高效液相色谱与荧光法测定细菌染色体碱基组成的比较

高效液相色谱与荧光法测定细菌染色体碱基组成的比较 〃论著〃 高效液相色谱与荧光法测定细菌染色体 碱基组成的比较 许化溪 王胜军 黄锡全 李娜 江崎孝行 刘恭植 ( ) ( ) 【摘要】 目的 比较连续荧光检测法 荧光法与高效液相色谱 HPLC法测定细菌染色体鸟嘌 ( ) ( 呤 、胞嘧啶百分比 GC %的稳定性 、准确性和适应性 。方法 应用双股 DNA 结合染料 SYBR Green) 1和能够快速升降温度的连续荧光检测仪 ,测定 9 株细菌染色体的变性温度 ?值 ,并根据相应的公式 算出 GC % ; 以 HPLC 法直接检测细菌染色体的 GC % 。结果 DNA 纯度对荧光法测得的 GC %结果无 显著影响 ,但影响 HPLC 的测定结果 ,荧光法 3 次检测获得的 9 株细菌 GC %有 4 株略高于文献值 ,而 HPLC 法测得的结果与文献值完全相符 ;用荧光法测得的标准差 ,7/ 9 的菌株高于 HPLC 法 。结论 荧 光法检测细菌染色体 GC %具有简便 、快速且不受 DNA 纯度影响等优点 ,适用于临床微生物的快速诊 断 。HPLC 法在 DNA 高度纯化的基础上测得的 GC %准确 、可靠 、结果稳定 ,适于细菌分类研究 ,然而 限于对标本纯度的及操作的复杂性 ,难以在临床推广应用 。 【关键词】 细菌染色 ; 高效液相色谱 ; 连续荧光检测仪 Light cycler and high pressure liquid chromatogra phy in determing the guanine plus cytosine content of 3 3 bacterial chromosome D NA XU Huaxi , WANG S hengjun , HUANG Xiquan , et al . Faculty of L aboratory Medicine , Zhenjiang Medical College , Zhenjiang 21001 , China 【Abstract】 Objective To compare stability , accuracy and suitability of Light Gycler and high prescure ( ) liquid chromatography in detecting mole percent guanine plus cytosine content GC %. Methods Light Cycler method , was used following the melting curves and the values of Tm were obtained from the computer screen of ( ) Light Cycler , to calculate the GC % according to the formula : GC %x = GC %r - 8. 567 Tmx2Tmr+ 0. 066 22 ( ) Tmx2Tmr. The GC % of bacterial chromosome DNA was obtained directly by HPLC within 30 min after the samples were loaded. Results By Light Cycler we detected the values of the Tm from 24 samples obtained within 10 min. The purity of DNA was not visiblely affect the result . The GC % from HPLC method was stable and accurate , and it was more similar to the published values. But the procedure for further purification of DNA should be included. Conclusion The Light Cycler is approprate for clinical diagnosis of bacteria because . The HPLC method is accurate and reliable for bacterial classification. 【 Key words】 Bacterial stain ; High performance liquid chromatography ; Light Cycler ( ) 用于临床未知菌鉴定提供方便 。本研究应用连续荧细菌染色体鸟嘌呤 、胞嘧啶百分比 GC %是判 () 荧光法建立一种快速 、简便测定 GC %的 光检测法 断细菌 相 似 度 和 作 为 细 菌 分 类 的 重 要 指 标 之 一 。 方法 ,并对其稳定性 、准确性和适应性与高效液相色 GC %可用在 DNA 变性过程中于波长 260 nm 下测得 ( ) ( ) 谱 HPLC法进行了比较 。 的变性温度 ?值 Tm代入相应的公式算出 。密度 梯度离心也是人们常用的方法 。近年来 ,随着分子 与方法 生物学技术在医学领域应用的日益广泛 ,除需要准 一 、材料确地测定 GC % ,以进行细菌的分类研究外 ,更需要 11 菌 株 来 源 : 9 株 细 菌 , 包 括 嗜 血 流 感 杆 菌简便快速地 GC %检测法 ,直接用于临床分离菌种的 () () ( ) NCTC 8143、嗜肺军团菌 ATCC 33152、伤寒沙门 快速初步分类 ,或为设计聚合酶链反应 PCR引物 () () 菌 ATCC 19430、绿脓假单胞菌 ATCC 10145、粪产 () () 碱杆菌 ATCC 8750、结核菌 ATCC 27294、堪萨斯 ( 作者单位 :212001 江苏省镇江医学院检验医学系 许化溪 、王胜 ) ( () (军 、黄锡全 、刘恭植;日本岐阜大学医学部微生物学教室 李娜 、江 分枝杆菌 ATCC 12478、大肠埃希菌 ATCC 11775 、 )崎孝行 () ) K12金黄色葡萄球菌 ATCC 12600,均获自日本岐 ( ) 阜大学医学部微 生 物 学 教 室 。其 中 绿 脓 假 单 胞 菌0 . 2 mol/ L 磷酸二氢铵 ?乙腈 20 ?1; 选用紫外分光 () () ) ( ATCC 10145、大肠埃希菌 ATCC 11775和金黄色 检出器 270 nm,送液速度为 1,1 . 5 ml/ min 。 () 葡萄球菌 ATCC 12600分别代高 、中 、低 GC %含 结果 量菌株 ,用作建立荧光法的参考菌株 ; HPLC 法的参 考菌株选用大肠埃希菌 、K12 。 11 荧 光 法 的 建 立 及 其 影 响 因 素 : 该 法 受 DNA ( ) 21 试剂 : 双股 DNA 结合染料 SYBR Green1为 量 、SYBR Green 1 和 SSC 缓冲液浓度的影响 。在建 美国 Eugene ,Oregon 产品 ;核糖核酸酶 A 及核糖核酸 立荧光法的过程中 ,我们分别选用最终量为 0 . 05, μμμ( ) 0 . 2g 50,200 g/ ml ,10 l 的 DNA ,4 000 倍稀释 酶 T1 购 自 日 本 Ta Kara 生 物 技 术 公 司 。碱 性 磷 酸 酶 、磷酸二氢铵和乙腈为日本和光制药公司产品 。 的 SYBR Green 1 和 1/ 10,2 倍 SSC 。结果显示 , 高 ) ( 浓度 DNA 100 ng/ ml 以上和 SSC 不利于 Tm 峰值的 31 仪 器 : 连 续 荧 光 检 测 仪 为 美 国 Idaho μ形成 ,其最适浓度分别为 50g/ ml 和 1/ 10 SSC ;若选 Technology 公司产品 ;高效液相色谱仪为日本产品 。 二 、方法 用 1,2 倍 SSC 则测得的 Tm 峰值极低 ,不易测量其 11 细菌染色体 DNA 的分离 : 参见文献 1 , 取 2 Tm 值 。尽管在 1/ 2 SSC 浓 度 下 , 可 获 得 明 显 的 Tm () 峰值 , 但峰高仍明显低于 1/ 10 SSC 浓度时 。此外 , g 左右 湿重经 适 宜 培 养 基 培 养 的 细 菌 , 悬 浮 于 9 ( ml p H8 . 0 、5 mmol/ L EDTA 溶液中 革兰阳性菌需另 随着 SSC 浓度的增加 ,双股 DNA 结合 SYBR Green 1 ) 的能力减弱 , 而 Tm 值增加 , 影响 GC %检测的准确 加最终浓度为 1 mg/ ml 的溶菌酶,加 1 ml 20 %十二 烷基磺酸钠溶液并置 55 ?温育 30 min 。此悬液再与 性 。在上述确定的最适 DNA 量与 SSC 浓度下 ,分别 (() 10 ml 酚2氯仿2异戊醇混合液 25 :24 :1混匀 ,并置振 代表低 、中 、高 GC %含量的金黄色葡萄球菌 ATCC ) () 荡器强力振摇 20 min ,15 000 〓 g 离心 10 min 后 ,取 12600、大肠埃希菌 ATCC 11775和绿脓假单胞菌 () ATCC 10145经连续荧光仪检测后 ,均显示标准的 上清液于另一洁净试管 ,加入 2 倍体积的乙醇 ,并用 玻棒提取 DNA 。再悬浮 DNA 于无菌双蒸水 , - 20 ? S 形热变性曲线 。SYBR Green 1 则以较高浓度为宜 () 保存 。用于 HPLC 测定的 DNA ,则再经大剂量核糖 1?4 000,只有在较高浓度 SYBR Green 1 条件下 , () (才有可能检测到具有高 GC %菌株的 Tm 值 表 1。 核酸酶 A 和核糖核酸酶 T1 终浓度分别为 400 U/ ml 2 ,3 ) 和 100 U/ ml进一步纯化备用。双股 DNA 结合染料浓度对荧光法检测 Tm 值 表 1 μ 21 荧 光 检 测 法 : 1 l 不 同 浓 度 的 细 菌 染 色 体( ) 的影响 x? 〒s μμ() DNA 与 1l 稀释 SYBR Green 1 1?4 000和 8 l1/ 10? ( )Tm 值 ? (SSC 1/ 1 SSC : 0 . 15 mol/ L NaCl , 0 . 015 mol/ L 枸橼酸 ( )DNA 结合染料浓度 稀释倍数 双股 菌株 4 000 8 000 10 000 20 000 ) 钠混合 ,加入毛细离心管 ,10 000 r/ min ,离心 1,2 10 〒 10 〒 9291绿脓假单胞菌 s ,将 毛 细 管 置 荧 光 检 测 仪 的 样 品 检 测 孔 中 , 以ATCC10145 0115 0122 0 . 1 ?/ s的速度升高温度达 98 ?且持续 30 s 。荧光 10 〒 76金黄色葡萄球菌 7911 〒7715 〒ATCC12600 1112 0166 0162 检测 仪 自 动 记 录 DNA 变 性 过 程 中 结 合 的 SYBR 8613 〒8515 〒8510 〒大肠埃希菌 Green 1 量 ,描绘出变性曲线和 Tm 峰 ,并自动换算出 ATCC11775 0156 0144 0141 Tm 值 。按下列公式计算 GC % 。 注 :4 000 、8 000 、10 000 、20 000 表示双股 DNA 结合染料稀释倍数 ( ) GC %x = GC % r - 8 . 567 Tmx - Tmr + 0 . 066 ?在 1/ 10 SSC 浓度条件下测得的 3 次试验结果平均值 , 其 DNA 浓度 2 2( ) Tmx- Tmr, x = 待测菌株 ;r = 参考菌株 。 μ( ) 为 50 g/ ml , :示 Tm 值 ?不能被检测 ,未取得数据 μμ() 31HPLC 法 :10l 含 10g纯化的 DNA ,加热变 ( 性后 , 加入 2 U/ ml 的核酸酶 P1 溶于 p H 5 . 3 、含 2 21 两种方法结果的稳定性比较 : 以 9 株分别代 ) μ( ) 表高 、中 、低 GC %含量的细菌 表 2为检材 ,比较两 mmol/ L 硫酸锌的 40 mmol/ L 醋酸缓冲液中10 l , ( 56 ?放置 60 min ,加入 2 . 4 U/ ml 的碱性磷酸酶 溶 种方 法 测 得 的 平 均 GC % 值 , 结 果 差 异 无 显 著 性 ) μ( ) 解于 p H8 . 3 、0 . 1 mol/ L Tris - HCl 缓冲液10 l ,37 ? P > 0 . 05。其中 HPLC 法测得的结果与已发表的 μ放置 30 min 。注射 5,10l 样品于 HPLC 加样孔中 。 GC %值完全相符 ,3 次测得的标准差明显低于荧光 4 ,5 设定 20 min 测定 , 自动算出 GC %。HPLC 的 测 法 。用荧光法检测的 9 株细菌 GC %有 4 株略高于 ( ) 定条件为 : 逆相分配 5C18, 10 , 15 cm ; 移 动 相 为 文献值 。比较用两种方法检测同一菌株的结果时发 ( ) ( ) 现 ,荧光法测得的标准差 7/ 9高于 HPLC 法 , 尤其 GC %值差异无显著性 P > 0 . 05, 而 HPLC 法则差 (( ) ) () 是高 GC %含量的菌株 表 2。异有明显意义 P < 0 . 01表 3 。 41 结果的准确性及方法的适用性 : 以测得染色 ( )表 2 两种方法测得的 GC %与文献值的比较 x? 〒s 体 DNA 全部序列的菌株为标准 ,与两种方法测得的 ( ) GC % 荧光法 s菌株 ( )Tm ? GC %比较 。结果显示 , HPLC 法的准确性 高 于 荧 光 HPLC 荧光法 文献值 () 法 表 2 。 a15 〒 11 〒 15 〒 783553金黄色葡萄球菌 ,36 33ATCC12600 1100 1107 0101 讨论 a 嗜血流感杆菌8113 〒4016 〒3915 〒38,41 1119 0145 0180 NCTC8143 荧光法是应用微量多样品连续荧光检测仪的一a 嗜肺军团菌8112 〒4014 〒3815 〒39,43 ATCC33152 0142 0110 0176 种方法 ,其快速地调节和控制温度的特点 ,加之特异 b 大肠埃希菌8513 〒5116 〒5015 50150 性 SYBR Green 1 的 问 世 , 使 得 连 续 荧 光 检 测 快 速 0140 0120 ATCC11775 6 28 PCR 法 应 运 而 生 , 并 显 示 良 好 的 应 用 前 景。 b 伤寒沙门菌5714 〒 8718 〒5116 〒,53 500147 1133 0106 ATCC19430 GC %是细菌分类与鉴定的重要指标 ,其检测方法已 c 绿脓假单胞菌9118 〒7018 〒6614 〒66180 有众多研究报道 ,其中快速 、准确的方法当数 HPLC 。 0115 1140 0110 ATCC10145 本试验在应用荧光法建立细菌染色体 GC %测定方 c 粪产碱杆菌8917 〒6315 〒5618 〒56,59 0152 1128 0101 ATCC8750 法的基础上 ,检测了分别代表低 、中 、高 GC %含量的c 结核菌9014 〒6519 〒6515 〒 9 株细菌 ,并与 HPLC 法进行了比较 。探讨了 SSC 和62,70 ATCC27294 0143 1129 0118 SYBR Green 1 浓度与 Tm 值的关系 。为荧光法的推 c 堪萨斯分枝杆菌9017 〒6710 〒6613 〒62,70 0125 0193 0118 ATCC12478 广应用积累了资料 。试验结果表明 , SSC 浓度影响 3 均为 3 次试验结果平均值 ; a 、b 、c 分别代表低 、中 、高 GC %菌 双股 DNA 与 SYBR Green 1 的 结 合 , 其 浓 度 与 双 股 株 DNA 结合的 SYBR Green 1 量成反比 ,且高浓度 SSC 不利于 变 性 过 程 中 形 成 的 单 股 DNA 与 已 结 合 的 31DNA 的纯度对两种方法检测结果的影响 : 按 SYBR Green 1 解离 ,干扰 Tm 峰值的形成和增高 Tm常规方法提取与纯化的细菌染色体 DNA ,不宜直接 值 。用 HPLC 检测其 GC % 。标本中残留的 RNA 等明显 9 SYBR Green 1 可特异性地结合双股 DNA,而 影响 GC %测定的准确性 ,必须用大量的核糖核酸酶 相同浓度 ,不同 GC %含量的双股 DNA 结合此染料 A 和核糖核酸酶 T1 进一步处理 。否则 , 较多的杂 的能力各异 。我们的结果表明 ,高 GC %菌株的 DNA 峰将影响碱基峰的形成而使 GC %的计算出现误差 。这种结合力强于低 GC %菌株 。所以在用荧光法检 有无 两 种 酶 处 理 , 荧 光 法 测 得 的 Tm值 和 计 算 出 的测细菌染色体 DNA GC %时 , 要选 用 较 高 浓 度 的 染 料以满足高 GC %菌株的需要 。推测 SYBR Green 1 ( )表 3 细菌 DNA 纯度对 GC %测定的影响 x? 〒s 与双股 DNA 结 合 的 部 位 可 能 是 GC 或 GC 相 关 结 GC % 3 菌株 〗荧光法 HPLC 法 构 。 酶处理前 酶处理后 酶处理前 酶处理后 HPLC 法 检 测 GC %的 最 大 优 点 是 结 果 稳 定 可金黄色葡萄球菌 〒 〒 〒 〒 34 . 0 33 . 4 38. 7 33. 5 靠 ,但必要的前提是 DNA 必须高度纯化 ,否则将明 ATCC12600 1 . 02 0 . 92 0 . 71 0 . 01 显影响试验结果 。此外 , 利用 HPLC 测定每一菌株 绿脓假单胞菌 〒 〒 〒 〒 67 . 1 66 . 8 66. 4 66. 4 ATCC10145 0 . 85 1 . 01 0 . 10 0 . 10 染色体 DNA GC %至少需要 20 min ,而荧光法一次可 伤寒沙门菌 〒 〒 〒 〒 57 . 4 56 . 2 54. 0 51. 6 同时检测 24 株细菌 , 每次检 测 仅 需 5 min , 且 DNA ATCC19430 2 . 60 0 . 66 5 . 01 0 . 06 标本无需特殊处理 ,不受残留 RNA 的影响 。由此可 嗜血流感杆菌 〒 〒 〒 〒 40 . 6 38. 0 41. 1 39. 5 NCTC8143 0 . 40 0 . 40 0 . 63 1 . 34 见 ,HPLC 法因其结果准确可靠 ,在细菌分类研究方 大肠埃希菌53. 9 〒51. 6 〒50. 5 50 . 5 面的应用优于荧光法 ; 但由于荧光法简便 、快速 ,故 ATCC11775 4 . 02 0 . 20 可优先考虑用于临床细菌学鉴定 ,同时可为 PCR 所 注 :表中数值为 3 次试验结果的平均值 ; 处理前后 ,指经核糖核 需引物的设计及时提供受检菌株的 GC %值 ,便于引 酸酶 T1 处理 物设计 。目前 ,连续荧光检测仪已初步应用于临床 5 Kawamura Y , Hou XG , Sultana F , et al . Transfer of Streptococcus 病原的快速 PCR 诊断 。GC %测定方法的建立 ,将进 adjacens and Streptococcus defectivus to Abiotrophia gen. nov. as 一步推进荧光法的临床应用范围 ,为临床检验工作 Abiotrophia adiacens comb. nov. and Abiotrophia defectiva comb. nov. , respectively. Int J syst Bacteriol , 1995 ,45 :7982803 . 者提供更多的方便 。 6 Desilva D , Reiser A , Herrmann M , et al . Rapid genotyping and quantification on the Light Cycler with hybridization probes. Roche Mol 参 考 文 献 Biochem , 1998 , 2 :12216 . 7 Ririe KM , Rasmussen RP , Wittwer CT ,et al . Product differentiation by 1 Adnan S , Li N , Miura H , et al . Covalently immobilized DNA plate for analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. luminometric DNA2DNA hybridization to identify viridans Streptococci in Anal Biochem , 1997 ,245 :1542160 . under 2 hours. FEMS Microbiol Lett , 1993 , 106 :1392142 . Wittwer CT , Herrmann M , Moss A , et al . Continuous fluorescence 8 2 Ezaki T , Saidi SM , Liu SL , et al . 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Microbiol Immunol , 1997 ,41 :4532460 . 〃〃简报 胰岛细胞 64 000 蛋白抗体酶在 ?型糖尿病诊断中的价值 王晓红 张立江 朱洪权 王虹 胰岛细胞 64 000 蛋白胰岛细胞蛋白被认为是 ?型糖尿8117 % ,明显高于其他疾病组 ,经 尿病患者血清中的检出率 2 χ( ) () β检验差异有显著意义 P < 01005,结果见表 1 。 病患者 DM胰岛细胞最初表达的抗原 。64 000 抗体在 DM ( 三 、讨论 者血清中检出率为 70 %,90 % 。DM 高危人群 ?型 DM 的 ) ( ) 一级亲属的检测中发现有 12 % 64 000 抗体阳性 ,明显高于 检测 ?型 DM 的主要免疫学指标有胰岛细胞抗体 ICA ( ) 正常人 。可作为诊断 ?型 DM 的实验诊断指标 。 和胰岛素处自身抗体 IAA。64 000 抗体较 ICA 和 IAA 出现 () () 一 、材料与方法 早 发病前 4,91 个月,持续时间长 发病后 6,7 年,早期 2 ,3 () 阳性检出率高 70 %,90 %。实验中 ?型糖尿病患者血血清标本来自 1998 年 11 月,1999 年 8 月经本院确诊的 清中 64 000 抗体的阳性检出率为 8117 % ,明显高于其他疾病 患者 ,其中 ?型 DM 109 例 , ?型 DM61 例 ,红斑狼疮系统性 ( ) () 组和正常人组的检出率 。所以 ,64 000 抗体不仅可作为 ?型 SL E8 例 ,甲状腺功能亢进 甲亢9 例 ,正常人 24 名 。方法 3 ,4 参照文献 1 。 DM 的诊断指标 ,也可预测 ?型 DM 的发生,为早期治疗 二 、结果及预防 ?型 DM 的发生提供了依据 。 对 211例患者血清检测结果表明 ,64 000抗体在 ?型糖参 考 文 献 抗体在不同组血清中的检出率64 000表 1 1 王鸿 ,杨廷彬 ,陈章权 ,等. 胰岛细胞 64 000 蛋白抗体酶联免疫检 3 测法的建立. 中华医学检验杂志 ,1997 ,20 :28422871 ( )64 000 抗体 % 组别 例数 P 2 Baekkeskov S , Landin M , Kristensen J K , et al . Antibodies to a 64 000 ()109 89 8117 ?型 DM — Mr human islet cell antigen precede the clinical onset of insulin2 ()61 5 812 < 01005 ?型 DM dependent diabetes. J Clin Invset , 1987 ,79 :9262930 . ()8 0 010 < 01005 SL E 3 Kawasaki E , Moriuchi R , Jakino H , et al . Autoantibodies to 64 000 Mr ()0 010 < 01005 9 甲亢 正islet cell protein in lone2term I diabete patients. Diabetologia , 1992 ,35 : (< 01005 )常人 0 010 24 7482751 . 3 4 Atkinson MA , Macilaren NK , Scharp DW , et al . 64 000 Mr 与 ?型 DM 组比较 autoantibodies as predictors of insulin2dependent diabetes. Lancet , 1990 ,335 :135721362 . ( )收稿日期 :1999212215 ( 作者单位 :130021 长春 , 吉林省人民医院检验科 王晓红 、张立 ) ( ) 江 、王虹;白求恩医科大学第二医院 朱洪权() 本文编辑 :张莉