剑叶龙血树树脂中的植物防卫素

剑叶龙血树树脂中的植物防卫素 应 用 生 态 学 报 1999 年 4 月 第 10 卷 第 2 期 () CHIN ESE J OU RNAL O F A PPL I ED ECOL O GY ,Ap r . 1999 ,10 2?255,256 3 剑叶龙血树树脂中的植物防卫素 3 3 ()王锦亮 阮德春 程治英 中国科学院昆明植物研究所 ,昆明 650204 周立刚 Phytoalexins in D r acaena cochi nchi nensis resin . Wang J inliang , Ruan Dechun , Cheng Zhiying and Zhou Ligang ( ( ) ) Ku n m i n g I nst i t ute of B ot any , A cadem i a S i nica , Ku n m i n g 650204. 2Chi n . J . A p pl . Ecol . , 1999 , 10 2:255, 256 . Af ter t he t runk of D racaen a cochi nchi nensis was separately inoculated wit h Fusa ri u m g ra m i n u m var . d racaen a , F. g ra m i n u m var . y u n n anensis and Cl ados pori u m ca r pop hil u m for 5,15 days , small red circles emerged around it s in2 oculated positio ns and gradually enlarged wit h increasing days , and t he redness also gradually became deep . Antif ungal experiment and HPL C analysis co nfirmed t hat 7 , 4’2di hydro xyflavan , 72hydro xy24 ’2met ho xyflavan and Loureirin A were t he t hree p hytoalexins which were ext racted and identified f ro m t he red xylems. Key words Drago n’s blood resm , D racen a cochi nchi nensis , Phytoalexins. 国科学院西双版纳热带植物园药厂 1990 年 3 月出产由剑叶龙 1 引言 血树树脂为原料的云南雨林牌血竭中分离得到 . 2 . 4 HPL C 分析测定( ) 剑叶龙血树 D racaen a cochi nchi nensis 系龙舌兰科龙血树 色 谱 条 件 : 色 谱 柱 N218 chro mato poekings center 4 ×属 ,常绿乔木或灌木 , 在云南主要分布于勐连 、勐 腊 、思 茅 、普 - 1 150mm ;流 动 相 甲 醇 : 水 = 7 ? 3 ; 流 速 0 . 4ml ?min ; 波 长 洱 、沧源 、景东等县 . 在广西也有分布 . 剑叶龙血树现已成为我 3 280nm ,定量方法为外标法 . 标准曲线 : 称取标样化合物 1 、2 和国传统中药血竭的主要基源植物之一. 近几年 ,对血竭化学 - 1 3 为 0 . 995 、1 . 07 、1 . 01mg ?min , 分 别 用 微 量 注 射 器 吸 取 成分 、血竭树脂形成的机理以及血竭树脂的化学生态学进行了 μμ1 ,21 . 300 、2 . 100 和 3 . 300l 臵于 10l 容量瓶内 ,用甲醇定容后 ,分 , 初 步 证 明 国 产 血 竭 是 由 禾 谷 镰 刀 菌 龙 血 树 变 种研 究 μ别称取上述混合标物 5 、10 、15 、20 、25l 进行色谱测定 ,数据处 ( ) Fusa ri u m g ra m i n u m var . d racaen a等真菌侵入剑叶龙血树树 理机设定峰面积 ,以峰面积值为 Y 轴 ,以防卫素量为 X 轴作标 干后逐渐形成的 . 植物被致病菌侵染或外来刺激受伤后 ,便会 准曲线 ,计算得到线性方程 ,3 个化合物分别为 Y = 1 . 00 . 4 ,7 产生防卫反应而形成相应的防卫素. 本文仅对剑叶龙血树 2 . 5 抗菌试验 被禾谷镰刀菌等真菌感染后形成的植物防卫素作一报导 ,这也在马铃薯培养基中接入枝孢嗜果疮霉菌 ,制成平板 . 在琼 是从龙舌兰科龙血树属植物中得到的植物防卫素 .脂营养培养基上分别接入禾谷镰刀菌龙血树变种和禾谷镰刀 菌云南变种制成平板 ,用灭菌的滤纸片沾取 2 . 5 %浓度的待测 2 材料与方法 样品分别放入不同菌种的培养皿中 ,在 28 ?下放臵 2, 3d. 以 2 . 1 供试菌种 () 空白滤纸片作对照 ,测量抑菌圈的大小 以 mm 为单位. ( 禾谷镰刀菌龙血树变种 、禾谷镰刀菌云南变种 Fusa ri u m 3 结果与讨论) ( g ra m i n u m var . y u n n anesis和枝孢嗜果疮霉 Cl ados pori u m ca r2 2 ) pop hil u m 3 个 ,菌种发酵液的制备见江东福等.3 . 1 防卫素含量变化 2 . 2 接种和提取 在勐连县城郊石灰岩山坡上选自然生长的大禾谷镰刀菌龙血树变种 、禾谷镰刀菌云南变种及枝孢嗜果 树 3 株 . 用注 疮霉 3 个菌种分别接种于龙血树树干后 ,第 3 天观察到受伤部 ( 射器将上述 3 种菌种发酵液分别接种于龙血树枝条上 接种前 位的周围出现略带红色的小圈 ,5d 后这个小圈呈鲜红色 ,10 和) 取样 , 作 为 原 始 对 照 . , 每 棵 大 树 接 种 各 菌 种 30 , 40 个 点15d 后这个红色小圈逐渐扩大 ,红色也逐渐加深 ,经石蜡切片并 () 次. 3 次重复 . 对照为清水 . 接种前取样作为原始对照. 接种后细胞学观察 ,在受伤外围细胞内开始现出着色深的颗粒 ,然后 () 5 、10 、15d 取样观察 ,每次取样 10,12 个点 次. 样品从枝条上 增多 ,10d 后这些着色颗粒开始聚集并逐步呈块状 . 又经 TL C切下后切碎晒干 , 称取切碎的样品 6 , 9g ,用索氏抽提器加入 薄层检查 ,未接种的龙血树树干木质部的甲醇提取液与接种后( ) 250ml 甲醇回流提取 8,10 h ,减压浓缩至干 ,过硅胶柱 10g, 3 、5 、10 、15d 的样品甲醇提取液比较 ,显示接种后提取液在薄层 用 100ml 氯仿洗脱 、浓缩 ,甲醇定容待测定 . 提取和测定重复 2( ) 3 国家自然科学基金 39170151和云南省自然科学基金资助项目 次 .( ) 97CO37Q. 2 . 3 标样化合物3 3 通讯联系人. 1998 - 06 - 09 收稿 ,1998 - 10 - 18 接受. 7 ,4’2二羟基黄烷 、72羟基24’2甲氧基黄烷和 Loureirin A 从中 上化合物的数量明显增多 . 运用 HPL C 方法检查与 TL C 方法3 . 2 防卫素抗菌活性 3 个防卫素抗菌活性见表 2 . 综合上述结果 ,7 ,4’2二羟基黄 的结果一致 ,峰数明显增多 . 根据 HPL C 中的保留时间 ,其中 7 , 4’2二羟基黄烷 、72羟基24’2甲氧基黄烷和 Loureirin A 3 个化合物 烷 、72羟基24’2甲氧基黄烷和 Loureirin A 应是剑叶龙血树受禾谷 ( 在龙血树树干中从无到有 ,并且 5 、10 、15d 的含量逐步增加 表 镰刀菌龙血树变种 ,禾谷镰刀菌云南变种以及枝孢嗜果疮霉感 ) 1. 此外 ,从对照部分也能测得上述 3 种化合物的含量 ,其含量染后形成的植物防卫素 ,其化学结构如图 1 所示 .也呈增加趋势 ,只是其增加趋势要缓慢 ,含量要明显偏低 ,可以 认为 ,产生原因与试验在自然林中进行有关 ,龙血树树干未作 任何杀菌处理 ,因而注射器的机械损伤为树干上的真菌微生物 提供了侵入的机会 ,这与自然环境中血竭形成相似 . 因此 ,它们 也佐证了血竭形成与真菌侵入有关. 表 1 3 个化合物的含量变化 Ta ble 1 Content of three compounds ( )含量 Co ntent % 菌名 天数 Days Fungus 7 ,4’2二 72羟基24’2 Lo ureirin A 羟基黄烷 甲氧基黄烷 7 ,4’2dihydr2 72hydro xy24’2 o xyflavan met ho xyflavan 图 1 3 种化合物的化学结构 0 - - - Fig. 1 Chemical st ruct ure of t hree co mpo unds. 枝孢嗜果疮霉 - 5- 5Cl a dos pori u m 5 - 4 . 89 ×10 8 . 75 ×10 A. Lo ureirin A , B. 7 ,4’2二羟基黄烷 7 ,4’2dihydro xyflavan , C. 72羟基24’2 - 3- 4- 4ca rpop hi l u m 10 6 . 83 ×10 5 . 41 ×10 3 . 52 ×10 甲氧基黄烷 72hydro xy24’2met ho xyflavan . - 3- 3- 415 7 . 74 ×10 1 . 06 ×10 7 . 37 ×10 0 - - - 禾谷镰刀菌 致谢 所有光谱由中国科学院昆明植物研究所植化室仪器组 - 5- 5F. g ra m i u m 5 - 5 . 54 ×10 3 . 29 ×10 测定 ,云南省微生物研究所崔晓龙 、江东福参加部分野外接种 - 4- 4- 3var . d racaena 10 1 . 57 ×10 1 . 97 ×10 1 . 82 ×10 试验 ,一并致谢 . - 2- 3- 315 2 . 97 ×10 5 . 05 ×10 3 . 77 ×10 0 - - - 禾谷镰刀菌 - 5- 55 - 参考文献 云南变种 4 . 83 ×10 2 . 46 ×10 - 3- 410 F. g ra m i u m - 1 . 29 ×10 1 . 31 ×10 - 2- 3- 215 var . y u n na nensis 2 . 79 ×10 2 . 01 ×10 2 . 09 ×10 1 王锦亮等. 1995 . 云南血竭的化学成分及抗菌活性. 云南植物研究 , 0 C K - - - ( ) 17 3:336,340 . - 5- 55 - 2 . 20 ×10 1 . 64 ×10 江东福等. 1995 . 龙血树真菌群及其对血竭形成的影响. 云南植物 2 - 4- 5- 510 5 . 34 ×10 6 . 12 ×10 5 . 76 ×10 ( ) 研究 ,17 1:79,82 . - 5- 4- 4 15 9 . 10 ×10 6 . 29 ×10 7 . 06 ×10 3 蔡希陶 、许再富. 1979 . 国产血竭植物资源研究. 云南植物研究 , 1 ( ) 2:1,10 . 表 2 3 个化合物的抗菌活性( 抑菌圈直径 mm) 4 Co xo n ,D. T. ,O’Neill , J . M . , Mansfield , J . W. et al . 1980 . Phy2 Ta ble 2 Antif ungal activity of three compounds toalexins f ro m Daf f odi l bul bs . Phytoche m ist ry ,19 :889,891 . Lo ureirin A 7 ,4’2二羟 72羟基24’2 菌名 Gho sal ,S. , Kumar , Y. , Chakrabarti , D. K. et al . 1986 . Parasitism 5 基黄烷 甲氧基黄烷 Fungus of I m pert a cyli n d uca o n pancratium biflo rum and t he co nmitant chem2 7 ,4’2dihydr2 72hydro xy24’2 o xyflavan met ho xyflavan ( ) ical changes in t he ho st species. Phytoche m ist ry , 25 5:1097,1102 . 15 . 0 10 . 1 15 . 0 6 Grayer , R. J . , Harbo rne , J . B. 1994 . A survey antif ungal co mpo unds 枝孢嗜果疮霉 ( ) f ro m higher plant s. Phytoche m ist ry ,37 1:19,42 . Cl a dos pori u m Tverskoy ,L . , Dmit riev ,A. , Kozlovsky , A. et al . 1991 . Two p hy2 ca rpop hi l u m 7 ( ) toalexins f ro m A l li u m cepabul bs . Phytoche m ist ry ,30 3:799,800 . 12 . 0 11 . 5 11 . 0 禾谷镰刀菌 Fusa ri u m g ra m i u m var . d racaena 11 . 0 11 . 0 11 . 0 禾谷镰刀菌云南变种 作者简介 王锦亮 ,男 ,1939 年生 ,副研究员 ,主要从事植物与 Fusa ri u m g ra m i u m () 微生物 真菌之间的化学生态学研究 ,已发表论文 30 多篇 . var . y u n na ncnsis