人参总皂甙对CD34造血干祖细胞体外扩增和分化的作用及机制研究

人参总皂甙对CD34造血干祖细胞体外扩增和分化的作用及机制研究 重庆医科大学 博士学位论文人参总皂甙对CD34ltgt造血干/祖细胞体外扩增和分化的作用及 机制研究 姓名:王建伟 申请学位级别:博士 专业:药理学 指导教师:王亚平 20040501 重庆器秘大学鞲噗缩潞谲对羰滚葵交缣霉 蓁变凄爨 漤交答黪,,驻嚣 ,,撇,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,;,,, 缫式红系檠落生成摹位,, ,,,, ,,,, 碱鏊辩,,磊 ,,,,, ,,,,,,,,, ,;,,,,,, 、 爆袁裁激戮予瓣纛 ,,,,,,戳,,热,,,,,,, 警氟渣蠡蛋滋 分化抗原 。,, ;,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ;,,,,, ,,,,,,, ;,,, 集落形成细臌,,聪(嚣 ;,,,,,稻瀚协, ,,,,,,,,,,,,;,,, 籁系嶷落生戏举僚,,群《嚣鑫莲蕊垂 ;,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,;;,,,， 翠絮髓系裰缎融 ,,,,,,,;,,,，,,;,,,,,,,，,,,,,,,,,;,,, 生成蕈往,,冒,, ;,,,,, ,,,,,,, ,,,,—,,,,,, 黔蔟落生成擎缀,,,,《蠢耋 ;,,,,, ,,,,,,, ,,,,(,,,,,,,,,,,， 敬，基噬缓熬袋落 ,,;,,,,,,,( 垒蔽攀整 瘘 ,,, 天 ,,器 ,,,,,,,,,,,,,,,, 二氨基联笨羧 ,, ,,,,,,,,; ;,,, 树突状细胞,嚣,, ,,,,,,, ,，,,,,,,,,,,, 蕊碳酸二己黻静翻霪, ,,,,,,,， ,舔,,,,,,, ,,二攀基耍蕊 嚣, ,,,,,,,, ,,,,,,, 演化乙锭 ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,;,,,; ,;,, 乙二胺四艺黻钠,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,, 酶联免疫吸辩溅您囊套辑 ,,,,,,,,,,,,,, 蔹筑囊叟黢豢,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,;,,,,, 数缀簏雯成豢激体,,,,, ,,,,,,,;,,;, ,;,,,,,,, ;,,, ,,,,封 焚光激活缀臆努漶 ,,, ,,,,, ,,,,,,辩,,,,,, 毅警盎清 琴,拔 ,,,,挖,;,,, ,,,,,,,;,,,,,, 爨蘧鬣酸爨畿索零, 爱辖,,,,,, 颡臻嚣差 ,芝鲻 ,,,,,,,;,,, ;,,,,,;,,,,,,,,,,, ,,;,,, 簸缎鼹集落嗣激因予 ,,《鬈, ,,,,,,,;,,,—,,;,,,,,,, ;,,,,, 糨，臣噬细胞懿藩 ,,,,,,,,,,, ,,;,,, 剿激嚣子 ,,,,, 、 枣麓 ,,,,,,,,,,,,; ,,,,,, ,,;,,, 谶舡生长因子 ,,,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,, ,,,, 造觚祖细胞 ,,,,„,,,,,,,; ,,,, ;,,, 避艇予缨臌 ,,,,, ,;,,,(,,, 避巍渣 ,,,,,,,,,,,,, 逡霸簏奔豢一, ,,,,,,,“,,,,, 爨蹿飚分豢一, ，,;,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,?, ,,,,,, ,醚?疆穗养鏊 ,,,,,,,感,,,,,,, 炱襄嚣淀囊躺肿潞瓣戳错沁州孵漱,潜辖“瞄臻，器 ,,,,,,,,,,建, ,,,,,, 懑藤券螯 重庆器秘大学鞲?学鬣埝竞,, ,—,,,,,,,,, ,一谷氨酰胺,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,激酶醒 ,,,,, 瘴尔,一,, ,,,,,;,,,,,,,,,,, 二巯潦乙醇,, ,,,,,,,,, 毫克,, ,,,,,,,,,, 毫升班鑫, ,,,,,,,,,, 亳摩尔,,, ,,,,,, 分镑,,, ,,,,;,,,, ;,,, 单个核细胞,,, ,一,,(,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,, 四甲旗偶氮唑蓝,, ,,,,,,, ,,,,,, 自然杀伤细胞,,珏藩,,羚 ,,,,,,,,, ,,,,,,,;,,,,,,, ;,,,,,,, ,?糖藤癀厘症联合 ,,,,,,,,,,;,,,;, 免疫缺陷,, ,,,,;,, ,,,,,,, 光密度值,,,, ,,,,,;,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,, 聚丙烯酰胺凝胶魄泳,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,, 磷羧缓游整溶滚,,, ,,,,,,,,,, ;,,,, ,,,;,,,, 多聚酶链反应,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, 苯甲撼磺酰氟,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, 聚偏二氟乙烯印记,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,, 每分键转速,,(,,, ,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,,,,,, 逆转录,,,,,, ,,,, ;,,, ,,;,,, 干细胞因子,,, ,,;,,, 秒,,, ,,,,,,, ,,,,;,, ,,,,,,, 十二烧蒸蘸酸镶,,,, ,,,,,, ,,,,,,,;,, ,,, ,;,,,,,,, ,, 信号传导帮转录激活 ,,,,,;,,,,,,, 因予,,, ,,,,(,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,一缓冲盐溶液,,,,, ,, ,，,、，,?,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, 四甲蕊乙二胺,,, ,,,,,,,,,,,,,, 盘小叛生残素,,,, ,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,, 人参总皂甙,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, (三羟甲基氨基甲烷 , 重庆器秘大学鞲?学鬣埝竞 人参总皂甙对,,,,，造血千,祖细胞体外扩增 和分化的作用及橇制研究? 博士生 王建伟 导鼯 王弧平教授 摘要 遗血干细胞(,,,,,,,,,,,,, ,,,, ;,,,，,,,)怒利用造血干,祖细胞 (辩,,穰,;)豹露痰瑷蓬爱力嚣多羹努纯潜缝豹生兹学黪缝，逶过缓稳工程豹技术，在体外模拟和部分模拟体内的造血过程(包括基质细胞的支持和造血生长因子的调控等)，对分离纯化的,,,,,,,进行体外扩增、定向诱导分化、功能激潺与谖控、鑫豹蘩滚转染等，放露在短霹闻内大量扩璜草麓造盘褪缓戆及吾酴段的前体细胞，以及定向诱导扩，增大量的红细胞、粒,巨噬细胞、巨核细胞,血小板、树突状细胞(,,,,,,,,; ,,,,,，,,)、,,细胞、,,,淋暇细胞等功能细胞和受疫溪羧绥藏，并哥对颦分缨戆夔凌麓逡孑激溪帮溪羟，鼹袋鹅毪基因,,,行鞋淘性转染，最终将造血细胞治疗更广“泛和有效地应用于干细胞移植、生物免疫治疗、造血支持治疗和基因治疗等领域。 途魅于维蠡餐工程楚蠢嘉蓼强两岁,垒余辩学磁究静热点秘裁沿谖题，英磷究现获展示了它对临床医学研究领域具有重要的理论价值和应用潜力，同时也为中医药现代化研究带来了新的切入点。中药有效成分对造血干细胞生物学影响的研究结栗谖实:许多中孳驽霹浚嚣惩予不鞫蠲蘩麴造艇子绥蕤，并麸蛋叁凌帮分予承平影响造戚干细胞的增贿与分化，从而达到重建恢复骨髓造皿机能的目的，摄示开展中药及有效成分对于细胞影响及桃制的研究，毒助于提赫中药研究的科技含羹，有效发挥中药豹挽势，建立疑难疾病渗疗酌耨技术。 人参是祖国传统医学的“补气”要药，人参皂甙是人参中主要的有效药物成„摹金壤疆;奉深嚣鸯嚣客囊然辩学纂囊瓷秘疆拜(,,，,,,,,,,,);重痰蠢秘萋霰点攻关瀑嚣(瀹辩委 计〔,,,,,,,) 重庆器秘大学鞲?学鬣埝竞分。我室着力于人参总皂甙(,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,，,,,,)对血发生的影响及机制磷究已有二十余年，研究滚暖:,,,,怒人参促进啦缨飚生成的鸯效成分。,,,,在体内外均能桶激造盘干细胞(,,,—,)和遥盘租缁胞(,,,,,,,,、,,,—,、,,,—,、,,,—,,和,,,—,,)的增殖分化。为了进一步研究,,,,在分离纯纯蛉造盘予,祖细胞体外攥俸过程中豹,乍翅，挖掘,,,,应用于逸斑干缨胞工程中的潜在价慎，我嚣】进行了以下研究:,、建立了人释髓、脐血,,,,，,,,,,,,体外分离纯化技术;,、以,,,,，,,,,,,,为模型，研究,,,,协间遗血生长因子诱导造盘干,搬鳃胞体岁,扩遭移定向分他数终罔;,、采用低温生物学技术，探讨,,,,降低冷冻损伤、提商羚冻复苏詹滤血细胞的增精能力;,、应用研究造斑生疑因子信号转导途径的方法，选择,,,,介导的,,,,,,,,,,信号传导途径，分褥,,,,定趣诱导红系敷缀照发生鲍分子规利;,、黻转染,,,,,,基因的久耧粪皮成纤维细胞为滋养屡，支持脐血,,,,，,,,,,,,增殖帮分化，以期在造瓶于细胞移植的撼因治疗方蠲作出一些有菔探索。现将备部分简介如下: ,、入露髓、翳盘,,,,”造盘于,嘏缨赡的分离、建纯及鉴定;采曩阴毪分逡策略，敬,,,,,,,踟系统建立,,,,，,,,,,,,的免疫磁珠无菌分选术，对入骨髓、脐血单个核细胞中的,,,,，,,,,,,,进行分选、纯化及免疫细胞化学与流式鳃魅术撩定。结果显示:嚣髓、膀纛孳个棱缨臆(,,,)懿,,,,，,,,,,,,为,(,,,,(,,，经分选后纯度高达,,(,,,,,，分选的细胞台盼蓝拒染率为,,,,,,,,，分选细胞的造血细胞集潞产率为,,,的,,倍。表明免疫磁珠阴性分迷法霹鸯效建分选,,,,，,,,,,,,，著保持缍黢活性良好，为涤入磷究,,,,,,,的生物学特，镬唏功能奠定了基础。 ,、人参总皂甙对,,,,，造血干,祖细胞扩增与分化的作用:通过甲基纤维素半圆钵培养法检测,,,,耱霹造盘生长因予诱导,,,,，,,,,,,,澎成,,,—,,,,、,,,—,、,,,—,、,,,一侧豹能力;经不同剂量,,,,加入造血细胞阑子不同组合培养体系通过液体培养，检测细胞总数，,,,,，细胞、,,,,，细胞和,,,,，细胞比例及集落形残缨戆总数(,,,,)、短系褪继熬秘瞧系罄缎藏数量变能。绥鬃显示:一定剂量的,,,,能够协嗣造血细胞因予提高,,,,，细胞形成各种谶血祖细胞棠落产率;能够提高细胞总数，,,,,，细胞、,,,,，细胞和,,,,，细胞比例以及各种遣疵褪绥麓的数聚。提示合逡裁量戆,,,,耱够诞送,,,,谴盎于,毂缓臆俸乡,扩壤与 , 重庆器秘大学鞲?学鬣埝竞定愈诱蹲分纯。 ,、太雾慧囊凌黪譬簇逡囊镄怒泠豫攥爨蕊,匿蔟羹囊蘩懿;骧蒜:攀攀蕊辘 (,?,,,)秀冷藤黎势蘩，蘩掰邋掺海溢臻终蛰熬逡鑫缎骢愁滚氮孛爨襻,—,个周，鬟落后痤璃台鼢藏挺染率、溅落影威试验、,,,,,)及纲勰总数强牧攀游。测羹:嚣髓融餐魏玺鐾攀添穗静畿锪,婚零嚣裁爨瓣,,,(;与簸嚣翁黉懿港飙燧飘共踣莽，鹿霜集落搿蛾试验、洲芎比魏浚投流式细臆沭蹲方法检测车,,,对骨髓遗搬细胞冷冻损伤可恢复性弁勺嬲响。结聚撼示:细胞复,;,:后，加入合溅荆撼麓,,黠《龉蛰,氖,)，(,,臻羹爨潞襟程髂髓渣疯壤灌斡集纂产攀;,,,,礴,勰辫瘦蠹(,,,,,, ,翩,》能艇遴猿露羚髓遗斑缀麟觞增醢;,,,,(, ,弘,内,)熊键遴漆襻繁鼹遮蠹缀爨遴入缎您瓣然髑勰。磷衮漤蕊，天参慧娶贰熊键遂泠漆臀髓爨鬻蕊焚落、溪臻，篷囊嚣蘸蹬藏羚漆攘蕊黎髯囊菱莲，瑟建爨臻夺,餐髓惑麓露逡盘骖蕊骞一定意曼。 ,、入参总毫甙游静鳆蒸缎绷黼增獯的信姆传递研究;黎嘏半圆体然辫蛾棼煞方弦梭漆譬,慈黎貉蛊,,,,,、,,,,,媾薅熬澎戆，逶邃缀爨壤蹙察骧《鞲嚣拣》舱测,,,莉激造血鲻腕增疆律粥,黼谯,本窝骢条件下，,,,,、,,,键溅溉觎纲胞增勰的煅佳浓度一一川,,, ,, , ,,,,和,,, ,,,,,:并以此浓度将,,,,脚鼢。襻丽予大骚矗遥受镶麓，建簧渤嚣奔潜豹,矗鹣,辩蠢霪号蕊静逡经，罴搿鞋,,,,,,,,茈、熊痰流淀警穷法研究覃,蕊凝逶娃系藏辫趣增殖鳇,警嬲概铡。缕黎瓣秘在不霹粼整憋,,,,枣,激下，逡,蠡缨瓣,,,,魏裘逶襄魏不爨攘;,,,,终鬻逡毂缎爨黧靛囊，燕天警。爨婆鸯?澈?、瓢,、豁势懿;器廷襄,,,,,戆蘩甄酸辚蘸攮鳓燎强。瓷暴在瑟黟释遂逡囊爨瓣瑷蘸静建鼗中，对逢巍黎熬,,,,裘遮魏影璃不显著，识可能在,,,,介导韵僚弩传导过程中增强,,,:和,,,,。熬酪缀獭磷酸德爱撵鬟襄露凄; ,、懈时转染四,,,,基因的,麟勰皮成纤雅绷胞对入脐瓶,,,,，缃臌怵外埔皴作用的研究:将,,,,,,鍪因片段插入,,,,,,。,(，)冀校表达载，攀掬鼹旗,鞠瀚,，,《手珑》蕊筘攒藏，霉，丸髓蕊淀蕊野懋撼灌，交爱,,,,,,谨癸,,,,,,(, ,?),,，渺,,,转染黪,耀真皮成糖绦缎艟睁喹螽有烬澡基馥,阶,,,，波趟,,，,,梭溅,;,,,,。,(?)您》,,,转絷熬,疑粪疫壤终黎蘩爨上溥滚，蕊，,,,,鹣套:爨蘸显寒予窆鼗萋器搴羲豢囊，菸显懿台了努深戆,，:,”,,,,;,,,藤天蘸襄爨躐黪豢 重痰蓬秘大拳鞲?学鬣埝竞细胞上清液能促进小鼠?撬瑁茫疲铡牵偷男纬桑砻髌浔泶锏模牵汀茫樱凭咦岩欢ǖ纳锘钚浴,荆牵汀茫樱苹虻娜伺哒嫫こ上宋赴魑萄胖С制暄茫模常矗龋樱茫龋校蒙ぃ岜?な荆恨芬蜃俜彀靖俨刈苁?ㄔ呈飨怨杵渌缸椋崾舅彩弊荆牵停茫樱苹虻娜伺哒嫫こ上宋赴纱俳暄茫模常矗龋樱茫龋校迷鲋场,馕颐且院笊秆?榷ㄗ荆牵汀茫樱苹虻娜穗艺嫫こ上巳雷茁酥С峙栈螅茫模常矗昱逃瑁仕珥鲦敕痔嘿缂板唷巾败残馐笛榕鲁冒敬 ?综上所述，采用现代生命科学技术来研究祖国传统聪药的精髓和本质，为其提供瑗俄稀学静灌论依蕹，建立宠遘熬磷究方法，开发裁熬药建债氆秘产磊是中国医药面向,,嫩纪的发展方向。本研究采用造血干细胞工程的理论与实验技术，较为深入、系统地探讨了人参总皂甙调控,,,,，造血干,裰细胞增殖与分化的机瑾。,、我餐营兔戏功建立了入夤髓、获蠢,,,,?逵:囊予,獾绥魏薅静分寓笺诧鼓术,,、研究证实了,,,,能够协同造血生长因子诱导,,,,，细胞体外扩增和定向分化;,、探讨了,,,,降低冷冻损伤、提离冷冻复苏后遗皿细胞的增精能力;,、觚分子求平分狐了,,,,在弦滋逵盘绥蔻攒蒺豹过程中，鼹造盘缨藏,,,,表达豹影响不显著，暇,能在,,,,介导的信号传导过程中增强,,,。和,,,,。的酪氨酸磷酸化发挥重娶作用;,、初步证实以瞬时转染,,—,,,熬因的人胚真皮成纤维细稳俸秀滋蓁屡，蕤够蓰送耪敷,,,,，造蠹于踺叠爨魏熬懋藏。我秘懿疆究结栗提示:,、,,,,鼠翁类?圃煅ひ蜃拥墓苤苯踊蚣浣佑跋旌偷骺卦煅桑嫦赴脑鲋秤敕只俳剩保欤滔赴纳桑佣?尤瞬巍安蛊贰敝,病?阱嘭藻音钣诠蓿觳徒 袄?捎胗疹环执浚?a name=baidusnap0>凄楚激添，基困转絷等造盘干缨胞工程研究中可利用人参皂甙的药理作用来调控细胞的增殖分化，发挥其在造血于细胞工程领域的潜在应用份值。关键词:造血干,祖细胞，人参总皂甙，扩增，分化，,,。,,,，基因转染 , 重庆器秘大学鞲?学黎埝竞 ,,,,, ,, ,,, ,,,,,,, ,, ,,,, ,, ,,,,,,，,, ,,, ,，,,,,,,,，,,，,, ,, ,,,,，,,,,,,,,，,,，, ,,,,,,,,,,,，,,, ,,,,, ,, ,,,, ,,, ,,, ,,,,,,，,,, ,,,,,,,,,,,,:,,,,, ,,,,,,, ,,,,,:,,,, ,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,; ,,,, ;,,,(,,,),,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,, ;,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,, ,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ;,,,,,,,,,,,(,,,,,;,,,？,,, ,,,, ,,;,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,;,,,,,, ,;,,,,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ;,,,, ,, ,, ,,,, ;,,,,,, ,,,,,,,(,,,,, ,,;,,,？,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,, ,, ,,,;, ;,,,,;,, ,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,, ,, , ,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,;,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,; ,,,, ;,,, ,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,;,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,, ;,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,, ,,;,,;,,,，,,, ,,,, ,,,,,,,( ,,,,,,,,,,,,; ,,,, ;,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,, ,,, ,,,, ;,,,,,,,,,, ,,,,,, ,, ,,,, ,;,,,;,般,,,,,,,。，,, ,,,,,,, ,,,,, ,, ,,,,, ,,, ,,,,, ,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,, ,, ,,, ,,,,,, ,, ;,,,,;,, ,,,,;,,,，,,, ,,,,,, ,,、，, ;,,,;, ,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,;,,,。啊瓣,,,,,,, ,, ,,,,, ,, ,,,,;, ,, ,,, ,,,,;,,,, ,,,;,,,,, ,,,,,;,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,;,,, ,, ,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,, ,,,,;,,, ,,,, ,;, ,, ,,, ,, ,,,,,,,,, ;,;,,,，,,, ,,,,;, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,曩, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,;,,,，,,,, ,;,,,,, ,,, ,,,,;,,,, ,, ,,;,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,; ,,,;,,,, ,, ,,,, ,,,,,,(,,(,,, ,,,,, ,, ,,;,,,,,, ,,, ,臁;,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,;,,, ,,, ,,, ,,,,;,,,, ,,,;,,,,, ,, ,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,, ,,;,,,,,,,;,, ;,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,;,,, ,,,,,，,,,,, ,,,,;,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,;,,,， , 重庆器秘大学鞲?学鬣埝文 ,,,,,,,,, ,,, ,,;,,,？,,, ,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,( ,,,,, ,,,,,,, ,, , ,,,,—,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,;,,, ,,“,,,,,,,,,,,, ？,„:,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,(,,,),, ,,, ,,,,, ,,,, ,,,,;,,,, ,,,;,,,,, ,,,,,;,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,(,,, ,,,,,,,, ,,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,(,,,,);,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,，,,,—,,。,,,—,，,,,,, ,,, ,,,删,(,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,;, ,, ,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,，,,,,,,, ,, ,,,,, ,,, ,,,;,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,; ,,,, ;,,, ,,,,,,,,,,,，,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,:,(,, ,,,,,,,,, ,,, ,,;,,,？,, ,, ,,,,,,,,,,，,,,,,,;,,,,, ,,,,,,,,,,,;,,,,, ,, ,,,,，,,,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,,,,,,, ;,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,, ;,,,, ,,, ,,,,,,;,, ;,,, ,,,,,。,。,, ,,,,, ,,, ,,,,;,, ,, ,,,, ,,;,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,, ,,;,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,，,,,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,, ;,,,,(,(,,,,,,, ;,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,;, ,, ,,,, ,, ,,, ,,;,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,, ;,,,,(,(,, ,,,,;, ,,,,,,,,,,,—,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,,;,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,, ;,,,鸯,,, ,,,,;,,,, ,,;,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,(,。,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,;,, ,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,;,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,, ,, ,,, ,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,，;,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,,;,, ;,,, ,,,,,。,,;, ;,,,,,, ,, ,,,,,,,;,, ,, ,,,,,,,,,,,,,:,(,,,,,,,如,，,,,,,,;,,,,, ,,, ,,,,,,,,;,,,,, ,, ,,,,，,,,,,,,,,,,,, ,,,,幽,,,,,,,,,, ;,,,,,,,, ,,,,, ,,,, ,,,,,, ;,,,, ,,, ,,,,,,;,, ;,,, ,,,,,: , ,,, ,,,(,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,,;,,,,, ,, ,,,,，,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,;;,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,;,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,,(,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,, ,, ,,,,;, ,,,,， ,,,，,,, ,,,, ,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,,;,, ;,,, ,,,,,(,,, ,,,,,,, ,,,,: ,,, ,,,;,,,,,, ,, ,,,,，,,,,,,, ,,, ,,;,,,,,, ,,,, ,(,,,(,,,, ,,, ,, ,,，,,,,,,,,,—,,,,,,,,,,。,,, ,,,,,,,,, ,, ;,,, ,, ,,,,,, ,,,, ,,;,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,(,,, ;,,,,, ,,,,, ,, ,,,,十;,,,, ,,, ,,,,;,,, ,, ,, ,,,,(,,, ,,,,,,, , 蚕交氍辩夫学薄士学德论文 ,,,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,;,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,;,,,, ,, ,,,,,,,,,, ,,,,„,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,，,,,,,,, ,,,, ,,;,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,;,, ;,,,,;,,,,,,,;, ,,, ,,,;,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,(,。,,,,;, ,, ,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,; ,,,,,,,(,,,落),, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,，;,,,, ,, ,,,，,:,,, ,,,,,,,,,,; ,,,,;,, ,, ,,,,,,, ;,,;,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,, ;,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,, ,,;,,,, ,, ,,,,，;,,,, ,,,,;,, ,, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,—,,,,、,,,—,、,,,,,、,,,,,, ;,,,, ,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,;,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,;,,,,?;,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,, ;,,;,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,, ,,,,,,, ;,,,,,,,,,, ,, ;,,,,,,,, ,, ,,？,,, ;,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,, ;,,, ,,,,,,，,,,,，,,,,,,,,, ,,,,，,,,,，,,, ,,,,，;,,, ,,,,,，,,, ,,,,,,, ,, ,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,, ;,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,;,,,(,,,,,,,:,,,,,,,,,,,, ,, ,,,, ;,,,,, ;,,;,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,;,,,,,, ,,, ;,,,,, ,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ;,,,(,,,,(,,,,,,，,,,,);,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,, ;,,, ,,,,,,， ,,,,。?,,,,,,,,, ,,,,，,,,,，,,, ,,,,，,,,, ,,,,,，,,, ,,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,, ;,,, ,,,,,,(,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,?, ,,,,,,, ,,,,，;,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,, ;,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,; ,,,,,, ,,;,,,,(,, ,,,,;, ,, ,,,, ,, ,,, ,,;,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,璀,,,,,《拜镞韬拜,,,,,, ,, ,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,, ;,,,,:,,,,,,, ;,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,, ,, ,,,;, ,,,,,,;,,,, ;,,,,(,,,,),, ,,？,,, ,,,,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,),,, ,—, ,,,,,,;,,,,, ,,,,,,，,,, ,,,,,,,;,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,,,(,,,;, ,,;,,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,, ,,;,,,,,, ,,,, ,,, ,,, ,,,, ,,;,,,,, ,,,, ,, ,,,,，,,,,，;,,,, ,,, ,,,,; ,,,,,, ,,,,辨,培;,,,,,,,谳,, ,,,,,,, ;,,;,,,,,,,,,, ,, ,,,,„,,, ,,,,;, ,, ,,,, ,, ,,, ,,;,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ;,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,;,,, .