碱性磷酸酶的分离纯化

碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与定力学分析 一、实验原理 (一) 碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定 1.机械破碎法制备肝匀浆   低浓度乙酸钠：低渗破膜   低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP 2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP   加入不同有机溶剂重复离心   正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质   33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP   50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP 3.比活性的定义 ＊单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。 ＊通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来示。 ＊ 用以鉴定酶的纯化程度，是酶提取与纯化成功与否的评价指标之一。 4.测定样品的比活性必须测定：   ＊每毫升样品中的酶活性单位数。   ＊每毫升样品中的蛋白质毫克数。 5.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性测定                AKP        4-氨基安替比林  ＊磷酸苯二钠  →→  酚      →→→→ 醌衍生物（红色）                               铁氰化钾    ↓                                         根据红色的深浅用比色法测定酚的含量。 ＊37℃保温15分钟产生1mg酚者为1个酶活性单位。 (二)底物浓度对AKP活性的影响 Km 即为米氏常数，Vmax为最大反应速度 ＊上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。 因此,米氏常数的单位为mol/L。 当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 Vmax, Km = [S]              ＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km值。 ( 双倒数作图法 （三）PH对AKP活性的影响 酶的催化活性与环境pH有密切关系，通常各种酶只在一定pH范围内才具有活性，酶活性最高时的pH，称为酶的最适pH，高于或低于此pH时酶的活性都逐渐降低。不同酶的最适pH不同。酶的最适    pH不是一个特征性的物理常数，对于一个酶，其最适pH因缓冲液和底物的性质不同而有差异。 （四）温度对AKP活性的影响   酶的催化作用受温度的影响很大，一方面与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速度。通常温度每升高10℃，反应速度加快一倍左右，最后反应速度达到最大值。另一方面酶的化学本质是蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。因此，反应速度达到最大值以后，随着温度的升高，反应速度反而逐渐下降，以至完全停止反应。反应速度达到最大值时的温度称为某种酶作用的最适温度。高于或低于最适温度时，反应速度逐渐降低。 二、实验材料   （一） 样品：兔肝   （二） 试剂：     1. 0.5mol/l乙酸镁溶液     2. 0.1mol/l乙酸钠溶液     3. 0.01mol/l乙酸镁-0.01mol mol/l乙酸钠溶液     4. 0.01mol/l Tris -0.01mol/l乙酸镁ph8.8缓冲液     5.丙酮（分析纯）  6.  95%乙醇（分析纯）     7. 正丁醇 （分析纯）     8. 0.04mol/l 底物液     9.1mg/ml 酚液     10. 0.5mol/l NaOH     11. 0.3% 4-氨基安替比林     12. 0.5% 铁氰化钾     13. 0.1mg/ml 蛋白质标准液     14. 碱性铜试剂     15. 酚试剂     16. 0.1mol/l 碳酸盐缓冲液ph10(37℃ )     17. ph缓冲液       0.2mol/l甘氨酸溶液、0.2mol/l NaOH 溶液   试剂（ml）  1    2    3    4    5    6    7    8    9      甘氨酸溶液  10      10  10  10  10  10  10  10  10    NaOH溶液  0.2    0.6  1.6  3.8  6.2  8.4  9.8  10.4  10.8   H2O        11.8  11.4  10.4  8.2  5.8  3.6  2.2  1.6  1.2   最终PH    8    8.5  9    9.5  10  10.5  11  11.5  12        （三）仪器和器材     1.研钵     2.刻度离心管     3.刻度吸管     4.电动离心机     5.玻璃漏斗和玻棒     6.托盘天平     7.恒温水浴     8.可见光分光光度计 实验步骤 （一） AKP的提取 步骤 操作 （1） 匀浆 （2） 除杂蛋白 （3） 丙酮沉淀AKP （4） AKP溶解 2g新鲜突感剪碎，加入0.01mol/L乙酸镁-0.01mol/L乙酸钠溶液6.0ml,研磨成匀浆。倒入刻度离心管中，记录其体积，此为A液。 吸取A液0.1ml于另一试管中，加酸碱度为8.8的Tris缓冲液4.9毫升稀释，此为稀释A液（1：:50），共测比活性用。 在A液中加入正丁醇2.0毫升，用玻璃棒充分搅拌2min,室温放置20分钟，用滤纸过滤 滤液至于刻度离心管中，加入等体积的冷丙酮，立即混匀离心（2000r/min）5min 沉淀加入0.5mol/L乙酸镁4.0毫升，用玻璃棒充分搅拌使其溶解，记录其体积，此为B液。去B液0.1毫升于另一试管中，加入酸碱度为8.8的Tris缓冲液4.9毫升，此为B液，供动力学试验用 (二)AKP的比活性测定 1、AKP的比活性测定 步骤 操作 1. 加缓冲液 2. 温育 3. 加酶和底物 4. 酶促反应 5. 加显色液 6. 显色反应 7. 测吸光度 取试管3支，按表操作 试剂ml          测定管    标准管  空白管 PH8.8Tri缓冲液                1.0 0.04mol/L底物液    1.0      1,0      1.0 37度水浴预温5分钟 0.01mg/ml 标准酚应用液        1.0 待测液            1.0    37°准确保温15分钟 0.05mol/lNAOH          1.0      1.0      1.0 0.3%4- 氨基安替比林  1.0      1.0      1.0 0.5% 铁氰化钾        2.0      2.0      2.0 混匀，室温放置10分钟 510nm处测吸光度 2、蛋白质含量测定 步骤 操作 1. 反应体系设置 2. 反应 3. 加酚试剂 4. 显色反应 5. 比色反应 取3支试管 试剂            测定管    标准管    空白管 PH8.8Tris缓冲液  --      --          1.0 待测酶液        1.0 蛋白质标准液                1.0 碱性铜试剂        5.0      5.0          5.0 混匀后室温放置10分钟   酚试剂0.5mol   混匀后室温放置30分钟 在 650nm处比色 实验二 实验步骤 1. 底物浓度对酶促反应速度的影响 将新鲜兔肝用PH10  0.1mol /L 碳酸缓冲液匀浆，按20倍稀释即可 步骤 操作 1. 反应体系设置 2. 保温 3. 加酶 4. 酶促反应 5. 终止反应 6. 加显色剂 7. 显色 8. 比色测定 9. 反应速度计算 10. 曲线绘制 取6支试管编号 试剂        1    2    3    4      5    6  0.01mol/l底物液  0.10 0.20 0.30  0.50  1.00  -- PH10  0.1mol /L     0.70  0.70 0.70  0.70  0.70  0.70 碳酸缓冲液匀浆  蒸馏水            1.10  1.00  0.9  0.7  0.20  1.20 37度水浴中保温5分钟 各管分别加入兔肝稀释匀浆0.1ml 混匀，立即记录时间，将各管准确保温15分钟 各管分别加入碱性溶液1.0ml 各管分别加入0.3%4- 氨基安替比林1.0ml  0.5% 铁氰化钾 2.0ml 充分混匀，放置15分钟 以6号空白管作对照，与510nm波长处比色测定 根据酚标准曲线计算出每管样品酚的含量，算出反应速度 一个管底物浓度的倒数为横坐标，以各管反应速度的到时候为纵坐标，作图求出Km值  2. 酚标准曲线的绘制 步骤 操作 1. 反应体系设置 2. 预加热 3. 加显色剂 4. 显色反应 5. 比色测定 6. 曲线绘制 取洁净的干燥试管6支，依次加入试剂 试剂      1    2  3    4    5    6 0.1mg/ml    0.05 0.10 0.20 0.30 0.40 酚标准溶液 蒸馏水  2.0  1.95 1.90 1.80 1.70 1.60 37度水浴中保温5分钟 碱性溶液  1.0 1.0  1.0  1.0  1.0  1.0 0.3%4- 氨基  1.0  1.0    1.0    1.0  1.0    1.0 安替比林 0.5% 铁氰化钾 2.0  2.0    2.0    2.0    2.0    2.0 混匀后，室温放置15分钟 510nm波长处比色 以酚含量ug 为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制酚标准曲线 注意事项 1. 血清取量要准确 2. 标准曲线必须是经过原点的一条直线 实验三  实验步骤 一、 ph-酶活性曲线的制作 步骤 操作 1. 加酶与缓冲液 2. 预保温 3. 加底物 4. 酶促反应 5. 加显色液 6. 显色反应 7. 测吸光度 8. 曲线绘制 取10支试管，按表操作 试剂ml         1   2    3    4  5    6    7    8    9  空白 反应PH          8  8.5  9  9.5  10  10.5  11  11.5  12  10 相应PH缓冲液  0.5 0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5 酶液            0.1  0.1  0.1  0.1  0.1  0.1  0.1  0.1  0.1  空白 37度预保温5分钟 各管分别加入37度预热底物液3ml 37度水浴中精确保温15分钟 碱性溶液      1.0  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0 0.5%铁氰化钾    2.0  2.0  2.0  2.0 2.0  2.0  2.0  2.0  2.0  2.0 酶液            -    -    -    -  -    -    -    -    -  0.1 室温静置10分钟 测定510nm吸光度 以反映PH为横坐标，以510nm吸光度为纵坐标，绘制ph-酶活性曲线 二、 酸碱稳定范围的测定 步骤 操作 1. 加酶与缓冲液 2. 保温处理 3. 加底物 4. 酶促反应 5. 加显色液 6. 显色反应 7. 测吸光度 8. 曲线绘制 取10支试管， 试剂ml        1  2  3  4    5    6  7    8    9  空白 反应PH        8. 8.5  9  9.5  10  10.5  11  11.5  12  10 相应ph缓冲液 0.5  0.5 0.5 0.5 0.5 0.5  0.5  0.5  0.5  0.5 酶液          0.1  0.1  0.1 0.1 0.1 0.1  0.1  0.1  0.1  -- 37度水浴中保温处理5分钟 0.1mol/l ph10  0.5  0.5  0.5 0.5 0.5 0.5 0.5  0.5  0.5  0.5 碳酸盐缓冲液 37度预热底物  3.0  3.0  3.0  3.0 3.0 3.0 3.0  3.0  3.0  -- 37度水浴中保温处理5分钟 碱性溶液      1.0  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0 0.5%铁氰化钾  2.0 2.0  2.0  2.0 2.0  2.0  2.0  2.0  2.0  2.0 37度预热底物液 -    -    -    -  -  -    -    -    - 0.1 室温静置10分钟 测定510nm吸光度 以反映ph 为横坐标，以510吸光度为纵坐标，绘制酸碱稳定性曲线 实验四 实验步骤 一、温度-酶活性曲线的制作 步骤 操作 1. 加酶及底物 2. 酶促反应 3. 加显色剂 4. 显色反应 5. 侧吸光度 6. 曲线绘制 去9支试管 反应温度        25    30  35  37  40  50  70  80  37 酶液            0.1  0.1  0.1  0.1  0.1  0.1  0.1  0.1  -- 37度预底物液  3.0  3.0  3.0  3.0  3.0  3.0 3.0  3.0  3.0 不同温度水浴中精确保温15分钟 碱性溶液        1.0  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0 0.5%铁氰化钾    2.0  2.0  2.0  2.0  2.0  2.0  2.0  2.0  2.0 酶液            --    --  ---  --  --  --  --    --  0.1 室温静置10分钟 测定510nm吸光度 以反映ph为横坐标，以510nm吸光度为纵坐标，绘制酸碱稳定性曲线 二、 热稳定性 步骤 操作 1、 酶液热处理 2、 冷却 3、 加底物液 4、 酶促反应 5、 加显色液 6、 显色反应 7、 测吸光度 8、 曲线绘制 取16支试管         1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16 温度  30  30  30 40  40  40 0  50 0  60  60  60  70  70  70  30 时间  15  30  60 15  30  60 15 30 60  15 30  60  15  30  60  15 酶液  0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1  0.1  0.1   0.1 0.1   0.1 相应温度相应时间的恒温水浴后，取出，立即以流动水冷却，并置37度恒温水浴锅中预热2分钟 各管中分别加入37度预热底物液3ml 37度 水浴中精确保温15分钟 碱性溶液        1.0  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5%铁氰化钾    2.0  2.0  2.0  2.0  2.0  2.0  2.0  2.0  2.0 2.0  2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 酶液            --    --  ---  --  --  --  --    --  --  --  --  --  -  -  - 0.1 室温静置10分钟 测定510nm吸光度 以处理温度为横坐标，以510nm吸光度为纵坐标，分别绘制处理时间为15.30.和60分钟的3处热稳定曲线