AFLP共显性标记的分离_应用与AFLP技术的改良

AFLP共显性标记的分离_应用与AFLP技术的改良 第 1卷第 2期 Vo l11 , No12 南 方 水 产 M ay, 2005 2 0 0 5 年 5 月Sou th Ch ina F ishe rie s Sc ience ?综述 ? AFL P共显性标记的分离 、应用与 AFL P技术的改良 1 , 2 2 1 王小玉 , 喻达辉 , 龚世园 ( )11 华中农业大学水产学院 , 湖北 武汉 430070; 21 中国水产科学研究院南海水产研究所 , 广东 广州 510300 摘要 : A FL P作为新一代的分子标记 , 其应用越来越广泛 , 技术也越来越成熟 。文章综述了 A FL P多态带转化为 SN P s、 SSR 等共显性标记的研究现状及 A FL P改进技术的应用发展前景 。 关键词 : A FL P; 共显性带 ; 分离 ; 改进技术 ( ) 文章编号 : 1673 - 2227 - 200502 - 0067 - 06 中图分类号 : Q75 文献标识码 : A Isola tion and usefulness of codom inan t markers from AFL Ps and m od if ica tion s of AFL P techn ique 1 , 2 2 1 WAN G X iao2yu, YU D a2hu i, GON G Sh i2yuan ( 1. F isheries College of H uazhong A g ricu ltu ra l U n iversity, W uhan 430070, Ch ina; )2. S ou th Ch ina S ea F isheries Institu te, C h inese A cadem y of F ishery S ciences, Guangzhou 510300, Ch ina () A b stra c t: Amp lified F ragm en t L ength Po lymo rp h ism A FL Pis a new mo lecu la r m a rke r techn ique on the ba sis of PCR1 A FL P s a re w ide ly emp loyed in m any fie ld s and becom e mo re and mo re pop u la r1 Ye t A FL P s a re dom inan t m a rke rs and have na tu ra l lim ita tion s1 How to conve rt dom inan t A FL P m a rke rs in to codom inan t m a rke rs and the mod ifica tion s of A FL P techn ique a re the m a in focu s of th is re2 view1 The app lica tion s of the A FL P2de rived m a rke rs a re reviewed a s we ll1 Key word s: A FL P; dom inan t m a rke r; codom inan t m a rke r; conve rsion 个领域 。 ( amp lified fragm en t length po lymo r2 扩增片段长度多态 然而 , A FL P分子标记是显性标记 , 无法区分纯合体与 ) p h ism , A FL P分子标记技术 , 最早是由荷兰 Keygene公司 [ 1 ]杂合体 , 具有一定的局限性 。与一般基于 PCR 实验技术的 Zabeau等 提出 , 并在近年来发展起来的极具生命力的分 标记相比 , A FL P标记技术要求熟练的实验技巧 , 价格也相 子生物学技术 。它有效的结合了限制性内切酶片段长度多 对较贵 。因此 , 这种技术的使用仍受到一定的限制 。近几 ( ) ( ) 态性 R FL P和随机扩增多态性 RA PD 的优点 , 克服 年来通过克隆和测序将 A FL P显性标记转化为共显性标 记 了 RA PD 的不稳定性和 R FL P技术受探针来源限制的缺点 , 的研究或通 过 定 量 检 测 PCR 产 物 而 获 得 A FL P 共 显 性 信 且在缺乏研究对象的 DNA 序列信息的情况下 , 短时间内便 可获得大量的分子标记 , 重复性高 。因此 , 为不同来源和 [ 9 ] 息 的相关研究已有不少报道 。本文将对 A FL P 共显性 标 不同复杂程度基因组的分析提供了一个有力的工具 。自从 [ 2 ]记的分离转化及其应用前景和 A FL P 技术的改良作一简 要 Vo s等 第一次报道后 , A FL P技术已广泛应用于遗传多样 [ 3, 4 ] [ 5, 6 ] [ 7 ] [ 8 ]综述 。 性 , 性别鉴定 , 遗传图谱构建 , 基因定位 等各 收稿日期 : 2005 204 212 ( ) ( ) 资助项目 : 广东省自然科学基金 037148 ; 番禺区科技项目 2004 2Z261 21 ( ) 作者简介 : 王小玉 1976 - , 女 , 硕士研究生 , 从事海洋生物遗传育种研究 。 E2m a il: yue rxitan@1631com 通讯作者 : 喻达辉 , E2m ail: yudh231 @21 cn1com ) bp 分离 SN P标记的方法 。 1 A FL P标记技术的原理 A FL P标记技术的基本原理是利用 PCR 技术和凝胶电 泳技术对基因组 DNA 的双酶切片段进行选择性扩增 、电泳 分离来检测扩增的 DNA 片段的长度多态性 。一般用 EcoR I 和 M se I限制性内切酶将基因组 DNA 进行 双酶切 , 然后将 ( ) 酶切片段和接头 adap te r连接 , 连接产物作为预扩增反 应的模板 , 接头序列加 1 个选择性碱基作为预扩增引物进 行预扩增 , 其扩增产物作为模板 , 用含 223 个选择性碱基 的引物进行选择性扩增 。扩增片段经过变性聚丙烯酰胺电 泳分 离 、银 染 或 自 显 影 检 测 , 即 可 获 得 大 量 的 DNA 谱 [ 2 ] 带 。对同一基因组 DNA 而言 , 引物的选择性碱基数目越 多 , 扩增出来的带就越少 ; 反之 , 扩增出来的带就多 。 2 A FL P共显性标记的分离转化 211 单 核苷 酸 多 态 ( sin g le n uc lea o t ide po lym or2 ph ism , SNP) 标记的转化与分离 SN P是指基因组内特定核苷酸位置上存在的单个碱基 的突变所引起的 DNA 序列多态性 。在基因组 DNA 中任何 碱基均有可能发生变异 , 非编码序列的变异较多 。 SN P 大 图 1 A FL P显性标记转化为 SN P标记 ( ) 多为转换 tran sition突变 , 即由一 种嘧啶或嘌呤碱基转 F ig11 Conve rting dom inan t A FL P m a rke rs in to SN P 换为另一种嘧啶或嘌呤 。 SN P 在大多数基因组中存在较高 [ 10 ] 的频率 , 人类基因组具有大量的 SN P, 平均每 113 kb就 标 212 微卫星 ( s im p le sequen ce repea ts, SSR ) 有一个 SN P存在 。因此 SN P具有很高的信息含量 。 从 A FL P标记中分离 SN P的方法包括多态带选择和再 记的转化分离( ) 扩增 、测序 , 对 测 序 结 果 首 先 进 行 序 列 比 对 a lignm en t( ) 微卫星 simp le sequence rep ea ts, SSR 是指以几个核 分析 , 然后进行 BLA ST同源分析 , 并用过滤软件去除重复 ( ) 苷酸 2,6 为单位以首尾相连的方式重复出现多次而组 ) (序列 S IN E s和 VN TR s 小卫星和微卫星 , 初步筛选出可 成的一段 DNA 序列 , 重复次数一般为 10,50 , 在基因组中 能含有 SN P的序列 。再用肉眼逐条检查可能存在 SN P的序 含量丰富 , 是共显性标记 。由于基本单元重复次数的不同 , ( ) 列电泳图 谱 e lec trop he rogram , 同 一 位 点 有 重 叠 峰 出 现 而形成 SSR 座位的多态性 。用 A FL P标记技术分离微卫星 , () 两个碱基在同一位置出现 , 明来源于父母本的两条染 主要是利用 A FL P的扩增原理将可能含有微卫星的酶切 片 色体其中 1条发生了单核苷酸突变 , 初步鉴定出 SN P s。为 段大量扩增 , 从而有利于利用磁珠进行富集 , 大大提高了 了进一步验证 SN P s, 可以通过克隆测序 , 如果发现造成重 [ 13 ]微卫星分离的效率 。主要包括双酶切预扩增产物富集 和 叠峰的 2个碱基在不同克隆中出现 , 表明确实为 SN P; 也 [ 14 ] 单酶切产 物 扩 增 富 集 2 种 方 法 。从 磁 珠 上 洗 脱 下 来 的 可利用初步鉴定出的含有 SN P s的序列特异引物 , 对基 DNA 用相应 的 A FL P 引 物 和 扩 增 条 件 扩 增 , 再 克 隆 测 序 , 因组 DNA 进行 PCR 扩增 、直接测序 , 如果在同一位点仍 从所得的序列中找出重复片段位于中间部分 、长度适宜的 [ 11 ] 为重叠峰 , 表明该位点确实为 SN P。其图见图 1。 () 序列 , 设计引物进行扩增筛选验证 图 2。 [ 11 ]N icod等 利用上述方法从鳟鱼中分离 SN P s, 结果在 [ 13 ]高国庆等 用磁珠富集法从 A FL P片段中分离微卫星 29条序列带中的 10 条发现了 24 个候选 SN P s, 29 条带共DNA 标记 , 回收纯化 14 个片段 , 测序后发现都含简单重 11111 kb的 DNA 序列 , 平均 463 个碱基就有 1 个 SN P。 19 复序列 , 其中 5 个 是 简 并 序 列 , 其 他 9 个 特 异 序 列 中 , 7 个候选 SN P s以杂合形式在个体 内 检 测 到 , 剩 下 5 个 候 选 个含有 GA 重复序列 。在 9 对 SSR 引物中 , Pm 215 在 44 个 SN P s是通过将同一种群不同个体间的带对比得到 。通过克 隆花生品种资源中测到 4个等位位点 。并比较了 2 种从 A FL P 方法鉴定出 6个 SN P s, 用特异引物法鉴定出 12个 SN P s。 表预扩增和 选 择 性 扩 增 片 断 中 分 离 花 生 微 卫 星 DNA 的 方 明 A FL P指纹技术是分离 SN P s快速 、简便而又廉价的方 [ 15 ] 法 , 说明从 A FL P片断中分离出 SSR 标记的方法在研究 [ 12 ]( 法 。B rugm an s等 也建立了从 A FL P多态片段 100 ,400 花生基 因 DNA 多 态 性 方 面 具 有 很 大 的 应 用 潜 力 。W ong 第 2期 王小玉等 : A FL P共显性标记的分离 、应用与 A FL P技术的改良 69 [ 16 ] 等 在对蜻蛉自然种群的 A FL P 带的特性分析时发现 , 大部分多态标记是共显性的 , 其中部分标记包含微卫星序列 。 图 2 采用磁珠富集法从 A FL P片段中分离微卫星标记 F ig12 Schem a tic rep re sen ta tion of SSR iso la tion by m agne tic bead s from A FL P fragm en ts 213 特 异 序 列 扩 增 ( sequen ce2cha ra c ter ized am 2 p l if ied reg ion, SCA R) 标记的转化与分离 SCAR 标记是通 过 对 序 列 未 知 的 DNA 标 记 进 行 测 序 ,设计特异引物转化 为基于普通 PCR 实验技术的分子标记 。 ( 扩增产生的 片 段 具 有 序 列 已 知 、遗 传 一 致 性 iden tity by ) decen t的特点 。简单易用 、结果稳定 、重复性强 , 是一种 简单实用的标记 。因此将 A FL P标记转化为 SCAR 标记可以 扩大 A FL P标记的用途 。利用 A FL P分离 SCAR 标记的方法 见图 3。 SCAR 标记主要是围绕性状连锁的 A FL P条带来分离筛 [ 17219 ] [ 17 ]() 选的 。Xu等成功地将与苹果抗真菌疤痕 V f 基 因紧密连锁的 A FL P标记转化成 SCAR 标记 。先将与 V f紧 密连锁的 A FL P 标 记 从 胶 上 回 收 , 然 后 将 其 克 隆 到 pB lue2 sc rip t2KS质粒上 , 挑选出阳性克隆 , 用与原来 A FL P标记相 同的引物再扩增 , 测序 、设计 SCAR 标记的引物 。用 8 个苹 果样品的预扩增产物作为模板 DNA 检测候选 SCAR 标记 , 最后从 15个 A FL P标记中分离出 11个 SCAR 标记 。 214 STS ( sequence2tagged site) 标记的转化与分离 STS标记实质上与 SCAR 标记是一致的 。也是将与目的 3 A FL P显性标记转化为 SCAR 标记 图 性状连锁的 A FL P带进行测序 , 设计引物 , 将 A FL P显性标 F ig13 Conve rting dom inan t A FL P m a rke rs in to SCAR 记转化成更简单 、更可靠的基于 PCR 基础上 的 STS标 记 。 [ 20 ] D u ssle等 对与甘蔗病毒 紧密 连 锁 的 抗 性 基 因 Scm v进 行( ) 缺失 标 记 , 另 一 A FL P 标 记 E33M 6122 转 化 成 CA P s ( ) 了研究 , 将一显性 A FL P 标记 E35M 6221 转化成插入或 ( ) c leaved amp lified po lymo rp h ic sequence 标 记 , 证 实 E33M 61 22在 3号染色体上 , E35M 62 21在 6号染色体上 , 与 (原来的 A FL P标记一样 。B radeen等曾用与 Y2 控制胡萝卜 ) () 素的富集 连锁的 6 个 A FL P片段 , 通过 F2 图谱和集合分 Xu等将分离出的与苹果抗真菌疤痕 V f 基因紧 的工具 。 离分析方法 , 发展了一个简单的 、 PCR 基础上的共显性标 密连锁的 15 个 A FL P 标 记 中 的 11 个 成 功 转 化 成 SCAR 标 [ 21 ] 记的分离方法 。先从 A FL P片段中分离出与与 Y2连锁的 记 , 这些 SCAR 标记的精细作图显示其中 7个 SCAR 标记位 标记用原 引 物 再 扩 增 , 将 产 物 纯 化 , 克 隆 到 质 粒 p GEM 2T于 V f基因的右侧 , 3个 SCAR 标记位于其左侧 , 1个位于其 中 。因此 SCAR 标记可以很快地定位苹果的 BAC 文库 , 最中 , 转移到 Ze ta2P robe 尼龙膜上 Sou the rn 杂 交 , 或从 A FL P[ 17 ] 片段序列中设计反向 PCR 引物 , 电泳检测其产物 , 再按上 终获得 V f基因 。 面步骤杂交 。 4 A FL P改良技术的发展与分离共显性标记 3 A FL P共显性标记的应用 的前景展望 A FL P技术作为新一代的分子标记技术 , 自从其诞生以 311 种类鉴定 来 , 已有大量文章开始发表 , 但它与其它分子标记一样 也 将 A FL P标记转化为 SN P 标记后有助于解 释个体的表 存在许多不足之处 。近几年来 , A FL P技术有了很大改善与 [ 11 ] 型差异 , 在系统进化和种群遗传学研究中具有很大的应 发展 , 如采用单酶切或三酶切等 。 [ 22, 23 ] 用潜力 。而且 , 将 A FL P 标记转换为 SN P后能详细描 411 单酶切 A FL P技术[ 24 ] 叙等位基因的变化 , 有利于鉴定 一些分类较模糊的种 。 这种方法是在传统的 A FL P 技 术 基 础 上 以 改 进 。采 用() B en sch等通过 选 取 瑞 典 南 北 柳 莺 的 两 亚 种 雄 性 各 15 一种酶 , 一个接头 , 酶切连接反应在一个反应内进行 , 使 用琼脂糖凝胶电泳代替变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 。这种单 只 , 用 11对 A FL P引物组合标记分析发现 , 在 500 个多态 酶切的方法能增加扩增带的特异性 , 减少弱带 , 每个引 物 A FL P标记中只有一个多态片段 A FL Pww1 显示明显的差异 , 多态位点数多 , 所需时间短 , 实验过程较传统的 A FL P技术 然后以这个片段为模板再扩增 , 测序 , 将其转换为一共显 [ 26 ] 简单 。可用于 DNA 指纹图谱构建 。 Suazo 等用这种改进 [ 24 ] 性的 SN P, 从而对柳莺的两亚种进行了不同的分类 。B e2的方法研究非洲蜜蜂与欧洲蜜蜂 , 优化 PCR 条件 , 带出现 ( ) hu ra等对亚洲稻瘿 蚊 不 同 生 物 型 b io typ e 的 A FL P 分 析 的强度随 DNA 浓度增加 , DNA 浓度在 210 和 215 mM 间时 中 , 发现 1个 A FL P标记在生物型 1、 2、 5有扩增带 , 而生 结果具有重现性 , 引物浓度增加也会形成更多的带 。对 非 物型 4 则 没 有 。通 过 测 序 将 其 转 换 为 SCAR 标 记 , 通 过 洲蜜蜂和欧洲蜜蜂的 DNA 样品采用 3 种引物进行 A FL P 分 PCR 扩增得到与 A FL P同样的结果 。生物型 1、 2、 5对含有 析 , 结果所有引物都出现大量的多态带 , 而且每个样品 都 Gm 2抗性基因的稻无毒 , 而生物型 4 有毒 。通过交配遗传 [ 27 ] 有唯一的特异 带 , 从 而 显 示 很 大 的 遗 传 变 异 性 。 R ana2 实验 , 进一步发现该 SCAR 标记与性别相连锁 , 结合 RA PD m ukhaa rachch i等用这种改进的 A FL P 技术与 RA PD 技术 比 [ 19 ] 分离的 SCAR 标记通过套式 PCR 可将各个生物型分开 。 较研究植物的遗传特征 , 10 个 RA PD 引物共产生 99 条带 , 其中 49个是多 态 , 筛 选 出 的 8 对 A FL P 引 物 共 产 生 95 条 312 标记辅助选育 带 , 52 条 是 多 态 , RA PD 每 个 引 物 的 平 均 带 数 为 919, (分子标记辅助选育 Mo lecu la r m a rke r2a ssisted se lec tion, A FL P的平均带数为 1119, RA PD 每个引物的平均多态带是 ) MA S通过检测与目标基因紧密连锁的分子标记 , 对育种 419 , A FL P的平均多态带是 616 , 说明改进的单酶切 A FL P材料从 DNA 水平上直接对基因型进行选择 , 可以大大提高 育种中选择 的 准 确 性 和 效 率 , 从 而 达 到 遗 传 改 良 的 目 的 。 它是现 代 分 子 生 物 学 与 传 统 遗 传 育 种 的 结 合 。近 几 年 来 A FL P标记已用于各个研究领域的遗传图谱构建 , 但却不能 [ 28 ] 提供高通量的基因型数据 。 SN P 已用于候选基 因鉴定和基 技术的重复性 , 可靠性 , 应用性都大大加强 , 且能用于 [ 29 ] 病原菌的快速鉴定 。 因型的高通量筛选 , 因此 , 从 A FL P 标记中分离出 SN P 会 提高 A FL P 标 记 的 应 用 范 围 , 适 于 标 记 辅 助 选 育 。已 有 412 SAM PL ( se lec t ive am p l if ica t ion of m icro sa t2 A FL P标记与 RA PD 转化成 SCAR 标记用于植物标记辅助选 e ll ite po lym orph ic loc i) 指纹技术 是在 A FL P基础上发展起来的一种指纹技术 。利用与[ 21 ] A FL P相同的模板并经过双酶切 、对应接头连接和预扩增 。 。并且利用 A FL P 转化成SCAR 标 记将更有利 育的报道 所用引物对中一个是 A FL P 选择性 引物 , 一个是包 含 一 段 于分子标记在选育中的应用 。 复杂微卫星序列的 SAM PL 引物 , 由于微卫星座位是基因组 313 基因定位克隆高变区 , 从而再对遗传变异低的样本进行分析 时 , SAM PL M ek sem 等将经过 A FL P分析的目的片段克隆转换 , 从分析就显得更加灵敏 、高效 , 能有效的显示关系较近的 基 2个大豆品种的 10 个 A FL P 标记 中分离出 6 个长 960 bp 的 因组 高 变 异 区 微 卫 星 位 点 的 不 同 , 评 估 种 群 内 遗 传 变 ( ) STS sequence2tagged site标记 , 这些 STS标记包含 8个插 入或缺失 , 2个微卫星 , 8个 SN P, 并与大豆的抗性基因有 [ 30 ] 异 。 Singh等对印度楝树采用 EcoR I/M se I共 10 对引物组 关 , rhg1 在 连 锁 群 G 上 , R hg4 在 连 锁 群 A上 , 克 隆 的 2 合进行 A FL P分析 , 产生 422 个扩增片段 , E2ACG ×M 2CTT A FL P带 用 于 PCR 再 扩 增 , 作 为 探 针 筛 选 大 豆 的 BAC 文 [ 25 ] 这对引物扩增出 54个片段 , 多态带占 44% , 但排除外来添 库 。这种方法为未知基因的定位克隆 , 提供了一种有效 ( ) 加种后只发现 22%的多态片段 , 而 GA TA T / M 2CTA 的 8 第 2期 王小玉等 : A FL P共显性标记的分离 、应用与 A FL P技术的改良 71 这对 SAM PL 引物组合共 有 61 个 扩增产物 , 89 %的扩增片 参考文献 : 段 是 多 态 , 因 此 其 检 测 出 的 多 态 百 分 数 比 A FL P 技 术 的 Zebeau M , Vo s P1 Se lec tive re stric tion fragm en t amp lification: A [ 1 ] [ 30 ] 高 。gene ral m e thod fo r DNA finge rp riting [ P ]. Eu rop ean Paten t App li2 ( ) cation N um ber: 9420262917 Pub lication No1 0534858 a1 1 Pa r2 413 TE2A FL P is: Eu rop ean Pa ten t O ffice, 19931 ( )TE2A FL P th ree endonuc lea se2A FL P 即 三 内 切 酶 扩 增 [ 2 ] Vo s P, Hoge rs R , B leeker M , et a l1 A FL P: new techn ique fo r DNA 的限制性长度多态性 , 是由荷兰科学 家 de r W u rff在 A FL P ( ) finge rp ringting [ J ]. N ucle ic A cid s R e s, 1995 , 23 21 : 4407 2 [ 31 ] 技术基础上发展起来的一种新的指纹技术 。用两种低频44141 () 率切点内切酶 通常为 6 碱基位点识别酶 和 1 种高频率 [ 3 ] 王志勇 , 王艺磊 , 林利民 , 等 1 福建官井洋大黄鱼 A FL P 指纹 () 切点内切酶 通常为 4 碱基位点识别酶 代 替了 A FL P 技 ( ) 多态性的研究 [ J ]. 中国水产科学 , 2002 , 9 3 : 198 22021 术的双酶切 , 但仍用两个接头连接 , 产生的片段只与低频 [ 4 ] H an K, E ly B1 U se of A FL P ana lyse s to a sse ss gene tic va riation in 率切点内切酶所切片段末端有共同粘性末端的 2 个人工接 ( ) M orone and Thunnus sp ec ies [ J ]. M a r B io tech, 2002 , 4 2 : 头连接 , 选择性扩增的引物 末端加上 1 ,2 个 选择性核 苷 141 21451 酸 , 使既能与接头粘性末端配对又能与引物的选择性核苷 [ 5 ] 王艺磊 , 戴 军 , 姚扬烈 1利用 A FL P技术筛选锯缘青蟹性别差 酸配对 的 限 制 性 片 段 得 到 扩 增 。这 种 方 法 可 以 减 少 传 统 ( ) 异 DNA 片段 [ J ]. 中国水产科学 , 2004 , 11 4 : 286 22901 A FL P技术中带的数量 , 提高复杂基因组的分辨能力 。肖兴 [ 6 ] Griffith s R , O rr K1 The u se of amp lified fragm en t length po lymo r2 国根据自己 的 理 解 和 与 发 明 人 的 个 人 通 信 讨 论 认 为 : TE2 () p h ism A FL P in the iso lation of sex2sp ec ific m arkers [ J ]. Mo2 A FL P经济 、快速和操作简单方便的特性将会比常规 A FL P( ) [ 32 ] lecu la r Eco l, 1999 , 8 4 : 671 26741 的应用更广泛 , 更 普及 。L ind sted t等采 用 B srG I和 X ba I [ 7 ] L i Y T, B yrne K, M iggiano E, et a l1 Genetic m app ing of the ku ru2 两种罕 见 限 制 酶 与 H in P1 I或 M se I常 见 酶 酶 切 , 将 X ba I2 m a p rawn Penaeus japon icus u sing A FL P m a rke rs [ J ]. A quacu l2 M se I和 X ba I2H inP1 I组合 , B srG I酶作为第二种罕见酶酶切 , [ 33 ] ( ) tu re, 2003 , 219 1 - 4 : 143 - 1561 当采用 X ba I - M se I时 , 扩增片段数由 14 增加到 20, 增 加了 A FL P标记的分辨能力 。 [ 8 ] J ia J H , L i C Y, D eng Q Y, et a l1 R ap id con structing a genetic A FL P标记的多态是通过限制位点的选择性碱基数来检 linkage m ap by A FL P techn ique and m app ing a new gene tm s5 测 , 对于大基因组物种而言 , 增加选择性碱基数可以减少 ( ) [ J ]. A c ta Bo tan ica Sin ica, 2003 , 45 5 : 614 - 6201 带的复 杂 程 度 , 但 是 一 些 小 基 因 组 的 物 种 若 采 用 传 统 的 [ 9 ] P iep ho H , Koch G1 Codom inan t ana lysis of band ing data from a A FL P分析将限制大量数据的产生 。 J am e s等利用选择性碱 dom inan t m a rke r system by no rm a l m ixtu re s [ J ]. Gene tic s, 2000 , 基数减少到 1或 0的改进技术 , 对草莓黑斑病进行 A FL P分 ( ) 155 3 : 1459 214681 析 , 当 EcoR I + 1碱基与 M se I + 3碱基组合时可产生足够的 [ 10 ] The in te rna tional SN P m ap wo rk ing group1 A m ap of hum an ge2 [ 34 ] 带 , E + 2与 M 2C 组合产 生 带 最 多 , 在 44 和 101 之 间 。 nom e sequence va riation con ta in ing 1142 m illion single nucleo tide 这种方法为小基因组的物种研究拓开了一条新的道路 。万 ( ) po lymo rp h ism s [ J ]. N a tu re, 2001 , 409 6822 : 928 29331 春玲等在上述单酶 切技术的基础上对 A FL P 技 术从限制性 ( ) [ 11 ] N icod J C, L a rgiadèr C R1 SN P s by A FL P SBA : a rap id SN P i2 内切酶水解 、扩增条件 、检测方法 3 方面又作了一些改进 , 采用 Pst I单酶水解基因组 DNA , 高温退火经过一次 PCR 扩 so la tion stra tegy fo r non2mode l o rgan ism s [ J ]. N uc le ic A c id s 增 , 扩增片段大多在 100,2 500 bp 间 , 小面积变性聚丙烯 ( ) R e s, 2003 , 31 5 : 1 251 酰胺凝胶电泳即可获得 丰富的多态性带 , 使得 A FL P 标 记 [ 12 ] B rugm an s B , H u lst R G M , V isse r R G F, et a l1 A new and ve r2 [ 35 ] 更简单 、经济 , 适于一般实验室研究 。 sa tile m e thod fo r the succe ssfu l conve rsion of A FL P m arkers in to 414 A FL P分离共显性标记的前景展望simp le single locu s m a rke rs [ J ]. N uc le ic A c id s R es, 2003 , 31 ( ) 10 : 1 - 9 1 A FL P分子标记技术已经在农业 、林业 、畜牧业 、水产 等诸多领域广泛应用 , 从其显性带中分离出的共显性带具 [ 13 ] Gao G Q , H e G H , L i Y R1 Moc ro sa te llite en richm en t from A FL P 有更加广泛的用途 。尽管 A FL P 技术存在对 模板质 量 要 求 fragm en ts by m agne tic bead s [ J ]. A c ta Bo tan ica Sin ica, 2003 , 较高 、谱带有可能发生错配和缺失 、成本较高 、实验操作 ( ) 45 11 : 1266 212691 技术较复杂等缺点 , 但在这种技术基础上演变出的改进方 [ 14 ] Zane L , B a rge llon L , Pa ta rne llo T1 Stra tegie s fo r m icro sa te llite iso2 法已越来越多 , 使 A FL P技术逐步完善 , 应用也更加灵活 , lation: a review [ J ]. Mo lecu la r Eco l, 2002 , 11: 1 - 161 相关方面的研究文献呈现逐年上升趋势 。A FL P技术的不断 [ 15 ] 高国庆 , H e Guo2hao, 李杨瑞 1 花生微卫星 DNA 分离方法的 改良和发展 , 将在遗传图谱的构建 、重要经济性状的定位 、 ( ) 研究 [ J ]. 中国油料作物学报 , 2003 , 25 3 : 30 - 331 基因表达 、微生物鉴定等方面有更广泛的用途 。 [ 16 ] W ong A , Fo rbe sM R , Sm ith M L1 Charac te riza tion of A FL P m a rk2 e rs in dam se lflies: p revalence of codom inan t m a rke rs and imp lica2 tion s fo r pop u lation gene tic app lica tion s [ J ]. Genom e, 2001 , 44 ( ) 4 : 677 - 6841 [ 17 ] Xu M L , H ua racha E, Ko rban S S1 D eve lopm en t of sequence2cha r2 ( ) ac terized amp lified region s SCAR s from amp lified fragm en t () length po lymo rp h ism A FL Pm a rke rs tigh tly linked to the V f gene ( ) in app le [ J ]. Genom e, 2001 , 44 1 : 63 - 701 1 Mod ification of the A FL P p ro toco l app lied to [ 27 ] Suazo A , Glenn H H ( ) [ 18 ] N a ir S, B en tu r J S, P ra sada R ao U , et a l1 DNA m a rke rs tigh tly honey bee A pis m ellifera L1 DNA [ J ]. 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