纳豆激酶的表达与复性的研究（可编辑）

纳豆激酶的表达与复性的研究（可编辑） 纳豆激酶的表达与复性的研究 兰州大学 硕士学位论文 纳豆激酶的表达与复性研究 姓名:蒋凡 申请学位级别:硕士 专业:生物学 植物学 指导教师:谢小冬 20080501 兰州人学硕上学位论文 纳豆激酶的表达Ij复性研究 摘要 纳豆激酶基因表达产生的具有高效、安全的溶栓活性的蛋白激酶。在纳豆激酶的表达研究中一直 存在这样的争议问:在不含前导肽辅助的情况下，纳豆激酶包涵体是否能通过常规复性方法正 确折叠复性。而且争论双方对纳豆激酶复性的具体方法很少提及。分析前人的表达方法后我们提 出这样的问题:是否纳豆激酶N端融合的各式各样的多余序列影响了纳豆激酶成熟肽的正确折叠 复性? 任何冗余序列以减少对蛋白折叠的影响，同时C端融合His??Tag以利于纯化复性。使用透析和稀释 两种复性方法加上各种添加剂的组合，对经过尿素变性和亲和层析纯化后的包涵体进行复性，以 研究在无前导肽辅助以及N端冗余序列的影响，常规复性方法和复性添加剂是否能使纳豆激酶正 确折叠复性，为长久以来的争议问题提供某方面的证据。 本研究结果如下: 1(构建了纳豆激酶N端不含冗余序列而C端融合His-Tag的原核表达载体pET-42b-NK。 2(获得了高效表达纳豆激酶包涵体的菌株BL21以及高效诱导方法，目的蛋白表达量约占菌体总 蛋白的30,。 3(建立了包涵体分离以及亲和层析纯化等一整套方法，可一步纯化得到高纯度的目的蛋白。 ’4(纳豆激酶的复性研究表明，在无前导肽辅助以及N端冗余序列的影响，透析和稀释两种复性 方法加上各种复性添加剂的组合不能使纳豆激酶正确折叠复性，论证支持了在不含前导肽辅助 的情况下，纳豆激酶包涵体不能通过常规复性方法正确折叠复性的观点。 为了获得高产量、高活性的纳豆激酶，需要采用其它方法，如，表达出前导肽作为复性促进 剂，或使用易错PCR方法对纳豆激酶进行序列突变，筛选出不需要前导肽就能正确折叠的纳豆 激酶突变体。 关键词: 溶栓药物:纳豆激酶;基因表达;包涵体;蛋白复性;复性添加剂 兰州人学硕十学位论文 纳豆激酶的表达‘j复性研究 Abstract Nattokinase thenattokinaseinBacillus obtainedfromthetraditional producedby gene subtilis，is food foundtobea andsafe natto，and fibrinolyticenzyme(Thecontroversy Japanesesoybean strong existsinthe ofnattokinasewhetherthe theinclusion refold always expression nattokinase，as body,can the the ofthe ofwhich correctlythroughregularrefoldingmethods，withouthelp leadingpeptide，both littlehintaboutthe methodsof the give refolding nattokinase(Throughanalysingprevious specific methodsof forwardthe whethertheissueliesinthevarious nattokinase，we expression put question redundant risetothedistinctinfluencesonthe peptides，whichmightgive refolding( Giventheissue vector wasconstructedwithNdeIand above，the Xhol， expressionpET-42b-NK to nattokinase IransformedintoBL2 inducedIPTG the astheinclusion 1，and by produce body(Basing of Cterminalofthe nattokinaseWasbindedwith onthecharacteristics pET-42b，the expressed His-Tag tofacilitatethe and thesametimetheredundantoftheNterminalWas purifyingrefolding,at peptides removedtominimizeits bade仃Iectonthe thenattokinasefromtheinclusion possibly refolding(After WaSdenatured methodsof urea,and affinity body by purifiedthrough chromatography,therefolding additionof torefoldthe and withthe various dialyzingdiluting refoldingadditives，wereapplied the andtheinfluenceoftheredundant nattokinaseto thatwithoutthe of study help leadingpeptide N the methodsand additivesCallrefoldthe oftheterminal，whetherregularrefolding refolding peptides nattokinase an ofsomekindaboutthe issue( correctly,togivecontroversy lasting wereasfoIlows: Theresults 1(The vectorWasconstructed theCterminalofnattokinase expressionpET-42b-NK successfully,with bindedwith theNterminalnotwith redundant His―Tag，and any peptides( 2(The effective strainofE(coli(BL21 andinductivemethodwereobtainedtoproduce highly expression nattokinaseastheinclusion accountsfor30,ofthetotal body,which proteins( 3(A ofmethodsabout theinclusionand with were set chromatography isolating bodypurifyingaffinity establishedtoobtainthe wih one highlypureproteinonly step( 4(The ofthe ofnattokinaseindicatesthatthe methodsand study refolding regularrefolding refolding additivescannotrefoldthenattokinase the ofthe andthe correctly,withouthelp leadingpeptide influenceoftheredundantoftheN tothe peptides terminal， whichgivessupportoppositeargumenL U 兰州人学硕士学位论文 纳豆激酶的表达0复性研究 Inordertoobtainthenattokinasewith and methodswere activity,other hi曲productionstrong all thenattokinase as the toworkas needed。such additive， ormutating expressingleadingpeptides refold withoutthe ofthe error PCRto the call throughprone get mutant，whichcorrectly help leading peptides( s Key Thrombolytic，Nattokinase， GeneExpression,InclusionBody，ProteinRefolding， Additives Ill 兰州人学硕上学位论文 纳豆激酶的表达与复性研究 原创性声明 本人郑重声明:本人所呈交的学位论文，是在导师的指导 下独立进 行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成 果、数据、观点等，均己明确注明出处。除文中已经注明引用的内容 外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文 的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名:二箱忙 El 兰州大学硕十学位论文 纳豆激酶的表达与复性研究 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属 兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定，同 意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许 论文被查阅和借阅;本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学 位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论 文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名:(』k导师签名:j幽幺日 兰州大学硕士学位论文 纳豆激酶的表达1j复件研究 1前言 1(1血栓形成与体内纤溶系统 心脑血管疾病严重威胁着人类的生命与健康，是中老年人群的高发疾病，是对死 亡威胁最大的疾病之一，其死亡率居于前3位，其中以血栓病的发病率、致残率和死 亡率最高。常见的血栓病有心肌梗塞、脑血栓、中风、肺梗塞、肢端疼痛、局部水肿 和弥漫性血栓等。全世界每年心血管病死亡人数约1300万，仅美国心肌梗死 AMI 人数即为150万，约1,3致命，占美国疾病总死亡率的30,; 据卫生部统计，我国心 脏病和脑中风死亡率也很高，1975,1995年分别占总死亡率20,左右【l】。 正常情况下，血液的凝血和抗凝血两个过程是处于动态平衡的，只有在一定条件 下才有血栓形成的可削2】: 1 心血管内膜 内皮细胞 损伤:这是最重要的条件， 多见于动脉粥样硬化、高血压、高胆固醇、细菌毒素作用、免疫损伤及外伤、炎症等 情况下; 2 血流变缓或涡流:血流缓慢 如静脉曲张时 或涡流 如动脉瘤时 ， 使血小板有更多的机会与内皮细胞接触，使肝脏清除激活的凝血因子机会减少; 3 血液凝固性增高:肾病综合征、糖尿病、心力衰竭、风湿性心脏病、大面积烧伤、大 手术后、产后、晚期妊娠、恶性肿瘤全身播散、长期卧床、长期使用雌激素等情况， 常导致血液容易凝固，这称为高凝状态。 在人和哺乳动物血液中都有一个纤溶系统 图1 ，它担任溶解血栓和保护伤口防 止出血的双重作用。体内纤溶系统是一种平衡调节器，由体内的纤溶作用和抗纤溶作 用来保持这种平衡，以免因失去这种平衡而导致疾病的发生。在纤溶酶原激活剂 PA 的作用下，纤溶酶原 聘 转变成纤溶酶 Pm ，后者将血块上不溶的纤维蛋白 F 降解为可溶性的产物，从而使血栓溶解。血液中有两种PA，一种是来自血管内皮细 胞的组织型纤溶酶原激活剂 t(PA ，另一种是有肾细胞分泌的 单链尿激酶纤溶酶原 激活剂 sou(PA ，正常情况下，血液中只存在少量PA，生成微量Pm，而纤溶酶原激 的平衡【31。当机体出血时，通过形成纤维蛋白完成止血过程。但是，如果纤维蛋白长 期存在于血管内，就会引起血管内腔狭窄、闭塞和末梢功能障碍，发生血栓性疾病。 兰州大学硕I:学位论文 纳豆激酶的表达与复性研究 纤溶酶原激活剂 PA I 卜一纤溶酶原激活剂抑制剂(1 PAl(1 纤溶酶原 Pg ――!_纤溶酶 Pm l+一0[2-抗纤溶酶 a2-AP 纤维蛋白 F ――-纤维蛋白降解产物 图1 纤溶系统示意图 杜平中，1998 Theschematicofthe diagramfibrinolytic Fig(1 pathway 1(2溶栓药物 目前采用的抗血栓药物分3类: 1 抗血小板药; 2 抗凝血 药物; 3 溶血栓 药物。其中溶解血栓是目前治疗这一类疾病的重要手段，所需的 溶栓剂的潜在市场约 20亿美元[41。理想的溶栓药物，应该是高效、特异性强、半衰期长、副作用小、无抗 原性、给药方便以及价格合理等。 目前临床使用的溶栓药物是通过激活血液中的纤溶酶原形成纤溶酶从而降解纤 维蛋白而间接地起作用，实际应用中，它们普遍存在着稳定性差、药效短、副作用大 和成本高等缺剧31。如第一代的链激酶 SK 和尿激酶 UK ，缺乏特异性易导致病 人产生全身性内出血，具有抗原性易造成过敏反应，在血液中的半衰期很短 3,20 min 必须长时间的滴注用药13】。第二代的溶栓药物包括人组织型纤溶酶激活剂 造和筛选，提高了特异性和半衰期和降低了抗原性疗效较好，但副作用大且价格较为 昂贵。 第三代溶栓药物是对组织型纤溶酶原激活剂 t(PA 进行改造而获得的新的 PA产品，包括瑞替普酶和多种重组嵌合体等，它们在特异性、溶栓效率及副作用方 面都有很大的提高，但目前大部分还处于实验阶段，虽疗效较好，但价格昂爿51。因 此，国内外在治疗血栓病方面正向低价高效、易吸收、体内半衰期长以及可以口服的 药物或保健食品方向发展。开发出高效、低毒、价廉且适合我国国情的的新型溶栓药 物，仍然是摆在我国医药科研工作者面前的一项艰巨任务，成为当前重要研究课题之 一，它既有意义深远的社会效益又有巨大的经济效益。 近年来，在开发研制第三代以及第四代溶栓药物的同时，人 们也逐渐在寻找一些 安全性好、副作用小、疗效好的天然来源的药物，同时将其转为基因工程产品。现已 开发的天然药物主要有葡激酶、溶纤酶、纳豆激酶等。其中葡激酶和溶纤酶来源相对 2 兰州大学硕上学位论文 纳豆激酶的表达与复性研究 较少，而纳豆激酶来源较广，可以通过发酵生产，且弥补了目前临床使用的溶栓药物 的不足，极具开发成新一代溶栓药物的潜力【2,6--7】。 1(3纳豆激酶 1(3(1纳豆激酶的溶栓活性 日本传统食品纳豆在日本已有上千年的安全食用历史，它是通过是把煮熟的大豆 用稻草包起来、在40?温度下发酵而成。纳豆表面白色，用筷子搅拌会拉起长长的 丝，并散发出臭豆腐一样的味道。1987年日本学者须见洋行等【_7】首次从纳豆中发现 subtillis 豆发酵过程中由纳豆杆菌 BacillushalO 产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶。研 究发现【8~121，纳豆激酶具有很强的溶解纤维蛋白作用，能显著地溶解体内夕Frtn栓，降 低血液粘度、降血脂、降胆固醇，改善血液循环状况，维持血细胞的正常形态和功能 等多种生理功能。研究表明，纳豆激酶的溶栓效果远大于纤溶酶 和弹性蛋白酶，活性 21。 是纤溶酶的4倍【11,1 大多数溶栓药物，如链激酶、尿激酶、t-PA等都是纤溶酶原激活剂型，均需通 结合发挥溶栓作用，而其自身不能直接作用于纤维蛋白【13~141。而纳豆激酶对纤维蛋 白尤其是交联形式的纤维蛋白本身更加敏斛15l，可直接将其水解成小肽和氨基酸发挥 直接溶栓作用 图2作用A ，当把酶提取液滴加到纤维蛋白平板上，短时间内即可出 现透明的溶解圈，体外溶栓效果显著。同时激活尿激酶原 pro(UK 转变为尿激酶一~101 图2作用B ，使内源性纤溶酶量和活性间接增强。并能激活 体内血管内皮细胞产生 纤维蛋白溶酶原激活剂 t(PA 从而增加内源性纤溶酶的量与作用【8】 图2作用C 。 此外，将纳豆激酶应用于狗的血栓模型实验及健康人群的体内研究[9,11】，表明其不仅 可以抑制血栓的形成，还可迅速降解纤维蛋白，增加纤维蛋白降解产 FDP 的量， 明显缩短血浆中的优球蛋白的溶解时间 ELT ，提高优球蛋白的纤溶活性 EFA ， 并能降低PM等纤溶酶原激活因子抑制子的活性【161，从而激活静脉内皮细胞，引起 t-PA的继发性增加 图2作用D 。 兰州大学硕士学位论文 纳豆激酶的表达与复性研究 埔”蠢_ 1 0 Q (，一―叶、 PAI(I 一厂„，，、、坠鸶,嗍„、 , 由竹内 k外删夕f『入 4„, 竣嘲飘 钉带謦 鲰蠡 麓蟓 八 I ‘ 1r ' 、 _ l t(，魄 鼍 1 _1( 嗣穗 l I | 焖瓢 图2纳豆激酶溶栓机制示意图 陈丽娟等， 2003 A(直接溶栓;B(通过激活尿激酶原溶栓; C(通过激活血管内皮细胞产生t―PA溶 栓: D(通过抑制PM-1活性溶栓 Theschematicofthe mechanismofnattokinase Fig(2 diagramfibfinol”ic 八Direct thmmbolysis; B(Thrombolysisbyactivatingpro-OK; vascularendothelial the cellsto C(Thrombolysisbyactivating producet-PA; the ofPAI-1 D(Thrombolysisbyinhibitingactivity 与目前临床常用的溶栓药物相比，纳豆激酶具有很多优点 【11-12,17】: 1 在体内的 半衰期长，溶栓效率高; 2 来源于食品、安全性能好; 3 分子量小，是一个单链 蛋白质，在胃肠内稳定可由消化道直接吸收; 4 由于纳豆激酶发挥溶纤作用时不水 解血浆纤维蛋白原，不易引起出血; 5 来源与传统食品且可由发酵生产，成本低。 纳豆激酶来源于传统发酵食品，生产工艺简单，无副作用，安全性高，完全符合治疗 血栓病的药品或食品基料的要求，所以纳豆激酶可用于预防和治疗心脑血栓、脑中风、 老年痴呆症等，极有希望开发成为新一代的治疗血栓的药物。 1(3(2纳豆激酶的理化性质 对纳豆激酶的理化分析【18l表明，纳豆激酶是由275个氨 基酸组成的单链多肽，不 含半胱氨酸和二硫键，蛋白分子量27(7 4-0(3。纳豆激酶含 kD，等电点 pI值 8(6 有8个赖氨酸残基，肽酶可将其水解成9个小肽，该酶的活性部 位在Asp32、His64、 和His(Leu位点【181。 对纳豆激酶活性和稳定性产生影响的因素有pH值、温度、 金属离子和有机物等 【19~24】: 4 兰州人学硕十学位论文 纳豆激酶的表达弓复性研究 7―9 1 酶最适pH8(0，室温下，在pH4(0~12(0范围内酶活性基本稳定，在pH d 之久。带粘质 多 6(3,10(8范围内其活性可持续近40 范围内酶活性最为稳定，在pH 3时仍有活性，说明该酶具有很强的耐酸性而能通过肠道 聚谷氨酸 的粗酶液在pH 直接吸收。 2 酶在25--45?内的纤溶活性变化不大，但是温度超过60?时，其纤溶活性 逐渐丧失，在40?下将纳豆激酶放置48llr后仍保持约78,的纤溶活性，在4?下 放置6个月以及室温放置1个星期未见纤溶活性明显下降，说明纳豆激酶具有较好的 llr 热稳定性。但液态酶在(20?下放置3个月纤溶活性损失90,，(80?下冷冻2(5 其活力下降约30,。反复冻融对纳豆激酶纤溶活性影响不大，反复冻融五次酶活性 仍可保留95, 。 对其有抑制作用，Hg离子使纳豆激酶完全失活。 4 酶纤溶活性可被0(1mmol,L的PMSF完全抑制，lmmol,L的EDTA和2, SDS对纳豆激酶活性无任何抑制作用。 5 添加甘油、丙二醇、牛血清蛋白、蛋白胨、明胶、蔗糖、香精和海藻酸钠 等可促进酶活性和提高酶热稳定性。煮沸的米汤、小麦提取液、肉汤或胃黏液与酶混 合后也可以明显提高该酶的稳定性。 1(3(3纳豆激酶基因及其表达研究 到包括调控序列在内的NK全长基因，并对1473bp的NK全长基因序列进行了分析。 该基因以GTG为起始密码子，随后是由1143bp组成的阅读框架，编码29个氨基酸的 信号肽，77个氨基酸的前导肽和275个氨基酸的成熟肽，共381 个氨基酸，其结构 环结构，起始密码子上游1 含量高达72,的转录调控区域125】。NK与大多数枯草杆菌素核苷酸序列及氨基酸组成 上具有高度同源性【1引。 NK信号肽包含一个带3个正电荷的亲水氨基端以及一段不带电荷的疏水残基序 列，其切割位点位于Ala(Glu(Ala保守序列之后。在信号肽与成熟肽之间有一段231个 核苷酸编码的前导肽序列，推测其可作为分子内伴侣，在NK的分泌过程中辅助蛋白 5 兰州大学硕Ij学位论文 纳豆激酶的表达与复性研究 的正确折叠。在细胞分泌蛋白酶之前先在胞内合成无活性的酶原，分泌到胞外的同时， 利用自身酶活性切去前导肽部分成为有活性的蛋白酶。目前己发现一些与NK基因同 源的枯草杆菌素蛋白及链激酶有与此相似的前导肽区域。 自从Nakamura等首次克隆了纳豆激酶基因并测定了全基因序列，使得利用基因 工程技术提高纳豆激酶活性及产量成为可能。近年来，我国掀起对纳豆激酶的研究和 开发热潮【2?31，已经从不同菌株中克隆了纳豆激酶成熟肽基因并在大肠杆菌、枯草 杆菌和酵母菌中的表达，但表达活性方面一直有争议 表1 ，其中部分研究者报道在 不含前导肽时表达的分泌型重组纳豆激酶和经过复性的包涵体 型重组纳豆激酶均有 溶栓活性，而另一部分则报道分泌型和包涵体型不能获得活性; 也有将前导肽和成熟 肽的纳豆激酶原基因克隆并在大肠杆菌、枯草杆菌和酵母菌中实 现可溶性、包涵体型 和分泌型表达，表达产物均有活性 表2 。 表1纳豆激酶成熟肽基因的表达比较 TableI The ofthe ofNK comparationexpressions gene 6 兰州大学硕L学位论文 纳豆激酶的表达与复性研究 表2纳豆激酶原基因的表达比较 Table2The ofthe of comparationexpressionspro-NKgene 1(4高效表达形成包涵体 1(4(1包涵体形成原因 利用分子生物学技术导入原核表达系统 E(coli( 的外源 基因，在超量表达的情 况下，表达的蛋白产物会在细胞内凝集，在胞质中形成无活性的 固体颗粒状，这个无 活性的固体颗粒就称作包涵体。 包涵体【州5】一般含有50,以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、 脂多糖等，大小为0(5―1?m，具有很高的密度 约1(3mg,m1 ，无定形，呈非水溶性， 只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。 包涵体形成的原因主要是高水平表达的结果。动力学模型【45461表明:活性蛋白的 产率取决于蛋白合成的速率、蛋白折叠的速率、蛋白聚集的速率 如图3 。在高水 平表达时，由于在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不 适，无法形成正确的次级键等原因，新生肽链的聚集速率超过蛋白正确折叠的速率导 致包涵体的形成。 7 兰州大学硕士学位论文 纳豆激酶的表达与复性研究 图3包涵体形成示意图 方敏等，2001 Theschematicoftheformationofinclusion Fig(3 diagram body 1(4(2包涵体表达的优点 1 包涵体表达可以避免宿主细胞内蛋白酶对外源蛋白的 降解。如果重组蛋白 质以包涵体形式存在，由于包埋了酶攻击的位点，可以最大限度 地抵抗蛋白质酶的攻 击，而可溶性的外源蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击。 2 有利于目的蛋白表达量的提高。由于表达的目的蛋白呈固体颗粒状态，降 低了胞内溶解的外源蛋白的浓度，不会形成反馈抑制，有利于表达量的提高。 3 有利于目的蛋白的分离纯化。包涵体表达的蛋白质没有活性，细胞破碎和 以后的纯化步骤，不用考虑蛋白质的失活问题。包涵体对机械搅拌和超声破碎不敏感， 易于与宿主细胞壁和细胞膜碎片分离。包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低 速离心就可以与可溶性蛋白分离。包涵体形式表达的蛋白质与宿主细胞的其他蛋白质 的分离比可溶蛋白质的分离方法简便，造价低，使用简单的离心或者过滤的手段就能 ‘ 使包涵体与宿主细胞的其他蛋白质成分进行有效的分离。 4 能表达对宿主有毒害的蛋白。有些表达的外源蛋白质对细胞有毒性或者致 死，大量表达时会导致细胞的死亡，最终的细胞数量和产物相当低，而包涵体形式的 蛋白质由于丧失了生物活性从而可以高效大量地表达。 1(4(3包涵体表达的瓶颈 随着基因工程技术的迅猛发展，人们越来越多地通过蛋白质的异源表达为临床和 工业生产提供一些蛋白质多肽产品。迄今为止，E(coli(以其易于操作、遗传背景清楚、 发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，依然是生产外源重组蛋白 的首选表达系统，尤 其适合表达不经过蛋白质翻译后修饰 如糖基化 就具有生物活性的基因工程蛋白。 但是E(coli(中高表达蛋白常常以没有生物活性的包涵体形式沉积于细胞内，虽然 包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复 8 兰州人学硕士学位论文 纳豆激酶的表达1i复性研究 性率一般都很低，只能部分复性，这大大增加了基因工程蛋白质产物的成本。包涵体 蛋白的复性是一个世界性的难题，如何高效地复性蛋白是基因工程蛋白生产过程中最 关键和最困难的一步，已经成为基因工程产品产业化的一个瓶颈。 包涵体中重组蛋白的复性是下游技术中最难解决的问题，由于变性的包涵体蛋白 内部疏水核的暴露，使蛋白质在重折叠过程中易于聚集，成为蛋白复性率低的主要原 因【4?71。目前的技术难点是溶解包涵体然后除去变性剂，以使重组蛋白再折叠 refolding 成活性形式而无蛋白质聚集，这对于那些二硫键数目较多的重组蛋白尤 其重要。 对蛋白质折叠过程及其机理的深入研究与理解是解决重组蛋白体外复性的重要 基础。今天，对蛋白折叠和它的副反应机理的了解，使得设计复 杂蛋白的复性过程成 为可能。然而，不同蛋白的复性过程不同，特异的复性环境，包括缓冲液的组成、蛋 白浓度、温度、pH等应根据蛋白的不同而掣4引。 随着人来基因组的完成，随着越来越多的功能基因被发现和克隆，蛋白质异 源表达将会越来越受到重视，人们对重组蛋白的需求量将不断增加，大肠杆菌以其独 有的优势仍然是目前应用的最为广泛的表达系统之一。由于包涵体中富含重组蛋白， 且包涵体易于分离纯化，只要能够在体外成功复性，将是大量生产重组蛋白最有效的 途径之一。 1(4(4包涵体蛋白的复性 1(4(4(1包涵体的分离与溶解 1 菌体破碎[45,491:由于包涵体对机械搅拌和超声破碎不敏感，基因工程菌的 发酵液经离心浓缩后用超声波破碎法处理细胞悬液，离心可使大多数包涵体与可溶性 蛋白分离而沉淀出来。由于在处理过程会产生大量的热，需在冰浴条件下进行。 2 包涵体的洗涤【45'49】:由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连 在一起，在溶解包涵体之前，通常用低浓度的盐酸胍或尿素,中性去垢剂,EDTA,还原 剂等洗涤包涵体。洗涤后的包涵体纯度可达50,以上，而且可保持原结构。 3 包涵体的溶解【45,49]:包涵体难溶于水，一般用强的 变性剂如8M尿素或6M 盐酸胍，它们通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学 键，使多肽伸展。对于含有二硫键的蛋白质，还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基 苏糖醇 D1vr 等。 9 兰州人学硕士学位论文 纳豆激酶的表达‘j复性研究 1(4(4(2蛋白折叠理论 包涵体蛋白的复性是一个世界性的难题，虽然没有通用的方法，很多因素都会影 响复性的成功，因此在对特定蛋白复性之前，了解蛋白复性的一 般规律，以及影响因 素，掌握目的蛋白的性质，对目的蛋白的复性有一定的指导意义。 蛋白折叠理论[48,50】:许多蛋白的天然构象不是一步折叠而成，而是在一些辅助蛋 白的协助下经许多中间态逐步形成。目前有两种不同的假设:一种假设认为，肽链中 的局部肽段先形成一些构象单元，如a螺旋、p折叠、B转角等二级结构，然后再由 二级结构单元的组合、排列，形成蛋白质三级结构;另一种假设认为，首先是由肽链 内部的疏水相互作用导致一个塌陷过程，然后经逐步调整，形成不同层次的结构。尽 管是不同的假设，但很多学者都认为有一个所谓“熔球态’’的中间状态。在熔球态 中，蛋白质的二级结构己基本形成，其整体空间结构也初具规模。此后，分子立体结 构再做,些局部调整，最终形成正确的立体结构。 在折叠反应中，从伸展态到中间体的形成是非常快速的，一般在毫秒范围内完成， 但从中间体转变为天然态有一个较大的能量屏障，其过程比较缓慢，包括蛋白质许多 不同位点上的侧链包埋与氢链的形成，涉及到许多非共价键作用的共同效应，是折叠 过程的限速步骤【48,50]。一般认为，蛋白质在复性过程中，涉及两种疏水相互作用，一 是分子内的疏水相互作用，二是部分折叠的肽链分子问的疏水相互作用。前者促使蛋 白质正确折叠，后者导致蛋白质聚集而无活性，两者互相竞争，影响蛋白质复性收率。 当溶液中离子强度或变性剂浓度很低，又无其它辅助手段存在时，聚集趋势占主导地 位，导致蛋白质的自发复性效率极低。因此，在复性过程中，抑制肽链间的疏水相互 作用以防止聚集，是提高复性收率的关键。 1(4(4(3复性方法 通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构， 同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2 M左右时结束。复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外， 还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有 12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95,以上，而有一些蛋白至今没 有发现能够对其进行复性的方法如IL(11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。 一般说来，蛋白质的复性效率在20,左右。没有一种复性方法能够满足所有的蛋白 10 兰州大学硕上学位论文 纳豆激酶的表达与复性研究 质复性的需要，不同蛋白质要求的生理生化环境也不同，所以，对于不同的蛋白质需 要设计不同的试验以寻求更好的复性手段。 1 稀释复性H5，51】:把溶解的蛋白质稀释入复性缓冲液 中，直到含少量尿素以 及蛋白复性，最后透析除去多余的尿素。目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连 续稀释三种方式。这种方法操作简单，适于小规模使用。优点是成本低，操作简单。 缺点是体积增加较大，样品浓度降低需浓缩。 2 透析复性【45，51l:通过透析逐渐降低尿素浓度，使蛋白复性。优点是不增加 体积，成本低。缺点是操作时间长，透析中容易形成沉淀，且不适合大规模操作，无 法应用到生产规模。 3 超滤复性【5l】:通过超滤逐渐降低尿素浓度，使蛋白复性。在生产中较多的 使用，规模较大，易于对透析速度进行控制。缺点是不适合样品 量较少的情况，且有 些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。 4 层析复性[45,51-53】:最近层析复性方法成为研究的热点，通过将目标蛋白结 合到层析柱上，减少蛋白分子间的相互影响，降低聚集体的形成，减少化学试剂的消 耗，同时对目标蛋白质有纯化作用，适用于大规模生产。相比上述三种方法，层析复 性回收率高 高达90,以上 、快速、易放大，样品稀释倍数小。目前，用于蛋白质 复性的层析复性法主要有凝胶过滤或称体积排阻、疏水层折、离子交换层析和亲和层 析等。 一 1(4(4(4影响复性的因素 影响复性效率的因素有变性剂的去除速度、复性蛋白的初始浓度、蛋白纯度、pH、 温度、离子强度、氧化还原系统、分子伴侣和折叠酶以及其他添加剂的存在与否等 [48,54-62]。蛋白质体外复性的一般策略就是考虑影响复性收率的各种因素和实际应用， 尽量抑制蛋白质的聚集而促进折叠中间体向天然态的方向折叠。 1 蛋白浓度:蛋白质的浓度是使蛋白质聚集的主要因素。因而，复性时的蛋 白浓度,般使用浓度为0(1,1mg,ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不 经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。 2 蛋白纯度:杂蛋白在变性剂溶液中也是以变性状态存在的，杂质蛋白质的 与重组蛋白质一起复性时可形成杂交分子而聚集，故复性时要求目标蛋白质具有一定 的纯度。 兰州大学硕士学位论文 纳豆激酶的表达与复性研究 3 温度:一般采取4?低温操作，避免蛋白在高温下长期放置导致蛋白失活。 4 pH:过高或过低的pH会降低复性效率，最适宜的复性pH值一般是7(0,9(0， 这样可以防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键的形成，同时应避免在蛋 白质等电点处进行复性。 5 离子强度:一定的盐浓度可能是为了降低某些带电基团间的斥力，有利于 蛋白质的折叠。 6 辅助因子:添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体 等，对蛋白质正确的折叠是有利的。如蛋白质的辅因子Zn2+或Cu2+可以稳定蛋白质 的折叠中间体【541，从而防止了蛋白质的聚集。 7 氧化一还原系统:对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加入氧化还原体 过促使不正确形成的二硫键的快速交换反应提高了正确配对的二硫键的产率。 8 分子伴侣和折叠酣60卅】:分子伴侣是指能够结合和稳定另外一种蛋白质的 不稳定构象，并能通过有控制的结合和释放，促进新生多肽链的折叠、多聚体的装配 或降解及细胞器蛋白的跨膜运输的一类蛋白质。折叠酶有二硫键异构酶 PDI 、脯氨 酸异构酶 PPI 等。PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到 正常的结构。在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是 复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进 行。分子伴侣和折叠酶都能在体外调节蛋白质的正确折叠，提高蛋白质的合成效率。 但这类蛋白在折叠复性后要除去，而且十分昂贵，它的实用性取决于其稳定性、重复 利用率及与复性蛋白分离的难易，固定化技术及人工分子伴侣的应用是今后分子伴侣 介导的复性方法的发展方向。 9 稳定剂和促进剂[49,s91:它们的作用原理在于能稳定正确折叠蛋白质的天然 结构，降低错误折叠蛋白质的稳定性，增加折叠复性中间体的溶解性，进而抑制或减 少了导致蛋白质无活性的聚集。?甘油:增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓 正确连接的二硫键变得不稳定，增加复性中间产物的溶解度，使折叠向正确方向进行， 可大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率。@PEG6000:通过与中间体特异的形成 非聚集的复合物，可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，阻止蛋白质分子间的相互碰撞 兰州大学硕，l:学位论文 纳豆激酶的表达与复性研究 机会，减少蛋白质的聚集，促进蛋白质的复性过程。一般使用浓度在0(1,,0(3,左 右，具体条件可根据实验条件确定。 ?低浓度变性剂:盐酸胍或尿素、烷基脲、碳 酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集，降低非正确折 叠的稳定性、增加折叠中间体的稳定性、稳定蛋白的活性状态。?表面活性剂:Triton X(100对蛋白质复性有显著促进作用。?,s:可提高包涵体蛋白质的折叠效率。 目前对包涵体形成和复性过程中发生聚集的机制尚不清楚，许多已建立的高效复 性方法是在反复实验和优化的基础上建立的，且没有普遍性，更多的是一个经验的过 程，没有一种通用的方法可以套用。但从这许许多多的个例中发现了一些规律t如聚 集的发生是由链间的疏水相互作用介导、聚集具有相对特异性、折叠中间体可能具有 不同的作用等等。相信随着结构生物学、生物信息学、蛋白质工程学及相关新技术和 新设备的发展和完善，在不久的将来，预测和设计最佳复性将成为可能。 1(5本研究的目的和意义 纳豆激酶与前几代溶栓药物 尿激酶、t-PA等 相比，有溶栓效率高、安全性好、 可由肠道直接吸收、体内半衰期长、副作用小和成本低等很多优点。因此，作为新一 代溶栓药物，纳豆激酶具有很高的开发和研究价值，对预防和治疗血栓类疾病具有深 远的意义。 目前，纳豆激酶主要来源于野生枯草芽孢杆菌的发酵及分离纯化。尽管野生菌株 发酵有其一定的优点，但其产量较低、培养周期长、培养基成分复杂、纯化步骤多、 收率低和生产成本高，限制了其发展和应用。因此，构建高效表达载体来表达纳豆激 酶成为研究的必要。由于纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白激酶，主要是通过分泌到细胞外 来溶解胞外蛋白的，如果在细胞内大量表达有活性的蛋白是对细胞有害的，即通过基 因工程手段，在细菌细胞内表达大量可溶的有活性的形式是行不通的。因此，在纳豆 激酶基因工程改造和表达方面，主要有两条可行路线，即以有活 性的形式实现分泌型 表达，或者以无活性的包涵体形式表达。 分泌型表达方面的研究，主要是从不同纳豆激酶菌株 如枯草杆菌，纳豆杆菌， 解淀粉芽孢杆菌 中克隆具有信号肽、前导肽和成熟肽的纳豆激酶原基因，重组到温 控型和诱导型质粒表达载体上，转化到不同的表达宿主菌中 如大肠杆菌、枯草杆菌 和酵母菌 ，实现了纳豆激酶的分泌型表达。但是，分泌型蛋白的表达也有其缺点。 例如，在大肠杆菌中的分泌型表达，由于是处于非野生型状态，使表达的蛋白分泌到 13 兰州大学硕上学位论文 纳豆激酶的表达1j复性研究 胞外较难，只能分泌部分有活性的蛋白，这样构建的发酵菌与野生型发酵菌相比无明 显优势。因此，想要获得高效表达分泌型纳豆激酶的工程菌，就需要找到能引导蛋白 高效分泌到胞外的的信号肽序列，以及相应的合适的宿主菌，而这些都有待于大量的 研究来解决。 E(coli(由于其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点， 依然是生产外源重组蛋白的首选表达系统，尤其适合表达不经过蛋白质翻译后修饰就 具有生物活性的基因工程蛋白。E(coli(中高效表达的蛋白形成无活性的包涵体，它富 含重组蛋白，具有易于分离纯化、抗蛋白酶和对宿主毒性小等优点，只要能够在体外 成功复性，将是大量生产重组蛋白最有效的途径之一。 纳豆激酶成熟肽基因可以在E(coli(中高效表达，形成富含重组纳豆激酶包涵体， 但一直以来研究者对重组纳豆激酶包涵体在不含前导肽的情况下是否能正确折叠复 性存有争议 表1 :大多数研究者报道高效表达形成的重组纳豆激酶包涵体不能复 性，前导肽在蛋白正确折叠过程中起分子内伴侣的作用;也有部分研究者报道 量的包涵体经普通复性方法复性后也可获得活性。罗立新等 2003 与张仁怀等 2005 使用同样的表达载体pPICZaA，在纳豆激酶成熟肽前加上Q因子 信号肽使重组纳豆 激酶分泌到培养基中，只是受体菌不同分别为酵母GSll5和X一33，表达蛋白的活性 豆激酶成熟肽前加上了信号肽，表达出的重组纳豆激酶有活性。常荣山 1999，专利 E(coli(ER2566中表达了纳豆激酶成熟肽，形成的包涵体通过稀释复性冷冻干燥后也 有活性。 本研究基于上述争议问题，分析前人的纳豆激酶成熟肽基因表达策略，发现他们 的表达载体构建方式主要有两种，但表达蛋白的活性却有不同。第一种方法是在纳豆 活性。第二种方法只是不在纳豆激酶N端融合其它序列，大部分报道通过采用常规 纯化与复性方法能使蛋白复性。因此，我们提出了这样的问题:是否纳豆激酶N端 融合的各式各样的多余序列影响了纳豆激酶成熟肽的正确折叠复性?而且目前对纳 14 兰州大学硕上学位论文 纳豆激酶的表达与复性研究 豆激酶包涵体复性方法的探索很少。因此，作为纳豆激酶的一种高效表达手段，对纳 豆激酶的包涵体复性的研究是必要的。 体形式的纳豆激酶。经IPTG诱导高效表达出包涵体形式的重组蛋白，对包涵体尿素 变性、亲和层析纯化后再使用不同的复性方法进行复性研究，以研究在无前导肽辅助 以及N端冗余序列的影响，常规复性方法和复性添加剂是否能使纳豆激酶正确折叠 复性，为长久以来的争议问题提供某方面的证据。‘ 由于使用了酶切位点Nde I CA]幽 ，其中含有的ATG为起始密码子，使表 达的纳豆激酶N端不含任何多余的载体编码蛋白序列，以减少多余序列可能对蛋白 折叠的影响，同时C端含有融合有2个由XhoI CTCGAG 翻译的氨基酸以及由一 串CAC密码子翻译的8个组氨酸形成的His(Tag以利于层析纯化或后期能使用亲和 层析复性方法。使用C端融合His(Tag的表达方法的优点是，重组蛋白N端不含多余 的载体序列，防止了N端多余序列对N端序列敏感蛋白的活性造成影响，同时使所 有经过亲和层析纯化获得的蛋白都是均一的目的蛋白，不会有因翻译中断而形成的蛋 白片段，从而保证了蛋白的完整性与均一性以及工厂化生产所需的安全性。 兰州人学硕(L学位论文 纳豆激酶的表达与复件研究 2材料与方法 2(1材料 2(1(1质粒与菌株 质粒p-NK;原核表达载体pET-42b Novagen E(coli(DH50t和原核表达菌株E(coli(BL21 DE3 均由本实 验室保存 。 2(1(2仪器设备 Hood II核酸成像仪、PowerPacUniversal蛋白 MyCycler梯度PCR仪、Universal AuToCLAVE Plus蛋白核酸分析仪等购自BIO(RAD公司:LABO 电泳仪和SmartSpec lowVIP 高压蒸汽灭菌锅、制冰机、多功能环境箱、Ultra series(80? 超低温冰箱购自 HP和Akta SANYO公司。亲和层析柱Hi(TrapTMChelating explorerl00快速纯化系统 购自Amersham CabinersClass Safety Biological II超净工作台;Biofuge 4000 CR21G高速冷冻离心机;上海华连电热恒温培养箱; 温摇床;METTLERTOLEDO电子天平;上海一恒水浴锅;宁波新芝 超声波粉碎机: UPowerlook 2100XL扫描仪。 2(1(3酶与试剂 mM 、 100ladderDNA DNA聚合酶 2u,I(t1 购自北京鼎国公司;dNTP 10 Taq bp Maker、DNAmarkerlII等购自北京天为时代公司; DNAMakerDLl5000购自Takara 公司;PCR产物纯化回收试剂盒购自安徽优晶公司;pUCm(T载 体购自上海生工公司: I 2500 限制性内切酶NdeI 2000U 与Xho U 购自NEB公司;T4DNA连接酶 200U 购自MBI公司;氨苄青霉素、卡那霉素等购自北京拜尔迪公司;低分子量 蛋白Maker购自上海中科院;凝血酶、牛血纤维蛋白原等购自Sigma公司;尿激酶 品 1280IU 购自中国药品生物制品检定所:其他化学药品为进口或国产分析 纯试剂。使用的其它试剂及其配方见附录。 2(1(4 PCRiJl物 先用BioEdit与Vector 16 兰州大学顾t学位论文 纳豆激酶的表达与复性研究 AJ314856 和pET-42b载体序列 Novagen Oligo软件设计纳豆激酶成熟肽基因的PCR扩增引物，由北京赛百盛公司合成，其中 P1 25bp 的5’末端引入起始密码子ATG和Nde 的5’末端引入Xho 基 CGG 。 2(2方法 2(2(1TA克隆纳豆激酶基因 2(2(1(1提取质粒P(NK 碱裂解澍631提取质粒p-NK 分子克隆实验指南，第二版 : 1 从(70"C冻存的菌种中取-d,环冰渣，划线接种于LB 平板 含50 lag,mlAmp ， ml 37"C倒置培养过夜，用无菌牙签挑分离良好的单菌落，接种于 3,5LB培养基中 含 50 I_tg,mlAmp ，37"C振摇培养过夜。 2 取1(5,2111l菌液到小离心管中，4"C12，000 S，弃上清液，用 rpm离心30 枪头吸干残留的培养液，加100rtl冰预冷的溶液I，剧烈振荡 悬浮菌体沉淀，室温放 置5min，加入200 min，加150 pl现配的溶液II，快速颠倒离心管5次，冰 上放置5 min，4"C S，冰上放置5 pI冰预冷的溶液III，将离心管倒置后温和振荡10 12，000rpm 离心5min，吸取上清液到新的离心管中，加200 pl氯仿和 200pl"Iris平衡酚，快速 颠倒离心管5次，4"C12，000 min，吸取上层 水相到新的离心管，加400pl rpm离心5 氯仿，快速颠倒离心管5次，4"C12，000 min，吸取上层水相到新的离心 rpm离心5 管，加lml 两倍体积 预冷的无水乙醇或0(6倍体积的异丙醇，快速颠倒离心管5 次，冰上放置30min，沉淀质粒DNA。 3 4"C 12，000 min，弃上清液，加75,或70,的乙醇清洗沉淀，4"C rpm离心5 12(000 min，弃上清液，用枪头吸尽残留液体，用无 菌风干燥去除残留乙 rpm离心2 醇，加20--30 pl质粒在l,琼脂糖凝胶电泳检测。 2(2(1(2 PCR扩增纳豆激酶基因 以质粒p-NK为模板进行PCR，扩增出纳豆激酶基因。按下列顺序 表3 把溶 17 兰州人学硕上学位论文 纳豆激酶的表达与复性研究 液加到PCR管中，轻弹管底使混匀，低速短暂离心甩下附着于管 壁的液体，扩增条 4 1 30S、60"030S、72。C 件为95"0min预变性，94"0 rain共30个循环，最后在72"C 延伸10min。取3,5PCR产物在l,琼脂糖凝胶中电泳检测。 pl 表3帐基因POR反应体系 Table3 ThePCR ofNK system gene 反应体系 25Ill 超纯水 ddH20 ?， ? 10xPCRBuffcr Z5? dNTP 10mM c;5? PI 10pM LOm P2 10 LO pM m 质粒DNA 仉5m Taq酶 2u,p1 n5? 将PCR产物混合后加入适量上样缓冲液混匀，全部点样于 l,琼脂糖凝胶中电 泳，切胶，用PCR产物纯化回收试剂盒回收PCR产物 按说明书 操作 ，用30-40 pl 无菌超纯水溶解洗脱。取3,5“l回收产物在l,琼脂糖凝胶中电泳检测。 2„213连接纳豆激酶基因与pUCm(T载体 使用T4 JIl页序 表 DNA连接酶连接回收的纳豆激酶基因与pUCm(T载体。按下N 4 把溶液加到PCR管中，轻弹管底使混匀，低速短暂离心甩下附着于管壁的液体， hr 。 于低温循环仪中16?连接过夜 22 表4 TA克隆连接体系 Table4 The ofTA linkagesystemcloning 连接体系 10? 超纯水 ddH20 2肛 10x连接Buffet lp 50,PEG删 lp PCR扩增基因 4p pUCm-T载体 l p T4 l DNA连接酶 5u,p1 p 18 兰州大学硕一1:学位论文 纳豆激酶的表达与复性研究 2(2(1(4制备E(coli(DH5a感受态细胞 CaCl2法制备E(coli(DH5a感受态细胞蚓 分子克隆实验 指南，第二版 : ml液体 含抗生素 ，37"C倒置培养过夜，用无菌牙签挑分离良好的单菌 落，接种于3,5 LB 不含抗生素 ，37?振摇培养过夜。 ml llr，转 2 取过夜培养物O(5ml接种于50LB培养基中，37?振摇 培养2,3 入预冷的50 min，4"C min，弃上 ml无菌大离心管中，冰浴10,30 4，000rpm离心 10 清液，将离心管倒置于无菌滤纸上1min使培养液流尽，加入10, 30ml冰预冷的0(1 mol,L min，40C CaCl2溶液重悬沉淀，冰浴10 min，弃上清液，将 4,000rpm离心10 离心管倒置于无菌滤纸上1min使培养液流尽，加入2ITll冰预 冷含15,甘油的 0(1mol,L CaCl2溶液重悬沉淀，分装于冰预冷的1(5ml的离心管中，每管200?l，液 氮速冻，(70"C保存备用。 2(2(1(5连接液转化E(coli(DH5a感受态细胞 制备a互补筛选平板:制备LB平板 含50 0(5MIPTG I(tg,mlAmp ，加入7儿l 3~4