原肌球蛋白受体激酶在脑缺血大鼠各脑区的表达特性

原肌球蛋白受体激酶在脑缺血大鼠各脑区的达特性 原肌球蛋白受体激酶在脑缺血大鼠各脑区 的表达特性 上海交通大学(医学版) ' 746''JournalofShanghaiJiaotongUniversity(MedicalScience)Vo1.26No.7Ju1.2O. ? 【文章编号】0258—5898(2006)07—0746—04 '' , ? 基础研究?一一 原肌球蛋白受体激酶在脑缺血大鼠各脑区的表达特性 卞雷斯.刘振国.王文安 (上海交通大学医学院新华医院神经内科,上海200092) 【摘要】目的观察大鼠局灶性脑缺血后神经营养因子受体原肌球蛋白受体激酶(Trk)在大脑各区的表达特点,探讨其与缺血 损伤的关系.方法制作大鼠局灶性脑缺血模型,采用免疫组化方法观察急性缺血不同时间脑区Trk阳性神经元的动态改变. 结幂正常脑组织中Trk受体广泛表达,缺血后梗死中心Trk表达急剧下降,ld后完全消失;而半暗带及海马DG区Trk阳性神 经元自缺血6h开始显着增多(P<0.05),持续整个缺血期.海马CA1区于缺血ld后Trk表达开始缓慢升高;缺血侧的其他脑 区及对侧非缺血脑区也有Trk表达升高.结论缺血损伤可诱导脑内Trk受体表达广泛增加,与内源性神经保护机制有关. 【关键词】脑缺血;神经营养因子;原肌球蛋白受体激酶;免疫组化 【中图分类号】R743【文献标识码】A ExpressionPatternofTropomyosinReceptorKinaseafterFocalCerebral IschemiainRat t L BIANLei'si,LIUZhen'guo,WANGWen'an (DepartmentofNeurology,XinhullHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200092, Chin0)' Abstract:ObjecaveToinvestigatetheexpressionpatternoftropomyosinreceptorkinase(Trk)afterfocalcere— bralischemiainrat,andtoexploretherelationshipbetweenischemiaandthepatternofTrkexpression.Methods Themodeloffocalcerebralischemiawasbuihbymiddlecerebralarteryocclusion.Immunocytochemistrystainingwas usedtoobservethedynamicchangesofTrkexpressionatdifferenttimeofacutestageofischemia,andthepatternsat differentregionsofthestriateandhippocampalweredetected.ResultsTrkimmuno— positiveneuronswidelyex— pressedinthenormalbrain.ThenumberofTrkimmuno— positiveneuronswasdecreasedabruptlyinthenecrosiscore ofthefocalcerebralofischemia,whileincreasedobviouslyinthepenumbraregionandtheDGareaafter6hofOC— clusion(P<0.05),andexistedconsecutively.Theincreasingexpressiontrendwasalsodetectedinotherregionsof thebrain,includingthecontralateralnon— ischemiapart.Incontrast,thenumberofpositiveneuronsincreasedslowly intheCA1regionafterischemia.ConclusionIschemia.injurycaninducethewideexpressionofTrkinbrain.It mayberelatedtotheendogeneticneuro—protectivereaction. Keywords:cerebralischemia;neurotrophicfactors;tropomyosinreceptorkinase;immunoc ytochemistry 神经营养因子(neurotrophicfactors,NTF)是近年 来脑缺血研究中最活跃的领域之一,其主要生物学 效应是通过与靶细胞上的原肌球蛋白受体激酶(tro一'? pomyosin.receptorkinase,Trk)相互作用而产生的. Trk是原癌基因trk编码时一种单跨膜糖蛋白,是受 【基金项目】教育部留学回国人员科研启动基金和上海交通大学医学 院新华医院医学人才后资助项目?? 【作者简介】卞雷斯(1979一),男,回族,上海人,硕士生 【通讯作者】刘振国,E-mail:zhenguoliu2004@yahoo.com.ca 体酪氨酸激酶超家族成员之一,在中枢神经系统内 分布广泛.NTF是其天然配体,Trk膜外段与之结合 后能触发神经细胞内的抗凋亡信号转导系统,促进 细胞生存,分化,对于脑缺血损伤有重要意义本实 验采用免疫组化方法研究了Trk受体在大鼠局灶性 脑缺血后的表达情况,探讨其与缺血损伤的关系,为 进一步研究Trk受体在脑缺血中的治疗作用奠定理 论基础 卞雷斯,等:原肌球蛋白受体激酶在脑缺血大鼠各脑区的表达特性 与方法 动物分组健康雄性清洁级SD大鼠41只,体质 量250,300g,由上海西普尔一必凯实验动物公司提 供,生产许可证号:SCXK(沪)2002—0010,使用许可证 号:SYXK(沪)2003-0031.随机将大鼠分为正常对照 组(c组)3只,假手术组(s组)3只,持续脑缺血2h 组(I2h组),缺血6h组(I6h组),缺血12h组(I12h 组),缺血24h组(I24h组)和缺血72h组(I72h组), 每组7只,6只进行免疫组化,1只行Trc染色. 大脑中动脉阻塞模型的制备参照Longa等 的线栓法制备右侧大脑中动脉永久缺血模型.颈前 正中切口,暴露颈总动脉分叉,从颈外动脉逆行插入 4/0尼龙丝线入颈内动脉,深度为(18.0?1.0)mm, 遇阻即止,阻塞大脑中动脉起始部,各组栓线插入后 不再拔出.s组插入栓线后重新拔出,其余步骤同各 缺血组.以动物清醒后出现向左转圈(追尾现象), 提尾时左前肢内收屈曲为模型成功入选. 脑组织处理及TTC染色各组大鼠给予10%水 合氯醛过量腹腔麻醉,经心脏灌注生理盐水100mL和 4?,4%多聚甲醛300mL后断头取脑,相同固定液后 固定8h,石蜡包埋切片.取Bregma点(前囟点)的纹 状体平面以及背侧海马平面切片,片厚2,5m.各 组随机取1只大鼠麻醉后心脏灌注生理盐水100mL, 立即断头取脑,切片机切成2mm厚脑片后,2%Trc 避光,37?孵育30rain,观察模型制作情况.? 免疫组化染色石蜡切片脱蜡入水,3%H.0.封 闭内源性过氧化物酶,乙二胺四乙酸二钠中微波加热 修复15rain.l%牛血清白蛋白封闭后滴加Trk(c- 14)'多克隆抗体(1:200,SantaCruz),4?孵育过夜后, 采用sP法,生物素标记山羊抗兔IgG,辣根过氧化物 酶标记链霉卵白素,咨孵育30rain,DAB显色.磷酸 缓冲液代替一抗作为阴性对照. 图像分析每组于纹状体平面取6份标本,观 察外侧尾壳核(LI;Pu),顶叶半暗带皮质(Penum Cort),对侧壳尾核(ContrCPu),对侧顶叶皮质(Contr Pail),同侧隔核(IpisolSept)等部位.背侧海马平面 取6份标本,观察同侧海马CA1区,海马齿状回 (OC),同侧丘脑(IpisolThai),杏仁核(IpisolAmyg) 等部位.各观察区随机取5个不重叠视野,于高倍 镜(400×)下观察,采用Olympus-IX50成相系统拍 摄,Image-ProPlus5.1图像处理软件对免疫组化Trk 阳性细胞进行计数. 统计学处理所有数据采用SPSS11.5软件进 行统计学处理.实验数据均以i-I-s表示,进行单因 素方差分析(ANOVA). 结果 TTC和免疫组化染色TTC孵育30rain后,肉 眼观察到缺血区呈白色,非缺血区呈红色(图lA). 在正常对照组脑组织中,除了胼胝体以及某些神经 传导束外,大部分脑区如顶叶皮质(图lB),纹状体 (图1C)都有Trk受体的广泛表达,阳性染色主要存 在于神经细胞胞膜和胞浆.s组与c组相比,Trk表 达无统计学差异(P>0.05).在纹状体平面上,I6h 组外侧纹状体梗死中心Trk阳性神经元数量急剧下 降(图1D),在I24h组中完全消失.半暗带皮质(图 1E,F),纹状体(图1E,G)Trk阳性神经元在缺血I6h 组中开始显着增多(P<O.05),且染色较深.未发生 梗死的对侧尾壳核,顶叶皮质及隔核,在缺血ld后 Trk阳性细胞数也开始升高(表1). 在海马平面,正常基础状态下DG区Trk受体的 表达要高于CA1区,缺血6h后DG区神经细胞Trk 表达明显增多(P<0.O1),染色较深,这种高表达持 续整个缺血期(图2,表2);而CA1区的锥体细胞于 缺血ld后才开始缓慢升高,迟于DG区,且趋势不 如DG区明显.随着缺血时间的延长,.DG区和CA1 区Trk阳性细胞数呈上升趋势(图3).在缺血同侧 的丘脑也有Trk表达的升高,相比之下杏仁核Trk升 高趋势不明显. 表1纹状体平面备区lrrk阳性细胞数(i.i-l,n) Tab1Trkimmuno?positiveneuronsnumberofdlllTerenlrqonsinstrlate矗?do雎(i.i-l,n) Group.LCPuP吼umCortContrCPuCoritrPariIpi~olSept C(n=3) S(n=3) I2h(n:6) I6h(n=6) I12h(n=6) I24h(n=6) I72h(n=6) 27.73?3.4o 28.67?3.25 29.1O?5.74 1O.17?4.71" 5.97?3.66" 0.00?0.00'' 0.00?0.00'' 30.33?3.33 , 3O.87?3.83 33.o3?5.17 40.73?6.11 51.23?7.09" 54.27?6.21" 57.53?5.02" 'P<O.05...P<O.01协groupC 26.2O?3.33 27.47?3.49 29.O3?4.51 31.70?6.5O 32.47?7.11 40.23?6.33'' 41.53?6.29" 30.6o?3.54 32.33?4.92 33.70?5.51 35.67?6.15 36.73?5.65 41.23?6.39' 43.97?6.16" 29.33?4.16 28.53?3.13 30.40?4.5O 32.O3?5.43 34.53?5.11 37.O7?5.76' 41.23?6.15" 目l特面Trk胞rrc Fl曼lrrkLmmuuo-poMti~en…nsI耵tnDctInnh?m. ^:Enl__1日B. |lJ}…jInlI4?.f=rl?lI口…l?1p…'…00.1)…h_=?1nmhIlxlIm+Kl川j'T…P… mll? l6h"1p×j0".:,a】pnmhm…hl】nxn?.I,:I1】Iid1…l_|"1.1nl}'mmhPx100 目2*单?磷mTrk口寰u^H F_譬2TrktmfllU~Opositiveneu…hipp~ampalsccll0nDAB…m ^?…?CAB+L^IillIh,(-:…a】l1L,T':I1(?…bl'P 2#?Errk阳性骨自{?,-/ Tab2Trk[mmu~o-positiven……umh…fdli~erentg10n5In hippoc~pol~~tlon{i?nl ~nJUlJf:^】DI,?1111Anlv~ (c1}?3}?m47{4302?4 =)27?lrir)27?4I27?m??4 ?_=n13/3?4?】007?nf167?S3S?5m mh"=61:t自J??z?6.?3l77???5 112hf=n19/?bm72s;t29一?nH?7O?5? 124h=…17?0mh?f,:{_,?7?h' 172hf=)4:"l"72"'32'??117 ' (n05一,,<0……I)L ?3DGCAI1rk变趋 Fig3C~qng]ngtrendof1rklmm…po~ith~n……lnCA r0nandD':regJo~ 卞雷斯,等:原肌球蛋白受体激酶在脑缺血大鼠各脑区的表达特性 讨论 Trk是NTF的天然受体,有TrkA,TrkB和TrkC 三个亚型.基底前脑的胆碱能神经元大部分表达 TrkA,基底前脑,海马和新皮质都有广泛的,高水 平的TrkB和TrkC表达.NTF与Trk通过膜外段 结合,形成二聚体,触发胞内酪氨酸蛋白激酶磷酸 化,其中羧基肽端的Y490位点是最重要的接合器蛋 白结合点,能启动AKT,ERK等存活信号通路,Trk 受体作为这些信号通路的上游启动因子,能促进生 理及病理情况下神经细胞的生存,分化.本实验所 用Trk(C-14)抗体针对所有Trk亚型胞内的羧基肽 端,反映了缺血时有功能活性的Trk总体变化. 大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型中,外侧尾壳 核为梗死中心,顶叶皮质上部的脑血流量只有轻度 下降,为缺血半暗带等值区.梗死中心Trk阳性神经 元于缺血后急剧下降,说明3种亚型受体在缺血中 心坏死神经元中普遍缺失,而半暗带皮质阳性神经 元自缺血6h开始显着增多(P<0.05),这与Lee 等以及国内王佩等的研究结果较为一致.虽 然海马处于大脑中动脉主要供血范围区域外,但在 MCAO模型中由于Willis环部分受阻以及脑水肿等 原因,造成同侧海马的血供部分下降.海马CA1区 是缺血易损区,而DG区相对耐受.本实验中观察到 基础状态下DG区Trk受体的表达要高于CA1区,缺 血后Trk表达增加快于CA1区,且增加趋势明显. Hu等曾用磷酸化特异性抗体研究,发现脑缺血复 灌后ERK通路及其上游的Trk受体在存活的DG细 胞中磷酸化激活增加,明显高于海马CA1区,在CA1 区则存在JNK死亡通路的激活,这与本研究结果吻 合,并且Trk受体数量的增加正是DG区Trk磷酸化 激活增加的前提和基础.以上这些都说明了损伤刺 激后Trk信号系统的激活是机体内源性保护机制之 一 ,有助于缺血耐受细胞以及半暗带濒死细胞抵抗 凋亡.另外本研究表明除了半暗带以外的非缺血脑 区,包括对侧的皮质,纹状体,同侧的丘脑,杏仁核等 也有Trk受体表达增加,说明缺血对周围区域细胞抗 凋亡能力增强的影响是广泛的.但是目前对Trk受 体缺血上调的机制尚未完全阐明,推测可能与缺血 时内源性NTF配体的相对缺乏有密切关系. 与NTF相比,目前对其受体Trk的研究相对较 少,由于NTF的生物学活性大多数是通过Trk受体 介导的,因此对Trk的表达激活模式以及其与脑缺 血关系的研究有重要价值.在缺乏任何外源性干预 的情况下,内源性神经保护作用有限,如何通过药物 干预启动Trk信号途径,挽救半暗带神经细胞有待于 进一步研究. 【参考文献】 [1]LongaEZ,WeinsteinPR,CarlsonS,eta1.Reversiblemiddlecere bralarteryocclusionwithoutcraniectomyinrats[J].Stroke,1989, 20(1):84-91. [2]HuangEJ,ReichardtLF.Trkreceptors:rolesinneurons]signal tranaduction[J].AnnuRevBiochem,2003,72:609—642. [3]HoltzmanDM,KilbridgeJ,LjY,eta1.TrkAexpressioninthe CNS:evidencefortheexistenceofseveralnovelNGF.responsive CNSneurons[J].JNeuroaci,1995,15(2):1567—1576. 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