3种海藻凝集素组分及糖抑制作用的初步研究_cropped

3种海藻凝集素组分及糖抑制作用的初步研究_cropped () 植物资源与环境学报 2002 , 11 4: 19 - 21 J ournal of Plant Resources and Environment 3 种海藻凝集素组分及糖抑制作用的初步研究 1 2 1 郑 怡, 余萍, 刘燕如 ()1 . 福建师范大学生物工程学院 ,福建 福州 350007 ; 2 . 福建师范大学高分子研究所 ,福建 福州 350007 (摘要 : 从 3 种海藻 铁钉菜 Ishige okamurae Yenda 、坛紫菜 Porphyra haitanensis Chang et Zheng 和脆江蓠 Gracilaria bursa2 ( ) ( ) ( ) ) pastoris Silva中分离纯化得到铁钉菜凝集素 IOL、坛紫菜凝集素 PHL及脆江蓠凝集素 GBL。经测定 ,它们分别 含有 7 % 、14 %和 11 %的中性糖 。氨基酸组成中 ,苯丙氨酸含量最高 ,蛋氨酸和精氨酸次之 。3 种海藻凝集素的凝 血活性均可被单糖或双糖所抑制 ,在所测试的 13 种糖类中 ,能够抑制 GBL 活性的糖类最多 ,达 5 种 ,抑制 IOL 的糖 () 类最少 ,仅 2 种 。3 种糖蛋白 胃粘蛋白 、卵粘蛋白和甲状腺球蛋白对 IOL 没有抑制作用 ,而卵粘蛋白能够抑制 PHL和 GBL 的凝血活性 。 关键词 : 海藻 ;凝集素 ;组分 ;糖 () 文章编号 : 100420978 20020420019203 中图分类号 : Q946 ; Q949. 2 文献标识码 : A 1 Preliminary studies on component and sugar inhibition of three marine algal lectins ZHENG Yi, YU 2 1 ( Ping, L IU Yan2ru1 . Bioengineering College , Fujian Teachers University , Fuzhou 350007 , China ; 2 . ) Institute of Polymer , Fujian Teachers University , Fuzhou 350007 , China, J . Plant Resour. & Environ . () 2002 , 11 4: 19 - 21 ( ) Abstract : Three kinds of algal lectin IOL , PHL and GBLwere extracted and purified from three marine ( ) algae Ishige okamurae Yenda , Porphyra haitanensis Chang et Zheng and Gracilaria bursa2pastoris Silva. They contain 7 % , 14 % and 11 % neutral saccharide , respectively. In their amino acid composition , Phe has the highest content , followed by Arg or Met . Agglutinic activities of these lectins were inhibited with the presence of some mono2 or bi2saccharides. In sugar inhibition , there were the most numbers of sugars which inhibited the agglutinic activity of GBL and the fewest numbers of sugars which inhibited the agglutinic activity () of IOL . Three kinds of glycoproteins Mucin , Ovalbumin and Thyroglobuindid not inhibit the activity of IOL , but Ovalbumin showed inhibition for the activities of PHL and GBL . Key words : marine algae ; lectin ; component ; sugar 凝集素是一类能识别和结合碳水化合物的糖蛋 白或蛋白质分子 。由于它独特的生物化学性质 ,使 材料与方法 1 其在医学和生物研究上具有广泛的用途 。凝集素存 在于各种生物体中 ,在植物凝集素中 ,研究最多的是 1 1. 1 材料与试剂 种子植物凝集素,而低等的藻类植物凝集素的研 2 ,3 ( 实验 用 的 坛 紫 菜 Porphyra haitanensis Chang et究则很少 ,主要来源于对海藻凝集素的研究,研 究明它们的某些理化性质和生物学功能与种子植 ) Zheng购于农贸市场 ,另 2 种海藻于 2000 年 5 月采 4 物凝集素不同。我国海藻种类繁多 ,是研究和开 ( 自福建 平 潭 岛 , 经 鉴 定 为 褐 藻 门 的 铁 钉 菜 Ishige 发凝集素的重要资源 。本文从产于我国的 3 种海藻 ( ) okamurae Yenda和红藻门的脆江蓠 Gracilaria bursa2 ) pastoris Silva , 冰 箱 内 冷 冻 保 存 。层 析 用 的 填 料 为 ( Ishige okamurae Yenda 、坛 紫 菜 Porphyra Pharmacia产 品 , 乙 酰 葡 萄 糖 胺 和 岩 藻 糖 为 进 口 产铁 钉 菜 haitanensis Chang et Zheng 和脆江蓠 Gracilaria bursa2 ) pastoris Silva中 ,分离提纯了 3 种凝集素 ,分别测定 收稿日期 : 2002205231 ()基金项目 : 福建省自然科学基金资助项目 B0110009 了糖和氨基酸含量 ,并进行了糖和糖蛋白抑制实验 , () 作者简介 : 郑 怡 1959 - , 男 , 福建福州人 , 硕士 , 副教授 , 主要从 为海藻凝集素的研究和应用提供科学资料 。 事海藻学研究 。 ( ) ( ) IOL、脆江蓠凝集素 GBL 及坛紫菜凝集素 凝集素 品 ,其他试剂和糖类为国产产品 。实验用兔子购自 ( ) PHL, 经兔红细胞凝血活性测定 ,它们的最低凝血 福建省药品检验所 ,由静脉抽血 ,离心收集红细胞 , μ浓度分别为 15 . 72 、2 . 34 和 12 . 5 gΠL ,其中 GBL 对 加生理盐水离心洗涤 2 遍 , 以生理盐水配制成 2 % 兔红细胞的凝集活性最大 。 的红细胞悬液 。 2. 2 海藻凝集素的糖含量 1. 2 实验方法经酚2硫酸法测定 ,铁钉菜凝集素 IOL 、脆江蓠凝 1. 2 . 1 海藻凝集素的提纯 海藻样品解冻后 ,用蒸 集素 GBL 及坛紫菜凝集素 PHL 的中性糖含量分别 馏水洗净 , 剪碎 ,置于高速组织捣碎机内 ,加少量磷 为 7 % 、11 %及 14 % ,以 PHL 中糖的含量最高 。 () 酸盐缓冲液 0 . 05 molΠL , p H 7 . 2捣碎成匀浆 ,4 ?下 2. 3 海藻凝集素的氨基酸组成和含量放置 1 夜后 ,离心 20 min ,收集上清液 ,加入硫酸铵 3 种海藻凝集素的氨基酸组成含量见表 1 。由 达 75 %饱和度 , 4 ?冰箱过夜后 , 5 000 rΠmin 4 ?离 表 1 可知 ,在 3 种海藻凝集素的氨基酸组成中 ,含量 ( 心 2 5 min , 收 集 的 沉 淀 物 加 入 磷 酸 缓 冲 液 0 . 0 2 ( ) 最高的都是苯丙氨酸 Phe,在 IOL 和 PHL 中精氨酸) molΠL , p H 7 . 5溶解 ,透析除盐 ,得到凝集素粗品 , () Arg的含量次之 , 而在 GBL 中含量第二的是蛋氨 经 DEAE2Sepharose 离 子 交 换 层 析 和 Sephadex G2100 () 酸 Met 。3 种 凝 集 素 中 , PHL 的 总 氨 基 酸 含 量 最 高 。IOL 含有所测试的各种氨基酸种类 ,而 PHL 缺 分子筛层析 ,收集活性峰部分 ,得到 3 种纯化的海藻 5 ( ) ( ) ( ) 乏酪氨酸 Tyr, GBL 缺少酪氨酸 Tyr、脯氨酸 Pro凝集素 ,蛋白质浓度测定采用 CBB2G250 法。 ( ) ( 及组氨酸 His。3 种海藻凝集素的碱性氨基酸 精 海藻凝集素糖含量的测定 采用酚2硫酸法 1 . 2 . 2 ) 氨酸 Arg 、组氨酸 His 及赖氨酸 Lys含量超过酸性氨 6 测定,以葡萄糖作 。 海藻凝集素氨基酸组成() 基酸 谷氨酸 Glu 和天门冬氨酸 Asp含量 。 1 . 2 . 3 和含量的测定 按 2. 4 糖和糖蛋白的抑制作用 常规方法处理后 ,用日立 835250 型氨基酸自动 在 3 种海藻凝集素中 ,能够抑制 GBL 凝血活性 仪测定 。() 的糖类最多 ,达 5 种 见表 2,即 GBL 可结合的糖类 1 . 2 . 4 糖和糖蛋白的抑制实验 13 种糖类溶液按() 最多 ,包括单糖和双糖 ,其中阿拉伯糖 Ara和麦芽 80 mmolΠL 配制 ,3 种糖蛋白溶液按 15 gΠL 配制 。先 () ( ) 糖 Mal的抑制作用最强 , 葡萄糖 Glc的抑制作用 将每种凝集素样品在 V 型血凝板上作系列倍比稀 最弱 。能够抑制 PHL 的糖类有 4 种 ,包括 3 种单糖 μ释后 ,再分别往每孔中加入 25 L 的糖或糖蛋白溶 μ液 ,震荡摇匀后 ,每孔加入 25 L 的 2 %兔红细胞悬 () () () Ara , Gal , Xyl和 1 种双糖 Mal ,其中麦芽糖 Mal 液 ,摇匀 ,放置 1 h 后镜检 。 的抑制作用最强 。而能够抑制 IOL 凝血活性的糖类 ( ) 最少 ,只有麦芽糖和 N2乙酰葡萄糖胺 GlcNac2 种 , 即 IOL 结合的糖类最少 。 2 实验结果 由表 3 可知 , 3 种糖蛋白对 IOL 的凝血活性均 无抑制作用 ,但卵粘蛋白可抑制 PHL 和 GBL 的凝血 2. 1 海藻凝集素的提纯 活性 ,表明卵粘蛋白上有被它们识别的糖链 。 3 种海藻样品经磷酸盐缓冲液提取和硫酸铵沉 淀 ,再经离子交换和分子筛层析 ,获得纯化的铁钉菜 表 1 3 种海藻凝集素的氨基酸组成 Ta ble 1 Amino acid composition of three marine algal lectins μ()氨基酸含量 Content of amino acid gΠL ) 1 凝集素1)总量 Lectin Aap Thr Ser Glu Gly Ala Cys Val Met Iie Leu Tyr Phe Lys His Arg Pro Total PHL 12 . 41 6 . 58 7 . 37 19 . 44 8 . 92 9 . 51 18 . 79 12 . 62 25. 18 12 . 48 13 . 89 9 . 75 30 . 52 14 . 88 3 . 86 25. 74 11 . 83 243 . 76 IOL 8 . 75 5 . 27 5 . 89 8. 07 4 . 99 7 . 18 27 . 92 11 . 16 41. 99 10 . 05 7. 55 0 . 00 45 . 72 12 . 30 0 . 00 35. 52 0. 00 232 . 37 GBL 19 . 54 8 . 01 8 . 97 20 . 94 9 . 93 14 . 42 24 . 80 15 . 70 30 . 68 13 . 47 15 . 98 0 . 00 48 . 51 19 . 31 5 . 92 40 . 53 5 . 44 303 . 31 )1 PHL : 坛紫菜凝集素 Lectin of Porphyra haitanensis Chang et Zheng ; IOL : 铁钉菜凝集素 Lectin of Ishige okamurae Yenda ; GBL : 脆江蓠凝集素 Lectin of Gracilaria bursa2pastoris Silva 第 4 期 郑 怡等 :3 种海藻凝集素组分及糖抑制作用的初步研究 21 表 2 糖对 3 种海藻凝集素凝血活性的抑制作用 Ta ble 2 Inhibition of agglutination of three marine algal lectins by sugars 2))2 Inhibition 抑制作用 1)ααN2乙 2甲 2甲 凝集素1)酰葡萄 基葡 基甘露 阿拉伯糖 果糖 岩藻糖 半乳糖 葡萄糖 乳糖 麦芽糖 甘露糖 山梨糖 木糖 对照 Lectin Ara Fru Fuc Gal Glc Lac Mal Man Sor Xyl CK 糖胺萄糖苷糖苷ααGlcNAc 2Me Glc 2MeMan IOL + + + + + + 15 . 6 + + + 7 . 8 + + + PHL 12. 5 + + 12 . 5 + + 50 . 0 + + 12 . 5 + + + + GBL 75 . 0 + + + 4 . 68 9 . 37 75 . 0 + + 9 . 37 + + + + )1 IOL : 铁钉菜凝集素 Lectin of Ishige okamurae Yenda ; PHL : 坛紫菜凝集素 Lectin of Porphyra haitanensis Chang et Zheng ; GBL : 脆江蓠凝集素 )2 Lectin of Gracilaria bursa2pastoris Silva . 数字表示糖抑制的最大凝集素浓度 The data present the maximum concentration of lectin under sugar (μ) inhibition gΠmL; + : 凝集 agglutination ; 糖的浓度为 80 mmolΠL sugar concentration 80 mmolΠL 表 3 糖蛋白对 3 种海藻凝集素凝血活性的抑制作用 GBL 结合的糖类 ,它们分别属于 N2乙酰葡萄糖胺 、半 Ta ble 3 Inhibition of agglutination of three marine algal lectins by glycoproteins 乳糖及葡萄糖类凝集素 。它们既可与双糖结合 , 也 2) 2)可与单糖结合 ,但大多数海藻凝集素只能与双糖结 抑制作用Inhibition 1) 凝集素8 ,9 3 1)合 ,只有少数可与单糖结合 。Rogers 等 认为海 胃粘蛋白 卵粘蛋白 甲状腺球蛋白 Lectin Mucin Ovalbumin Thyroglobuin 藻凝集素是否与单糖或双糖结合可能与分子量大小 IOL + + + 有关 。 PHL + 400 + GBL + 300 + 在采用亲和柱层析纯化凝集素时 , 需要选择糖 )1 PHL : 坛紫菜凝集素 Lectin of 蛋白与 Sepharose 偶联 。本实验表明卵粘蛋白有 PHL Porphyra haitanensis Chang et Zheng ; IOL : 铁钉菜凝集素 Lectin of Ishige okamurae Yenda ; GBL : 脆江蓠 ) 2 和 GBL 识 别 和 结 合 的 糖 链 , 因 此 亲 和 层 析 PHL 和凝集素 Lectin of Gracilaria bursa2pastoris Silva . 数字表示糖蛋 白 抑 制 的 最 大 凝 集 素 浓 度 The data present the maximum ( ) concentration of lectin under glycoprotein inhibition gΠL; + : 凝集 GBL ,可选择卵粘蛋白与 Sepharose 偶联进行纯化 。agglutination ; 糖蛋白的浓度为 15 gΠL glycoprotein concentration 15 gΠL 参考文献 : 1 张德颐 , 朱治平. 植物分子生物学与生物工程M . 北京 : 科学 出版社 ,1991 . 145 - 158 . 3 讨论 Kakita H , Fukuoka S , Obika H , et al . Purification and properties of a 2 high molecular weight hemagglutinin from the red alga , Gracilaria 植物凝集素的组分随种类而异 。大多数植物凝 verrucosa J . Bot Mar , 1997 , 40 : 241 - 247 . 集素分子中含有糖 ,属于糖蛋白 。但也有少数为单 Rogers D J , Hori K. Marine algal lectin : New developments J . 3 ( ) 纯 的 蛋 白 质 , 如 麦 胚 凝 集 素 WGA、花 生 凝 集 素 Hydrobiologia , 1993 , 260Π261 : 589 - 593 . 7 Hori K , Miyazawa K , Ito K. Some common properties of lectins from ( ) 4 PNA等。本文纯化的 3 种海藻凝集素均含有糖 marine algae J . Hydrobiologia , 1990 , 203 Π205 : 561 - 566 . 分子 ,属于糖蛋白 ,其中 PHL 中糖含量最高 。 Alexander R R , Griffiths J M , Wilkinson M L . Basic Biochemical 5 凝集素的氨基酸组成复杂 , 各种氨基酸的含量 MethodsM. New York : John Wiley & Sons , 1985 . 18 - 19 . 不同 ,与凝集素的某些性质如热稳定和变性等有关 。 Dubosis M , Gilles K A , Hamiltion J K , et al . Colorimetric method for 6 多数植物凝集素含有较高的天门冬氨酸 、丝氨酸及 determination of sugars and related substance J . Anal Chem , 1957 , 7 28 : 350 - 356 . 苏氨酸,但这 3 种氨基酸在 IOL 、PHL 及 GBL 中含 孙 册 ,朱 政 ,莫汉庆. 凝集素M. 北京 : 科学出版社 ,1986 . 7 量都不高 ,3 种海藻凝集素则以苯丙氨酸 、精氨酸或 65 - 66 . 蛋氨酸的含量最高 ,因此 ,海藻凝集素在氨基酸组成 Rogers D J , Fish B C , Brwell C J . Isolation and properties of lectins 8 和含量上可能有别与陆生种子植物凝集素 。 from two red marine algae : Plumaria elegans and Ptilota serrata A . Kocourek J , Freed D. Lectin M . St Louis MO , USA : Sigma 糖和糖蛋白由于能与凝集素分子结合 , 阻止其 Chemical Company , 1990 . 49 - 52 . 与细胞表面糖分子的结合 ,从而抑制凝集素的凝集 Alvarez2Hernandez S , Lara2Isassi G , Arreyuin2Espinoza R. Isolation 9 活性 ,因此通过抑制实验可知某种凝集素能与哪些 and partial characterization of griffin ,a lectin from the Mexican endemic 糖类专一性结合 ,这是凝集素的重要特征之一 ,同时 alga Codium giraff a Silva J . Bot Mar , 1999 , 42 : 573 - 580 . 1 也可作 为 凝 集 素 的 分 类 依 据。根 据 IOL 、PHL 和