胎盘贴壁细胞的生物学特性

胎盘贴壁细胞的生物学特性 论文范文 题目:胎盘贴壁细胞的生物学特性 编辑:司马小 【关键词】 胎盘,贴壁细胞,干细胞 Biological characteristics of placentaderived adherent cells 【Abstract】 AIM: To isolate and culture human placentaderived adherent cells (hPDAC) in vitro and study their biological characteristics involving morphology, phenotype and differentiation. METHODS: Mononuclear cells were harvested after placenta tissue was digested by collagenase IV, seeded and cultured in lowglucose DMEM containing 100 mL/L FBS. Their surface markers were detected by flow cytometry; the growth curve was made; cells of 3 passages were induced to differentiate into osteoblasts with vitamin C, dexamethasone and sodium βglycerophosphate, and the induced cells were observed in the change of matrix mineralization with alizarin red staining; cells of 3 passages were induced to differentiate into lipocytes with dexamethasone and insulin, and the induced cells were observed with oil red O staining. RESULTS: By day 7-14, a few of adherent cells were observed and expanded the same as fibroblasts, and adherent cells were positive for CD29, CD44 and CD105, but negative for CD34, CD45, CD19. After 10day induction, alizarin red staining showed the calcium mineralization and after 7 d, oil red O staining revealed the appearance of fat drops. CONCLUSION: The hPDAC was confirmed to have the osteogenic and adipogenic potentials, indicating that they could be regarded as an alternative source of stem cells. 【Keywords】 placenta; adherent cells; stem cells 【摘要】 目的: 通过体外分离和培养胎盘贴壁细胞～以研究其 形态、型和分化特点. : 采用IV型胶原酶消化人胎盘组织～ 获得单个核细胞～接种于100 mL/L FBS 低糖DMEM培养基中～贴壁后 常规换液、传代～流式细胞仪检测其表面标志～绘制生长曲线. 采用 β甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松联合诱导～使胎盘贴壁细胞分化 为成骨细胞～诱导后10 d行茜素红染色,采用地塞米松、胰岛素诱 导～使胎盘贴壁细胞分化为脂肪细胞～油红O染色鉴定. 结果: 培养 7~14 d后有少量贴壁细胞生长～逐渐呈成纤维细胞状～表达CD29～ CD44和CD105～不表达CD34～CD45～CD19,在成骨诱导10 d后细胞茜 素红染色可见钙盐沉积～成脂肪诱导7 d后油红O染色见脂肪滴形成. 结论: 通过不同方式诱导培养～胎盘贴壁细胞可分化为成骨细胞及脂 肪细胞～提示胎盘贴壁细胞可能是新的干细胞来源. 【关键词】 胎盘,贴壁细胞,干细胞 0引言 间充质干细胞,marrow stromal cell, MSC,主要来源于骨髓～ 可以分化为多种组织细胞:成骨、软骨、脂肪、神经细胞等～但随着 年龄增长或合并感染、肿瘤等疾病时骨髓干细胞的分化能力明显下 降～因此寻找新的干细胞成为当务之急. 近几年来有学者发现胎盘组织中存在MSC. 为进一步证实这一发现～我们从胎盘中提取贴壁细胞～观察其生物学特性～以探讨其是否具有干细胞特性. 1材料和方法 1.1材料足月剖宫产的胎盘,产妇同意,～低糖DMEM,Gibco公司,～新生牛血清,FBS～Gibco公司,～IV型胶原酶,Sigma公司,～胰蛋白酶,Sigma公司,～鼠抗人单克隆抗体CD19～CD44～CD45～CD105～CD34～CD29,晶美公司,～茜素红,Sigma,～油红O,Sigma,～倒置显微镜,Olympas,～CO2培养箱,Jouan,. 1.2方法 1.2.1胎盘贴壁细胞的分离和培养取足月剖宫产胎盘～剪取胎儿侧胎盘组织～PBS反复冲洗～剪成碎块～以1 g/L IV型胶原酶37?消化30 min～取上清液～以800 r/min离心5 min～沉淀物重复消化～收集每次离心后的细胞沉淀～PBS冲洗2遍～以1×107/L的密度接种于100 mL/L FBS DMEM培养基中～贴壁后3~5 d换液1次～取传3代以上细胞备用. 1.2.2胎盘贴壁细胞的表型测定取第3代细胞～以2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min～100 mL/L FBS终止消化～PBS冲洗2遍～调整细胞数为1×104/μL～分别加入鼠抗人单克隆抗体CD19, CD44, CD45, CD105, CD34～流式细胞仪检测细胞表型. 1.2.3生长曲线的绘制取第3代细胞～以2×107/L的密度接种于12孔板中～每日取3复孔～台盼蓝染色计数活细胞～连续培养计数7 d～计算平均值～绘制生长曲线. 1.2.4细胞周期测定取第3代细胞～以2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min～10 mol/L FBS终止消化～PBS冲洗2遍～调整细胞数为1×106/L～流式细胞仪检测细胞周期. 1.2.5细胞诱导分化及染色取第3代胎盘细胞～以2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min, 10 mol/L FBS终止消化～800 r/min离心5 min～PBS 冲洗3遍～分为4组分别以1×105/L细胞数接种于6孔板中～1组加入成骨诱导剂,20 mmol/L β甘油磷酸钠、50 mg/L维生素C～10 mmol/L地塞米松～100 mL/L新生牛血清DMEM培养基,～2组加入脂肪诱导剂,10 mmol/L地塞米松、10 mg/L胰岛素、100 mL/L新生牛血清DMEM培养基,～3,4组为对照组～采用100 mL/L新生牛血清DMEM培养基培养～置37?～50 mL/L CO2孵箱培养～每3~5日换液1次. 取培养10 d后的1～3组细胞～倒掉培养液～多聚甲醛固定30 min～PBS冲洗3遍～茜素红染色8 h～显微镜下观察阳性结果. 取培养7 d后的2～4组细胞～多聚甲醛固定后油红O染色. 2结果 2.1胎盘细胞的原代培养消化胎盘组织获得少量的单个核细胞～约7~14 d后贴壁～从不规则形～逐渐变为梭形～呈漩涡状生长～约4 wk后长满瓶底～胞体呈细长～形态类似成纤维细胞,图2,～1 wk左右传代1次～可稳定传至10代. 流式细胞仪检测显示低表达CD29～高表达CD44和CD105～不表达CD34～CD45和CD19. 细胞的对数生长期约在第2~4日～其倍增时间为39 h,图1,. 流式细胞仪检测发现G0/G1～S～G2/M期的比例分别为20.15%, 72.54%和6.89%. 图1胎盘贴壁细胞生长曲线,略, 2.2胎盘细胞的诱导分化成骨诱导组细胞在诱导10 d时可见细胞呈漩涡状重叠生长～并聚集成团～茜素红染色可见多个散在分布大小、形态各异的不透明棕红色钙化结节. 对照组少见钙化结节,图3,. 成脂肪诱导组细胞在诱导7 d时油红O染色可见细胞中出现多个染色深红的脂肪滴～而对照组中则偶见脂肪滴,图4,. A: 培养10 d,B: 培养28 d. 图2胎盘原代细胞×100,略, A:诱导组; B:对照组. 图3成骨细胞茜素红染色 ×100,略, A:诱导组,B:对照组. 图4成脂细胞油红O染色 ×100,略, 3讨论 早在2000年即有学者从冻存的胎盘组织中分离培养出贴壁细胞,1,～但胎盘间充质干细胞,MSC,的研究尚处于起步阶段. 我们从形态学、免疫学及分化能力等方面加以研究进一步证实胎盘贴壁细胞的生物学特性. 一般认为大多数MSC培养时贴壁～呈成纤维细胞状～因而采用贴壁法获得MSC的研究较多,2,. 胎盘是实体组织～富含血管和间充质成分～我们采用酶消化法～获取细胞沉淀进行培养～与骨髓贴壁细胞相比较～其贴壁时间较长,1~2 wk,～骨髓为72 h,3,～并且胎盘贴壁细胞需28 d左右才能铺满瓶底. 骨髓贴壁细胞大多最初为梭形～7 d左右形成小集落～其后迅速生长～变为均一的长梭形,3,～与胎盘贴壁细胞相似. 另外我们的实验检测到的胎盘贴壁细胞的倍增时间为39 h～文献中为37 h,4,,我们检测细胞周期显示细胞大部分处于分裂期～而以往的报道发现细胞大部分处于静息期,4,～因而胎盘贴壁细胞的特性尚需进一步研究. 目前对于胎盘贴壁细胞的免疫学特点尚无统一的认识～我们的研究发现胎盘贴壁细胞的表型与骨髓MSC相似,5-6,～表达CD29, CD44和CD105～不表达CD34, CD45, CD19, CD44, CD29均为黏附分子～是纤连蛋白和透明质酸盐的受体～在基质细胞中表达较多～这样的结果使我们推测培养的胎盘贴壁细胞中可能包含大量的能表达基质细胞标志的细胞～即MSC～但仅凭细胞形态和少量的表面标志尚不能完全说明贴壁细胞即为MSC～MSC的最重要特性应该是多向分化潜能. 如果胎盘贴壁细胞中含有MSC～理论上讲MSC来源于中胚层～具有向中胚层组织及神经外胚层组织分化的能力,7-8,. 我们的实验证明β甘油磷酸钠和低浓度的地塞米松联合诱导后细胞中钙盐沉积～茜素红染色显示产生大量钙化结节～说明其有成骨能力～只有干细胞才具有这种能力. 在诱导体系中维生素C可以促进体外培养细胞合成胶原～形成钙化～能调节ATP及ALP活性～并影响其合成～β甘油磷酸钠可以提供磷离子作为ALP的底物～地塞米松可以增强ALP活性. 而ALP可以破坏钙化抑制剂～启动钙化,8,形成钙盐～茜素红特异性结合钙剂～阳性表现为棕红色～钙的含量愈高染色愈深～是鉴定成骨细胞特性的特异性指标. 我们的实验由于条件限制～只是初步观察胎盘贴壁细胞的特点～ 证明其具有干细胞特性～但尚有许多问题如培养的条件、促进生长的 因子、传代后是否逐渐衰老、诱导后移植的效果等等～需更深入的研 究. 我们的研究提示胎盘贴壁细胞的分离培养具有潜在的临床应用价 值. 【参考文献】 ,1, Jaroscak J, Smith T, Haynesworth S, et al. preliminary characterization of the surface staining of placental derived adherent cells: A potential new source of stroma for umbilicol cord blood (UCB)expansion,C,. Am Soc Hematol, 2000:1-5. ,2, 薜群～苗宗宁～曲静～等. 胎盘间充质干细胞向神经细胞 诱导的实验研究,J,. 江苏医药杂志,2004,30,11,:817-819. ,3, 康非吾, 吴正华. 人骨髓间充质干细胞的分离培养及向成 骨细胞定向分化的实验研究,J,. 口腔颌面外科杂志, 2004,12(4):307-310. ,4, 何津,张毅,江小霞,等. 人胎盘贴壁细胞的分离培养及造血 相关因子表达,J,. 中华血液学杂志～2003,24,12,:652-654. ,5, Guo XM, Wang CY, Wang YH, et al. Experimental study of the isolation, culture and in chondrogenic differentiation of human bone mesenchymal stem cell,J,. Chin J Stomatol, 2003,38:63-66. ,6, 张文元～杨亚冬～贺晨, 等. 骨髓间充质干细胞分离培养 及向成骨细胞表型的诱导分化,J,. 浙江实用医学, 2004,9(6):393- 395. ,7, Dorudi S ,kinrode E, Marshall NC, et al . Genetic detection of lymph node micrometastases in patients with colorectal cancer,J,. Br J Surg, 1998,85(1):98. ,8, Gerhard M～Juhl H, Kalthoff H, et al. Specific detection of carcinoembryonic antigenexpressing tumor cells in bone marrow aspirates by polymerase chain reaction,J,. J Clin Oncol, 1994,12(4):725-729.