等.表阿霉素中有关物质的LC/ ESI/MS分析[J].药物分析杂志,2001,21(6):392 [5]彭建和,涂家生,盛龙生.LC/MS分析克拉霉素降解产物 [J].中国药科大学,1998,29(5):374 (上接第740页)准确地测定对照溶液中阿莫西林的 量,又可以运用梯度洗脱很好地分离各有关杂质.方法 二目前已作为进口注册用于对阿莫西林(钠)克拉 维酸钾进口原料中有关物质的控制.该方法从运行开 始至分析结束均采用梯度洗脱,阿莫西林出峰时间处 于梯度上升阶段,基线易漂移,导致测定结果不稳定. 此外,方法一所检出的阿莫西林主峰后的杂质数目略 多于方法二,因此认为方法一优于方法二. 阿莫西林/克拉维酸钾制剂中阿莫西林聚合物是 其主要的过敏性杂质在基于溶质极性来分离的反相 HPIC中,阿莫西林聚合物一般极性相对较小,其保留 值大于阿莫西林主峰,且聚合度越高保留时间越长.在 所建立的两种方法中,克拉维酸均先于阿莫西林出峰, 实际检测到的阿莫西林主峰后的已知杂质主要有二酮 哌嗪阿莫西林和阿莫西林闭环二聚体,未知杂质可能 有克拉维酸聚合体或阿莫西林/克拉维酸异聚物Ll; 因此实际应用中,控制阿莫西林/克拉维酸钾口服制剂 中保留值大于阿莫西林的杂质具有重要意义.该质控 策略目前已经体现于2005年版中国药典对阿莫西林/ 克拉维酸钾口服制剂的质量控制中u]. 参考文献 [1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2005年版,第二部 [S].北京;化学工业出版社,2005:230 [2]TheBritishPharmacopoeiaCommission.BritishPharma— eopoeia[S].London:TheStationeryOffice,2002:125 [3]FongGW.MartinD,JohnsonRN,eta1.Determination ofdegradationproductsandimpuritiesofamoxicillincap— sulesusingternarygradientelutionhigh-performanceliq? uidchromatographyD].JChromatogr,1984,298(3):459 [4]DePourcqP,HoebusJ,RoetsE,eta1.Quantitative determinationofamoxieillinanditsdecompositionprod— uctsbyhigh?performanceliquidchromatography[J]. 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