人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白在原核生物中的表达和制备

人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白在原核生物中的表达和制备 1 郁骁珩 于丽莉 (上海交通大学医学院2004级法文班， 1上海交通大学医学院生物化学与分子生物学教研室上海 200025) [摘要]目的:利用基因工程技术重组构建含有人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growth factor , hbFGF)的质粒，并在原核生物中表达hbFGF与谷胱 甘肽巯基转移酶(glutathione-S-transferase ,GST)的融合蛋白。:用限 制性内切酶将真核载体pCDNA3-bFGF中bFGF基因片段切下，重组到原核表达 载体pGEX-4T-2中，构成重组GST-bFGF融合基因;将其转入大肠杆菌DH5α中， 在体外用诱导剂IPTG加以诱导，表达GST-bFGF融合蛋白，并通过亲和层析纯化; 用SDS-PAGE和Western-Blot鉴定表达产物。结果:得到经鉴定正确的重组质粒 和诱导表达的相对分子质量为44kD的融合蛋白。结论:成功构建了原核表达载体 pGEX-4T-2/bFGF，并在大肠杆菌中表达了GST-bFGF融合蛋白，为下一步研究表 达产物bFGF的生物活性打下了基础。 [关键词]人bFGF;重组质粒;融合蛋白;表达 Expression and Preparation of recombinant GST-hbFGF fusion protein in E.coli 1Yu-Xiaoheng Yu-Lili(Department of the biochemistry and molecular biology, Faculty Medicine of Shanghai Jiaotong University) [Abstract]:Objectives:To construct a recombinant hbFGF-GST fusion gene and to express the fusion protein in E.coli expression system. Methods and Results: The fragment of hbFGF gene which comes from pcDNA3-bFGF was cloned into pGEX-4T-2 expressing vector , then transformed to E coli DH5α. The hbFGF-GST fusion protein expression was induced by IPTG. A band, whose molecular weight was approximately 44 kD ,was shown in SDS – PAGE . Then hbFGF-GST fusion protein was confirmed by Western Blot. Conclusion: We have express the recombinant human bFGF–GST fusion protein in DH5α [Key Words]: Human Basic Fibroblast growth factor;Recombinant fusion gene;Recombinant fusion protein;Escherichia coli 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor , bFGF)含155个氨基酸残基的单链蛋白质，分子量为18kD，是一种能促进各类细胞增殖的一种蛋白质分子，具有相当广泛的生理功能。研究发现，bFGF作为一种广谱的有丝分裂原,通过与其靶细胞上的受体结合而发生作用，并通过信号转到作用于细胞核，影响 [1-3]RNA聚合酶I,加强核糖体的转录，刺激DNA合成增强,促使细胞的分裂与增殖。bFGF作用的靶细胞有成纤维细胞、血管内皮细胞、软骨细胞、成骨细胞、平滑肌细胞、神经原、神经胶质细胞、骨骼肌细胞、晶状体上皮细胞、角膜上皮细胞、 [4]肾上腺皮质、髓质细胞等。目前已有研究证实，它在促新生血管生成、神经细 [5-10]胞及骨组织的再生，损伤愈合方面起着相当重要的作用。由此可见，bFGF在临床上将会有非常广泛的应用前景。 本次实验旨在通过基因工程技术构建原核表达质粒pGEX-4T-2/bFGF，并将融合质粒转入大肠杆菌表达GST-bFGF融合蛋白。pGEX- 4T–2是GST 融合蛋白的原核高效表达载体,因带有强的tac 启动子可诱导高效表达，并且载体内含有lac1阻遏蛋白基因，可用IPTG体外诱导表达。构建的质粒中,SD 序列下游是GST 基因,pGEX-4T-2的多克隆酶切位点位于GST 基因之后, 目的基因bFGF借助于SmaІ和XhoІ酶切位点插入多克隆位点。这样,目的基因接在GST 下游，形成GST-bFGF融合基因，表达GST-bFGF融合蛋白，并且表达的融合蛋白可通过谷胱甘肽- agarose 柱进行亲和层析,再用凝血酶将其GST 切除,从而获得目的蛋白,表达产物的纯化十分方便。 材料和方法 , 材料 1. 菌株、质粒和真核载体 大肠杆菌菌株DH5α、质粒pGEX-4T-2和真核载体pcDNA-bFGF均由生物化学与分子生物学教研室提供。 2. 各种限制性内切酶、Klenow酶(罗氏公司)、TDNA连接酶(NEB公司);标4 准分子量蛋白(华美公司); 3( 胶回收药盒(Gel Extraction kit QIAGEN公司)快速质粒抽提药盒(high speed plasmid mini kit GeneAid公司)。 4(bFGF兔抗人血清 (北京博森生物技术有限公司)，GST一抗(GST- PTPα融合 蛋白抗体，由生物化学与分子生物学教研室提供)。 TM5(Glutathione Sepharose4B(Amersham Biosciences公司提供)层析柱 6. 化学发光试剂盒(北京鼎元生物技术有限公司) 7. 其它试剂:进口分装或国产分析纯 , 方法 一、 原核表达质粒pGEX-4T-2/bFGF的构建 1(利用限制性内切酶Sma?和Xho?对表达载体pGEX-4T-2进行酶切，形成一端为 平端、另一端为Xho?粘性末端的线状分子。(采用15μl反应体系，质粒 8μl、 10×Sma?buffer 1.5μl、Sma?限制性内切酶 1.5μl、ddHO 4μl，25ºC，水浴2 3h，在原反应体系中加入1μl XhoI限制性内切酶，2μl XhoI buffer,2μl ddHO,37ºC，水浴2h)。 2 2. 利用限制性内切酶Hind?对真核表达载体pcDNA3-bFGF酶切、 用Klenow酶将 Hind?位点端修平、再用Xho?酶切将真核表达载体pcDNA3-bFGF中的bFGF 基因片段切下，形成一端为平端和另一端为Xho?粘性末端的线状分子。(酶切: 采用15μl反应体系,10×B buffer 1.5μl,pcDNA3-bFGF 3μl,Hind? 1.5μl，ddHO 2 9μl,37?酶切90min;修平: 在原反应体系中加入1μl Klenow酶和4μl dNTP， 37ºC水浴90min;70ºC，10min灭活Klenow酶;酶切修平后，加入2.3μl Xho?限 制性内切酶,1μl Xho?buffer,37ºC水浴90min )。 3. 将上述载体pGEX-4T-2与bFGF 酶切产物分别经电泳分离后通过凝胶回收药 盒将其回收，使用方法参照胶回收试剂盒说明书。回收后，对载体片段 pGEX-4T-2和bFGF基因片段进行定量。 4. 载体与目的基因片段用TDNA连接酶进行连接，两者按bFGF: 4 pGEX-4T-2=10:1混合，采用20μl连接体系(连接buffer 2μl、TDNA连接酶 4 1μl)，16ºC，过夜，灭活备用。 5. 制备感受态菌:将1%过夜培养的大肠杆菌DH5-α接种到新鲜的LB培养液中， 37?摇床摇两小时培养至对数期(OD=0.3~0.8);取800 ul菌液放入小管600nm 中，于冰上放置5min后，以6000r/min的速度离心5min;弃上清液，沉淀加 原体积1/2冰预冷的0.1mol/LCaCl悬浮沉淀，冰浴30min，离心6000r/min，2 5min;弃上清，沉淀加原体积1/10冰预冷的0.1mol/LCaCl，悬浮沉淀。 2 6. 将第4步中制备的重组GST-bFGF 20μl加入已制备好的感受态菌液中，混匀， 冰浴30min;将反应管放入42?，90sec，即刻放入冰浴;每管加600μl LB 培养液，混匀，放入37?45min，使细菌复苏;取200μl上述菌液，均匀涂布 于含有氨苄青霉素(AMP)的LB固体培养基上，室温30min，倒置放入37? 培养箱内过夜培养，第二天观察结果。 7. 克隆扩增、鉴定:挑取菌落培养后，提取质粒，具体操作参照见碱裂解试剂盒 说明书。经Xho?和EcoR?双酶切后，作琼脂糖凝胶电泳鉴定片段。 二、GST-bFGF融合蛋白的诱导表达 1. 分别将含有构建好的原核表达质粒pGEX-4T-2/bFGF和pGEX-4T-2空载体的菌株放入SB培养液内37?过夜摇菌培养。次日按1:50稀释培养的菌液，接种至SB培养液内摇两小时到对数期(OD600nm=0.3~0.8)。之后分别以不同的诱导剂(异丙基硫代半乳糖苷isopropylβ- D- thiogalactoside , IPTG)浓度(100μmol/L、200μmol/L)，不同的诱导时间(4h、过夜)，不同的温度(25?、37?)，寻找表达效果最好，表达产物最多的条件。离心收集菌体，做SDS-PAGE分析鉴定表达产物，确定最终的表达条件。 2. 大量表达融合蛋白:接菌液1ml至含有AMP的400mlSB培养液内，培养两小时到对数期(OD600nm=0.3~0.8);以200μmol/L的IPTG37?诱导过夜。 3.裂解细菌:取上述已过夜表达的菌液于4?，5000r/min，离心10min;弃上清，加20mlTBS悬浮沉淀(TBS:Tris•HCl 10mmol/L pH=8.0,NaCl 150mmol/L);分别加PMSF、DTT、approtinin至终浓度1mmol/L,1mmol/L,10μg/ml;超声波破菌;4?离心，15000r/min，1h。 TM4. 融合蛋白纯化: 使用Glutathione Sepharose4B(Amersham Biosciences公司提供)层析柱:弃去柱内保护液;加入PBS洗涤40ml;用30 mlPBS+Triton-X(1%)平衡柱子;将离心后上清上样，收集流出液;待液流出至保护层后，加入PBS约30ml洗涤柱子，不收集流出液体;也流至保护层后加入洗脱液，收集洗脱峰。 5. SDS-PAGE分析鉴定表达产物 6. Western Blot 鉴定表达产物: (1)蛋白转膜(半干转移法) 使用BioRAD半干转移仪，将滤纸、硝酸纤维膜用转移缓冲液(39mmol/L Glycin、48mmol/L Tris、0.037%SDS、20%Methanol)浸透，按照滤纸-硝酸纤维膜-凝胶-滤纸的顺序从下至上放置，硝酸纤维膜靠正极，在30mmA的电流下转移2h。 (2)Western Blot检测: a.封闭:5%脱脂奶粉溶于PBST(150mmol/L NaCl、16 mmol/L NaHPO、0.1%Tween)24中，将硝酸纤维膜置于其中，4ºC过夜。 b.杂交:分别与500倍稀释于含5%脱脂奶粉的PBST的Rabbit Anti-bFGF和2000倍稀释于含5%脱脂奶粉的PBST的GST一抗在4ºC温育摇荡，反应两小时后， 用PBST漂洗三次，每次15min。然后加入以PBST 1:2000稀释的辣根过氧化物酶酶联的特异二抗，室温2h，PBST漂洗三次，每次15min。 c.检测:将supersignal West Piso chemilumi nescent substrate溶液A、溶液B，室温中预温，各取500μl混匀加于膜上，置室温中反应5min，除去多余液体，封口，在暗室中曝光X底片，15s。 d.压片显影 结 果 一、原核表达质粒pGEX-4T-2/bFGF的构建 1.目的基因的修饰和载体的提取(见图一) 原核表达载体pGEX-4T-2经SmaI单酶切，真核载体经Hind?和Xho?双酶切电泳结果图显示，两者都是正确的片断。 图一 酶切产物凝胶电泳 Fig1: Agarose gel electrophoresis map of products M: Lambda DNA/ Hind? Markers Lane1: plasmid pGEX-4T-2 Lane2:pcDNA/bFGF 2.重组质粒的酶切鉴定(见图二) 先将原核表达质粒pGEX-4T-2 以SmaI单酶切;真核载体pcDNA3先经Hind?酶切，用Klenow酶将Hind?位点粘性末端修平，再经Xho?酶切，电泳分离并 鉴定，从琼脂糖凝胶回收酶切产物。经TDNA连接酶作用，使bFGF片断与质粒4 pGEX-4T-2连接。后转化入大肠杆菌，涂布于含有氨苄青霉素的平板，37?培养箱过夜，次日挑取克隆进行扩增，抽提质粒后经Xho?和EcoR?双酶切，成为两个片断，分别为4900bp和470bp，与理论值相符。 图二:酶切产物凝胶电泳 Fig2: Agarose gel electrophoresis map of products M: Lambda DNA/ Hind? Markers Lane 1-6:bFGF with plasmid recombinant 二、GST-bFGF融合蛋白的诱导表达 1.优化表达条件(见图三) 按1:1000稀释在LB内培养的菌液，分别将重组基因pGEX-4T-2/ bFGF和原核表达载体pGEX-4T-2接种至SB培养液内。摇菌至对数期后，在不同的条件下:不同的诱导剂浓度(200μmol/L、100μmol/L)，时间(4h、8h、过夜)，温度(25?、37?)，表达融合蛋白，结果见图，以200μmol/L、100μmol/L，37?，过夜的表达条件表达量最大。 图三:大肠杆菌中DH5αpGEX-4T-2/ bFGF表达产物的SDS - PAGE分析 Fig3: Analysis of GST-bFGF fusion protein expressing products by SDS - PAGE M: protein maker Lane 1-2: 44kD GST-bFGF expression products in lysate of E.coli DH5αcell induced by IPTG 200μmol/L and 100μmol/L,4H, 25? Lane 3-4: 44kD GST-bFGF expression products in lysate of E.coli DH5αcell induced by IPTG 200μmol/L and 100μmol/L, day and night, 25? Lane 5: 44kD GST-bFGF expression products in lysate of E.coli DH5αcell no induced Lane 6-7: 44kD GST-bFGF expression products in lysate of E.coli DH5αcell induced by IPTG 200μmol/L and 100μmol/L, day and night, 37? Lane 8-9: 44kD GST-bFGF expression products in lysate of E.coli DH5αcell induced by IPTG 200μmol/L and 100μmol/L,4H, 37? 图四:大肠杆菌中DH5αpGEX-4T-2表达产物的SDS - PAGE分析 Fig4: Analysis of GST protein expressing products by SDS - PAGE M: protein maker Lane 1-2: 26kD GST expression products in lysate of E.coli DH5αcell induced by IPTG 200μmol/L and 100μmol/L,4H, 25? Lane 3-4: 26kD GST expression products in lysate of E.coli DH5αcell induced by IPTG 200μmol/L and 100μmol/L, day and night, 25? Lane 5: 26kD GST expression products in lysate of E.coli DH5αcell no induced Lane 6-7: 26kD GST expression products in lysate of E.coli DH5αcell induced by μmol/L and 100μmol/L, day and night, 37? IPTG 200 Lane 8-9: 26kD GST expression products in lysate of E.coli DH5αcell induced by IPTG 200μmol/L and 100μmol/L,4H, 37? 2.融合蛋白的表达与纯化(见图五、图六) 大量表达GST-bFGF融合蛋白后，裂解细菌，层析纯化，结果见图。 与蛋白质标记物对照，可见有一条带在55kD与40kD之间，与理论值相符。 图五:融合蛋白经层析纯化后的SDS - PAGE分析 Fig5: Analysis of eluted protein (bFGF) expressing products by SDS – PAGE Lane 1: 44kD GST-bFGF expression products in lysate of E.coli DH5αcell induced by IPTG 200μmol/L, day and night, 37? Lane 2: bFGF expression products eluted 图六:经层析纯化的GST蛋白的SDS – PAGE分析 Fig6: Analysis of eluted protein (GST) expressing products by SDS – PAGE Lane 1: 26kD GST expression products in lysate of E.coli DH5αcell induced by IPTG 200μmol/L, day and night, 37? Lane 2: GST expression products eluted 3.表达产物的鉴定(见图七) 进行免疫印迹鉴定后，我们确定此条带确实是GST-bFGF融合蛋白。 图七:Western Blot结果图(一) 图七:Western Blot结果图(二) Fig7: Western Blot Lane 1: 44kD GST-bFGF expression products in lysate of E.coli DH5αcell no induced Lane 2: 44kD GST-bFGF expression products in lysate of E.coli DH5αcell induced by IPTG 200μmol/L, day and night, 37? Lane 3: 44kD GST-bFGF expression products eluted Lane 4: 26kD GST expression products in lysate of E.coli DH5αcell no induced Lane 5: lysate of E.coli DH5αcell 讨 论 人碱性成纤维细胞生长因子bFGF在体内广泛存在且作用范围大，但由于其在各组织中的含量极少，可溶性与稳定性较低，难以从纯天然的组织中获得，因此通过基因工程的手段在大肠杆菌中表达成为一种较为理想的方法。然而构建胞内表达非融合rhbFGF等常规方法的表达量均不高，在我们所查阅的资料，未找到 [11]表达量超过15 %的报道。此外，孙奋勇等曾通过调整bFGF上游部分的序列，使得bFGF在大肠杆菌中的表达率提高。因此我们考虑采用通过pGEX-4T-2这一原核表达载体，将原本在真核载体pcDNA中的目的基因片断bFGF切下插入原核表达载体pGEX-4T-2构建新的质粒，从而在大肠杆菌中进行bFGF融合蛋白的表达。 在此过程中，需要对bFGF片断的一端被Hind?酶切所产生的粘性末端不能直接与pGEX-4T-2上经Sma?酶切的平端相连接，需要对Hind?粘性末端用Klnow酶进行修平修饰，以使两个平段经连接酶作用相连，进一步构建GST-bFGF融合基因。而在此后鉴定质粒pGEX-4T-2/bFGF是否构建成功时，粘端Hind?已被修平，需要选择新的酶切位点，比如EcoR?。 但我们在纯化融合蛋白的过程中产生了操作错误，在洗脱液洗脱融合蛋白前未用PBS洗涤层析柱中的杂蛋白，导致大量杂蛋白混在洗脱产物中，而纯化的融合蛋白相对含量不足。所以在对洗脱液进行蛋白质SDS - PAGE分析中，纯化的融合蛋白含量不高，条带颜色较浅(见图五，lane 2)。 在我们摸索融合蛋白表达条件的试验中，同时选择了在不同温度(37? 、25?)，不同的诱导剂浓度(IPTG，200μmol/L、100μmol/L)，不同时间(4h、8h、过夜)，进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析，在37?，诱导剂浓度200μmol/L，过夜表达条件下，外源蛋白质表达量最多但杂蛋白多，而其余表达条件下结果也均不理想，所以确定以37?，诱导剂浓度200μmol/L，过夜表达作为大量表达条件。可是也发现含有重组质粒的细菌在未加诱导剂的情况下也有融合蛋白表达的情况(见图三)。并且Western Blot鉴定结果显示，其表达量与诱导后表达量接近，同时在未导入载体的大肠杆菌DH5α中也有大小接近的条带(见图七)。我们无法完全解释该现象，初步分析认为可能的原因有:(1)诱导表达条件没有完善;(2) 在37?表达中某些温控元件被激活，在没有诱导剂存在的情况 下启动了翻译过程，使得融合蛋白进行了表达(3)在选择表达菌株时，考虑不够 周全，仅考虑到大肠杆菌DH5α可表达融合蛋白但未考虑到它本身表达的固有蛋 白对实验结果的干扰。 由于本次实验时间所限，对融合蛋白最佳表达条件的摸索还不够完善，因此 希望有机会能通过进一步的实验来优化表达条件。 感谢 特别感谢上海交通大学医学院基础医学院教学办给与我们本次实验机会。感谢 生物化学与分子生物学教研室对本研究课的大力支持。感谢上海交通大学医学 院生物化学与分子生物学教研室的许伟榕、王克敏、吴兆平老师、研究生们以及 细胞生物学教研室对我们技术和材料上的支持。本课题的完成离不开他们尽心尽 力的帮助。谢谢～ 参考文献 1. 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