实验诊断学考试重点

实验诊断学考试重点 血液检查Examination of Blood 红细胞容积分布宽度 (RDW): 血液:不断地流动于人体的循环系统中，直接或间接参与RDW=S.D./ 平均红细胞体积 全身各个组织器官的新陈代谢、功能调节及维持人体count (RBC) 红细胞计数 Hemoglobin determination (Hb) 血红蛋白测定 Leukocyte count (WBC) 白细胞计数 Differential leukocyte count白细胞分类 Platelet count ( PLT) 血小板计数 特点:红、白细胞都比成人高，红细胞呈“生理性巨幼红 情绪激动时，红细胞可一过性增多 病理性:严重慢性心、肺疾患，如阻塞性肺气肿、肺源性心脏病、紫绀型先天性心脏病，真性红细胞增多症 临床意义:( 减少 ) 生理性:妊娠中、后期，血容量增加约 25 %，引起血液稀释;6个月,2岁的儿童由于生长发育迅速,血容量急剧增加而致造血原料相对不足;老年人造血功能明显减低致红细胞减少;月经期暂时引起下降。 病理性:各种类型贫血:如缺铁性贫血、巨幼红细胞性贫 细胞贫血”的表现，白细胞呈感染的表现(粒细胞增高并血、溶血性贫血、再生障碍性贫血、继发性贫血等。 左移) 红细胞计数 Erythrocyte Count 方法:显微镜计数法;全自动血细胞分析仪计数法 网织红细胞计数及正常参考值: 网织红细胞是晚幼红细胞脱核后，在完全成熟之前的过渡型红细胞。由于胞浆中尚存核糖体、核糖核酸等嗜碱物质， 操作:用等渗稀释液将血液作 200 倍稀释，滴入血细胞计用煌焦油兰等染料进行活体染色后，胞浆中可见蓝绿或蓝数板中静止 1-2 min，于高倍镜下计数 5 个中方格红细胞总数，经换算即得每升血液中血红细胞数。 色的网状结构，故名网织红细胞。 成人:0.5%-1.5%新生儿(<3月):2%-6% 公式:RBC/L= 5个中方格总数×5×10?200×106报告格式网织红细胞计数的意义 Δ.ΔΔ×1012/L 3.81×1012 /L 参 考 值 (男)4.0,5.5×1012/L (女)3.5,5.0×1012/L (新生儿)6.0,7.0×1012/L 各种红细胞的形态 平均红细胞容积(MCV): MCV=红细胞比容/红细胞数 红细胞数参考值:80-100 FL 增多:骨髓增生旺盛。常见于溶血性贫血，尤其是急性溶血性贫血(可达20%以上)、急性大失血贫血治疗有效。如缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血，经相应治疗后1-2日即开始，1周左右达最高峰 减少:骨髓增生低下，如再生障碍性贫血、溶血性贫血有再生障碍危象时 血红蛋白测定 方法:氰化高铁血红蛋白法全自动血细胞分析仪 北京大学医学部 - 1 - 原理:除Hbs外，多种血红蛋白(Hb)均可被高铁氢化钾红细胞膜缺陷致溶 贫 氧化成高铁血红蛋白(Hi)，再与CN- 结合生成稳定的棕自身免疫性溶贫 红色氧化高铁血红蛋白(HiCN)，在540nm处有一吸收峰 阵发性睡眠性血红蛋白病 贫血Anemia 红细胞形态分类 型 MCV(f 是一种症状，是指人体单位体积循环血中，红细胞计数、类 l) MCH (pg) 血红蛋白含量和红细胞比积低于正常参考值——即称为贫血 RBC:主要功能:携带O2、运输CO2 膜组成:膜糖、膜脂、膜蛋白 膜结构:不对称性、流动性、骨架 膜功能:物质运输、抗原性、变形性、免疫功能 大细胞型 ,100 ,32 正 常 80 ~ 94 26 ~ 32 单纯小细胞 ,80 ,26 小细胞低色素 ,80 ,26 红细胞骨髓增生特点分类 骨髓增生活跃性贫血:缺铁性、溶血性、失血后贫血 Hb:是红细胞中的运输蛋白，主要功能是吸收肺部大量CO2骨髓增生不良性贫血:原发性及继发性再生障碍性贫血 并输送到身体各组织 巨幼红细胞性贫血: Hct:是指抗凝全血经离心沉淀后，测得下沉的红细胞在全营养性巨幼红细胞性、恶性贫血 血中所占容积的百分比值 各系统的表现: 贫血的诊断 了解贫血程度、类型、病因 全身软弱无力、疲乏困倦、 询问病史、体格检查、实验室诊断 心悸、气短、心率加快、呼吸加重等，严重者发生心力衰贫血的检验诊断 竭 血红蛋白含量Hb轻度:成年男性<120g/L;成年女性 消化系统:食欲不振、腹胀、恶心、呕吐、消 化不良、<110g/L 腹泻或便秘等 中度:<90g/L重度:<60g/L 泌尿生殖系统: 尿可出现少量蛋白，肾功能轻度减低，红细胞计数RBC(男)4.0,5.5×1012/L;(女)3.5,5.0甚至发生尿少、尿闭和急性肾功能衰竭 ×1012/L;(新生儿)6.0,7.0×1012/L 神经系统: 头痛、头晕、畏寒、反应迟钝、耳鸣、眼花 红细胞比积HCT成年男性:41~ 53%;成年女性: 36 ~ 46% 贫血的病因与发病机制分类 周围血涂片检查 红细胞生成减少:骨髓造血功能障碍、红细胞生成素产生有助于贫血的形态学检查;可观察红细胞的大小、呈多染缺陷、造血物质缺乏或失利用 色性、红细胞发育成熟、中央淡染区、异型红细胞。 红细胞破坏增多:红细胞内在异常:膜缺陷、酶缺陷、珠骨 髓 检 查 蛋白链生成异常、阵发性睡眠性血红蛋白尿 反映骨髓造血细胞增生的状态，是了解贫血性质、原因的 红细胞外在异常:免疫性、机械性、化学与物理、感染、重要依据。在检查骨髓涂片时，观察骨髓细胞的增生情况，单核吞噬细胞系统功能亢进红细胞丢失过多:急性、慢性各系细胞比例、形态有无异常、可染色铁的含量，以及细失血 贫 血 分 类 贫血发病病因分类 缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血 溶血性贫血、血红蛋白病 胞中铁粒的多少、大小和分布。 贫 血 各 论 缺 铁 性 贫 血Iron deficiency Anemia 是由于体内用来制造 Hb 的贮存铁已被用尽，红细胞生成受到障碍而引起的典型的小细胞低色素性贫血。此为贫血 北京大学医学部 - 2 - 中最常见的类型，可发生于各年龄组，但以育龄期妇女和引起细胞核分裂障碍，致骨髓红细胞系发生巨型改变。我婴幼儿尤为多见 血象:实验室检查 典型的小细胞低色素性贫血 Hb含量、红细胞计数均低于正常 红细胞中心淡染区扩大、或呈环状 血涂片中多见椭圆形、靶形红细胞 MCV、MCH均降低 网织红细胞未治疗前: 1-2%; 铁剂治疗后 7-10 天可达“高峰” 骨髓象: 骨髓增生活跃或明显活跃 红系增生明显，粒:红降低或倒置 各阶段的红细胞都较正常为小 中幼与晚幼红细胞显得特别小 铁染色细胞外铁消失 白细胞和血小板系统无改变 血液化学检查 血清铁的含量明显减少 血清铁蛋白的含量明显减少 运铁蛋白饱和度(%)明显减少 骨髓细胞外铁检查 国以叶酸缺乏为多见。 病因和发病机理:叶酸、维生素B12在细胞核DNA合成过程中都是重要的辅酶，如缺乏则导致细胞核DNA合成受抑，细胞向G2期转变障碍，而阻滞在S期，而RNA合成量正常，主要分布于细胞浆内。因此出现细胞体积增大，胞浆成熟，胞核幼稚的“老浆幼核”现象 血象:实验室检查 大红细胞正色素性贫血 MCV、MCH通常增高 红细胞呈大卵圆形、形状不规则 可见有核红细胞、巨幼红细胞红细胞内出现Howell-Jolly小体白细胞、血小板计数都减低 中性粒细胞分叶过多，达6- 8叶 骨髓象: 有核细胞增生明显活跃 红系增生明显，粒:红比例 1:1 巨幼红细胞的出现为特点 染色质排列疏松细致呈“幼核老浆”象 粒系巨型变以晚幼粒、杆状核明显 再生障碍性贫血Aplastic anemia 再障是由多种病因引起的骨髓造血干细胞明显减少。其特 在酸性环境中，加入20%亚铁氢化钾，而产生的普鲁士蓝点是外周血液中红细胞、粒细胞和血小板都明显减少。临反应。此为敏感的可靠的诊断方法,凡是缺铁性贫血，细床上常出现较重的贫血、感染和出血。 胞外铁均减少贫血病历:患者王婷艳，女性，8岁，因面血象:实验室检查 色苍白、疲乏无力、头晕、心悸和心率加快，于1998年 正常细胞正常色素性贫血 8月收住我院。患者在外院经铁剂治疗近半年，症状无改三系细胞数量减少，程度不一 变。 网织红细胞计数降低 血常规检查结果:Hb:56 g/L;RBC:1.64×1012/L;MCV:白细胞数量减少，淋巴细胞相对增多 63 FL;RDW:18.4 % 血液涂片:RBC为典型小细胞低色素型，RBC中心淡染区域扩大，可见5%靶形细胞和形状不规则的RBC 巨幼细胞性贫血megaloblastic anemia 是指叶酸、维生素B12 缺乏或其他原因引起脱氧核糖核酸(DNA)合成障碍所致的一类贫血。DNA生物合成受累 溶血性贫血Hemolytic anemia 是指红细胞破坏加速而骨髓造血功能代偿不足时发生的一类贫血 表现为三大特征:贫血、黄疸、脾肿大 血象:实验室检查 正常细胞正常色素性贫血 网织红细胞显著增加 北京大学医学部 - 3 - 溶血原因分析的检验 血清间接胆红素增加出现黄疸 尿 膜缺陷:RBC渗透脆性 T、自身溶血 T、酸溶血 T 、蔗糖水溶血 T 病理性增高:急性感染如肺炎、扁桃体炎、急性阑尾炎。严重组织损伤、大量细胞破坏。如术后12,76h，WBC常 >10.0×109/L;急性心肌梗死后1,2d，常见WBC明显增高;急性溶血亦见WBC增多，增多成分以中性分叶核粒细胞为主。急性大出血:如脾脏破裂或宫外孕输卵管破裂后，WBC迅速增多常达20.0×109/L。这可能是应激状 酶缺陷:自身溶血 T及纠正 T、变性珠蛋白小体生成 T 态、或50 , 70% 嗜酸性粒细胞(eosinophil):致敏反应0.5 , 5% :释放组织胺、肝素0 , 1%原理(显微镜计数原理):用 2 % 嗜碱性粒细胞 ):吞噬、清除死亡细胞及异物3, 8% 同时破坏红细胞。(basophil)(monocyte 混匀并滴入计数室中，低倍显微镜下计单核细胞数 4 大方格中性粒细胞Neutrophil 公式:WBC/L = 4 格白细胞总数 ? 4×10×20×106 报告生理特性:渗出性、变形性、趋化性、吞噬性 格式:Δ.ΔΔ×109/L 参考值:成人4.0,10.0 × 109/L;新生儿15.0,20.0 × 109/L 临床意义 骨髓 血液 分裂池 成熟池 储备池 边缘池循环池 4-5d 1-3d 2-3d 原粒早幼粒中幼粒/晚幼粒杆状核/杆状核分叶核/分叶核 生理性增高:见于妊娠期、分娩时、新生儿;剧烈运动、淋细胞核左移:周围血中杆状核粒细胞增多甚至出现晚幼浴;严寒、高温;午后高于清晨;饮食后高于饮食前等; 粒、中幼粒、早幼粒等细胞时均称为核左移 北京大学医学部 - 4 - 杆状核粒细胞增多:6%:轻度左移;10%:中度左移;25%淋巴细胞减少见于:接触放射线;应用肾上腺皮质激素及重度左移或称为类白血病反应 类白血病反应 :患儿男， 2.5岁，日本籍，于10天前 肾移植术后、AIDS 单核细胞Monocyte 因受冷而发热，自测体温38?(腋下)，无畏寒、头痛、单核细胞病理性增多见于:心3/日治疗，无明显好转，4细胞白血病 背及双上肢皮肤反复出现散在红色丘疹，停药否无区别。嗜酸性粒细胞Eosinophil 1999年7月5日急诊住我院。实验室检查，血象:Hb110g/L, 增高见于:过敏性疾病;寄生虫病;皮肤病;慢性嗜酸性白WBC 23×109/L,血小板 121×109/L，幼稚型异常淋巴 血病及淋巴瘤 56%，成熟淋巴 21%，嗜酸性粒细胞2%，中性粒细胞 21%血小板计数platelet 骨髓穿刺二次，骨髓细胞分类象同血涂片象。 是由骨髓中成熟巨核细胞生成;在止血过程中起着重要的 细胞核右移:正常人周围血中性粒细胞以三叶核者为主，作用 若五叶者超过5% 时为核右移，此时常伴有白细胞总数减计数方法:显微镜计数法;全自动血细胞分析仪法 少。一过性地出现核右移是正常现象。如在疾病进 300×109/L 然出现核右移的变化，则表示预后不良 临床意行期突参考值100, 义 临床意义 血小板增多 > 400×109/L;见于血小板增多症、慢性粒 生理性增高:见于妊娠期、分娩时、新生儿期;剧烈运动、细胞增多症、真性红细胞增多症、骨髓纤维化、脾切除等。 热水浴;严寒、高温;午后高于清晨;饮食后高于饮食前等病理性增高:急性感染;严重组织损伤;急性大出血;急性中毒;白血病及恶性肿瘤 病例:患者朱全妹，女性，47岁，因砖墙砸伤腰骶臀部致左下肢活动受限伴腰骶臀部皮肤发紫5天于2001—12—04由急诊收治入院。 < 100×109/L;见于血小板减少紫癜(ITP)、再生障碍性贫血、急 血小板减少 性白血病、X射线照射。 病例 患者:女32岁 已婚 ，有一8岁女儿，无业 主述:经常头痛、疲乏、失眠。右肋骨下疼痛,胸骨疼痛。患者长期服用减肥药，无间断血液检验结果: :15.4×109/L RBC:5.53×1012/L 1(创伤性失血性休克 2(腰骶部、髂后部、右臀后部皮 肤严重挫擦伤伴皮下积血 3(骨盆严重骨折 4(会阴部、: 1321 ×109/L 肛门严重挫裂伤血常规检查结果:Hb:92g/L RBC:RDW: 17.8 % ×1012/L PLT:271×109/L WBC:32.7×109/L:中幼粒细胞: 2% ;晚幼粒细胞:全自动血细胞分析仪 杆状核粒细胞:35% ;多核粒细胞:45% ;淋巴细胞:多项参数测定 单核细胞: 4% 中性粒细胞减少:某些革兰氏阴性杆菌感染;某些血液病;脾功能亢进;慢性理化损伤;自身免疫性疾病 淋巴细胞Lymphocyte 仪器组成:1.主机 2 终端机 3 打印机 工作原理 阅读报告:1.18、23 项参数中英文报告2.图解3. 警告标志4. 含义报告 病理性增多见于:病毒性感染;某些慢性感染;各类淋巴细库尔特原理:孔径阻抗细胞计数原理 胞性白血病 白细胞自动化分类 二项式分类 粒细胞和非粒细胞 北京大学医学部 - 5 - 三项式分类 淋巴中性粒细胞和中间细胞 五项式分类 嗜中嗜碱嗜酸淋巴单核细胞 红 细 胞 直 方 图 缺铁性贫血 铁粒幼细胞性贫血 轻型 β- 血红蛋白生成障碍性贫血 巨幼细胞性贫血 叶酸治疗后 Mechanisms of abnormality in hemostasis and coagulation 一、出血与止血Haemorrhage and Hemostasis 二、凝血与抗凝Coagulation and Anticoagulation 三、纤维蛋白溶解与抗纤维蛋白溶解Fibrinolysis and Antifibrinolysis 四、出血性疾病实验诊断、临床意义 Laboratory Diagnosis and Clinical Significance of the Haemorrhage Disease 第一节The Basic Theoretcis 一、出血与止血Haemorrhage and Hemostasis 止血的三个基本条件:(1)血管结构与功能正常:完整性、弹性、收缩，释放因 子，激活血小板、凝血系统 (2)血小板功能与量的正常:黏附、凝集、活化、 提供界面 等(3)凝血系统的正常:14个因子，(HMW, Kininogen, kallikrein K) 二、血液凝固机理The mechanism of coagulation 凝血机理 血小板基本结构与功能 三、抗凝血系统The System of Anticoagulation 1细胞抗凝 2.体液抗凝 四 纤维蛋白溶解机制Fibrinolysis System and Mechanism FDP 1、抗凝血酶作用 2、结合纤维蛋白单体进而抑制纤维蛋白的聚合 3、抑制血小板的粘附和聚集 功能 4、抑制?a 活化F? Summary 止血:血管收缩 血小板激活 凝血系统活化 局部血粘度升高 血小板:黏附 聚集 释放 促凝物质 提供磷脂界面 凝血系统:一条共同 途径 两条凝血道路三个凝血阶段 四组(14个)凝血因子 第三章抗凝:细胞抗凝 体液抗凝 纤溶:纤溶酶 FDP 北京大学医学部 - 6 - 第二节 出血性疾病实验诊断临床意义Laboratory 分布异常:脾肿大;血液稀释 Diagnosis and ClinicalSignificance of the 增多>400x10 /L 原发性:骨髓增生性疾病:CML 真性红细胞增多症 Haemorrhage Disease 出血、血栓性疾病的检查Examination of Haemorrhage 原发性血小板增多症 骨髓纤维化早期 and Thrombosis Diseases 反应性增多:急性感染 急性溶血 某些癌症 Important Factors:血管Blood vessel血小板Platelet2. Platelet adhesion test PAdT (黏附率%) 凝血因子 Coagulate Factors纤溶Fibronalysis System 一、血管壁 毛细血管抵抗试验( CRT，90-100mmHg M<5 F<10) 原理 增高:血栓前状态/血栓性疾病:心梗 心绞痛 糖尿病 脑血管病 妊高征 肾小球肾炎 动脉粥样硬化 肺栓塞 深静脉血栓形成 避孕药 血管壁结构和/功能缺陷:遗传性出血性毛细血管扩张症、减低:vWD 巨大血小板综合征 血小板无力症 尿毒症 过敏性/单纯性/其它血管性紫癜 AL 肝硬化 MDS 低/无纤维蛋白血症 异常蛋白血症 /继发性血小板减少症、血小3. Platelet Aggregation 血小板量和/质异常:原发性 Test (PAgT)方法:利用切变力板增多症、先天性/获得性血小板功能缺陷 血管性血友病 (v WD) vWF:Ag测定(94.1%?32.5%)减低:vWD 或诱导剂诱导血小板聚集，检测自发性血小板聚集和循环血小板聚集。 常用的血小板聚集诱导剂 增高:血栓性疾病 心梗 心绞痛 脑血管病 糖尿病 妊ADP:引起血小板外形改变，GPIIb/IIIa上纤维蛋白原受高征 肾小球病 6-keto-PGF1a 体暴露，结合纤维蛋白原聚集。 血小板表面有三种ADP受体。 减低:同上 肿瘤转移 周围血管血栓形成Col:引起血小板活化、粘附、颗粒释放、聚集。 TTPThrombomoduline antigen TM:Ag Endothelin-1, ET-1 二、血小板数量和功能 1、血小板计数 (platelet count, PCT) 低剂量聚集由释放引起。对ASA敏感。受体有GPIa/IIa、GPVI。胶原粘附需vWF和GPIb。 AA:激活血小板，促释放而聚集，通过环氧化酶形成TXA2，对ASA敏感。 2、血小板粘附功能(platelet adhesiveness test PAdT) Adr:通过TXA2形成而活化磷脂酶c,故可被ASA抑制。不3、血小板聚集功能(platelet aggregation test PAgT) 完全抑制GPIIb/IIIa活化和与纤维蛋白原结合。 4、血块退缩试验(clot retraction test,CRT) 5、血小板相关免疫球蛋白测定 6、血小板第三因子测定 1.Platelet count 参考值:100~300x10 /L 临床意义:减少< 100x10 /L 其他诱导剂:凝血酶、TXA2类似物、 PAF、5-HT 以及A23187等。 另外:抗原抗体复合物、纤溶酶、蛋白溶酶、某些病毒、细菌及其产物、血管紧张素、某些肿瘤细胞和颗粒材料也可引起血小板聚集成为诱发血栓形成的病理机制。 诱导剂种类选择与血小板 生成障碍:再障;巨幼细胞性贫血;AL;放射性损伤;骨髓纤先天性/获得性缺陷 维化 破坏或消耗增多:原发性/新生儿/先天性血小板减少性 紫癜 TTP SLE 恶性 淋巴瘤 风疹 DIC 遗传性或获得性缺陷 ADP Adr Ris血小板无力症(GT) 无反应 无反应 正常 北京大学医学部 - 7 - 巨大血小板综合症(BSS) 正常 正常 无反应 血管性血友病 (vWD) 正常 正常 无反应 诱导剂种类和浓度选择与抗血小板药物监测 抗血小 板药物 ASA——AA ? 、Col ? 、ADP? 抵克力得——ADP? 脏和瓣膜移植 减低:血小板无力症 贮存池病 尿毒症肝 硬化 骨髓增生性疾病 原发性血 小板减少性紫癜AL 抗血小板药物 低/无纤维蛋白血症 4.血小板活化标志物及其检测方法 活化标志物 检测方法 自发性血小板聚集(SPA)在急性心梗预后判断中的意义 血小板聚集 方法:全血或PRP在不加诱导剂条件下于370C1000rpm连 自发性聚集 聚集仪 续搅拌20min。 判断:重度 10min 20min 20min发病时检测数 5年 例数 发病率(%) 重度组 26 9/26 35.0 轻度组 29 3/29 10.3 阴性组 94 6/94 6.4 每6个月测一次 血小板检测在血栓性疾病中的用途 (1)血栓前状态的预告因子 (2)指导抗血小板药物治疗及疗效判断 (3)血栓性疾病的鉴别诊断 (4) 预后判断 诱导剂诱导聚集 聚集仪 (比浊法与电阻抗法) 切变力诱导聚集 改制的锥板粘度计 循环血小板聚集体 血小板比率 血小板活化产物(在血浆中或在尿中) β-TG 酶标法或放免法 11-去氢-TXB2 同上 活化标志物 检测方法 活化状态的血小板 活化的GP?b-?a 酶标法或流式细胞仪 P-选择素 同上 血小板周转 体积 血小板分析仪 寿命 核素标记 其他 [ Ca2+] 荧光光度计 or FCM 作为血栓前状态检测，需要明确血小板是否处于“活化”5.血小板膜糖蛋白检测 及意义 状态 。 正常血小板 指导治疗和抗血小板药物使用通常采用血小板聚集功能凝血酶活化血小板:糖 尿病伴微血管病变、高血压病、冠及以下一些检测: 心病、高脂血症、脑血栓形成短暂性脑缺血发作、脑动脉 1.MPV、血小板数和P-选择素不稳定心绞痛和 硬化 自发性血小板聚集试验 急性心梗预后判 断; 3.Col诱导的血小板聚集、血小板数、MPV 三项指标在预示先兆子癫的发病上有意义。 PAgT的临床意义 血小板相关疾病 巨血小板:综合征(BSS)血小板巨大 血小板无力症:(GT) 增高:血栓前状态和血栓性疾病:心梗 心绞痛 糖尿病血小板群异 脑血管病 高脂血症 静脉血栓形成 肺栓塞 口服避孕三、凝血系统检查 药 妊高征 妊娠晚期 抗原-抗体复合物反应 人工心1、凝血时间内源途径(cloting time,CT) 北京大学医学部 - 8 - 2.部分凝血活酶时间(3) 凝缩不良:血块略有凝缩，少量血清析出 (4) 不凝缩:血块维持原样，无血清析出 6.复钙交叉试验(cross recalcification test, CRT ) 5(毛细血管脆性试验(Capillary resistance test) 四. 抗凝血物质检测 一级筛选试验临床意义及应用 血浆抗凝血酶活性测定;血浆抗凝血酶抗原测定;血浆蛋参考范围 实验名称 可能原因 白C测定;血浆蛋白S测定等 五.纤溶活性与降解产物检测 1(出血器法4.8-9 BT 血管 2(试管法4,12min CT 凝血因子 血浆组织型纤溶酶激活物测定;血浆纤溶酶原活性测定;3(100,300×109/L PC 血小板 血浆纤溶酶原活化抑制物测定;血浆纤溶酶,抗纤溶酶复4(完全收缩/24h CRT 抗凝物质 合物测定;血浆D,二聚体检测;血浆纤维蛋白相关肽检5(10个出血点以 Capillary Resist Test 测; 第三节 一级筛选试试验 1、出血时间(bleeding time BT)测定。 原理:血流停止时间主要受血小板及毛细血管的影响。 方法:出血时间测定器法 参考值:6.9 +/- 2.1min 2、凝血时间(Coagulation time,CT)测定 6(比服药前延长2’以 Aspirin耐量 必要时测血小板粘附试验或聚集试验 第四节 二级筛选试试验 1、凝血酶原时间测定(Prothrombin time, PT) 原理:血浆，组织凝血活酶(III)+ 钙? 凝血时间 外源途径 方法:Quik氏法(现已用仪器取代)。每次做正常对照。 原理:血液接触带阴电荷表面(如玻璃、白陶土)激活参考值:12,14s或大于正常对照3s以上为异常;PTR XIIa，最后使fibrinogen转化为Fibrin.(检查1.0+/- 0.1 途径)。 2、部分凝血活酶时间(Active partial thromboplastin 方法:试管法，3只APTT)。 液入针筒时计时。每管注入血液1ml,37?水箱，4分钟后原理:血浆，脑磷脂，白陶土激活XII?XIIa 每30s观察一次，血液不动为止(,管)，以二管凝血 时此试验主要测定血小板收缩酶 血块收缩、血清析出 血块凝缩影响因素:,) 血小板量和质,) FI 浓度3)FXIII的水平4)红血球的比积 参考值:35s,45s，患者结果较正常对照延长10s有意义 3、凝血酶时间共同途径(thrombin time, TT) 原理:受检血浆，凝血酶 血浆凝固 方法:患者血浆 正常血浆 凝血酶试剂 0.1ml 0.1ml 0.1ml 37?水箱 观察凝固时间 参考值:与正常对照相差3s以于1/2h、1h及24h分别观察血块4、血浆纤维蛋白原测定 北京大学医学部 - 9 - 原理:血浆纤维蛋白原与氯化钙作用生成纤维蛋白。 方法:仪器法 (定氮法) 参考值:2- 4g/L 5、复钙交叉试验 (已有凝血障碍) 二级筛选试验应用、临床意义 KPTT延长主要为XI、IX、VIII因子减少，各型血友病筛选试验, 凝血酶、纤维蛋白原、XII、PF3减少也有影响。 PT延长主要见于I、II、VII、V、X因子减少，如肝病、 凝血因子缺失 vs抗凝物质存在;待测血浆加正常血浆DIC等。 (1/5—1/10);纠正结果 第五节 纤溶活性检查试验 (plasma protamine paracoagulation test) 2.优球蛋白溶解试验(euglobulin 1.3P试验 lysis time, ELT ) TT延长主要见于抗凝血酶物质存在，DIC时延长。 纤维蛋白原测定减少，主要见于肝病、DIC、先天性纤维蛋白减少症。 3P阳性说明FDP，有纤溶现象。优溶<90min说明纤溶亢 3.血浆纤维蛋白降解产物测定(fibrin degradation 进。 products, FDP) 4.D-二聚体测定 (D-dimer, DD) 第六节 血液流变学检测 Blood viscosity 1.血浆鱼精蛋白副凝试验(Plasma protamine Plasma viscosity paracoagulation Test, 3P) Erythrocyte deformability 原理:纤维蛋白单体和纤维蛋白的降解产物(FDP)结合Erythrocyte electrophoresis time 成的可溶性复合物，在鱼精蛋白的作用下解离，使纤维蛋DIC(Disseminated Intravascular Coagulation) 白单体聚合沉淀呈 现可见的颗粒、纤维蛋白丝或胶冻胶发生于感染、败血症、外科手术或创伤、恶性肿瘤、病理冻胶冻状。 产科等患者。发病根本原因是上述因素破坏了人体凝血系 方法:病人血浆0.5ml，1,鱼精蛋白0.05ml摇匀置37?统和抗凝血系统之间的平衡，发病早期凝血功能亢进，使水浴箱15min后，观察结果。 临床意义:正常3P试验阴性。DIC确诊试验之一 2. 优球蛋白溶解试验 原理:优球蛋白 溶解在等渗盐水中 纤维蛋白 ， ?Ca2，(或凝血酶) 纤溶酶原?纤溶酶?凝固?溶解 血浆活化素? 方法:?加钙法 ?加凝血酶法 血液处于高凝状态而导致弥散性微血管,5mg/L(N) 4、D,二聚体,0.2ug /L (N) 根据发病机制分类: 一、毛细血管--血小板型出血性疾病: 1、临床表现:自发性皮肤粘膜出血,以出血点、紫癜、瘀斑、齿龈出血等为主。 北京大学医学部 - 10 - 2、实验室检查 以束臂试验、出血时间、血小板计数、核浆比:核大质少?核小质多(巨核细胞相反) 血块退缩试验为主，必要时检做血小板粘附功能、聚集功第二节 正常血细胞形态学 能检查。 二、凝血障碍,抗凝物质型出血性疾病 各系各阶段的正常骨髓象 第三节 常用血细胞化学染色检查 临床表现:自发性深部组织(肌肉、关节、准 评分 胞质中阳性染色颗粒 - 0分 无 + 1分 少量或弥散 浅色 ++ 2分 中等量或弥散 深色 +++ 3分 较多或弥散 较深色 充满大颗 第一节 血细胞的生成与发育Hematogenesis and ++++ 4分 粒或弥散 深色 Development 干细胞—— STEM CELL 1、自我更新能力 RENEWAL 2、高度增殖PROLIFERATION 3、多向分化潜能 PLURIPOTENTIAL 2.NAP阳性 正常 成熟中性粒细胞 3.临床意义 增高:严重化脓性感染 类白血病反应 真红 骨髓纤维化 ALL 慢粒急变 MM 再障恶性淋巴瘤 原发性血小板减少性紫癜 二、血细胞成熟规律The Maturation Law of Hemocytes 减低: CML AML PNH 恶组 胞体:大?小(巨核细胞相反) 胞浆:(1)量 少?多 (淋巴细胞例外) (2)颜色 深蓝?浅蓝?淡红?红细胞?橘红 鉴别诊断: CML vs 类白血病反应 PNH vs AA ALL vs AML 碱性磷酸酶的表达 许多资料表明，rat、mice的桑格胚细胞和囊胚细胞均有 (3)颗粒 无?嗜天青(早幼)?特异性(中性、嗜酸、AKP表达，Mice的EC和ES中均含有丰富的AKP。而在已嗜碱) (basophilic myeloblast 核/质散在粗大紫黑色分化的EC和ES中AKP呈弱阳性或阴性。猪、兔的桑格胚spots) 胞核:(1)大小 大?小 (2)核形 规则?不规则 (3)染色质 细致而疏松?粗而紧密 (4)核仁 有?无 (5)核膜 不明显?明显 和早期囊胚AKP呈阳性。因此，AKP常用来作为鉴定EC或ES分化与否的标志之一。 糖原染色Periodic acid-Schiff reaction, PAS 正常:幼红:阴性 巨核系、血小板:阳性 早幼粒以下各期粒细胞渐强,均匀、红色。 判断标准 胞质中红色颗粒 北京大学医学部 - 11 - 1.有核红细胞 2.淋巴细胞 0 无 0 无 + 分散少数或色浅 + 有一圈 ++ 1-2个浓颗粒环/弥散红色 ++ 有两圈 +++ 较粗颗粒小块/大块红色 +++ 有三圈 ++++有红色大团块 其他染色 非特异性脂酶染色 中性~，α-醋酸萘脂酶 NAE 酸性~，酸性醋酸萘脂酶 ANAE 碱性~， α-丁酸萘酶 NBE 特异性脂酶染色 氯醋AS-D萘酚酯酶(NAS-DCE)染色 表P32 骨髓细胞铁染色 二、其他疾病诊断 MM 部分恶性肿瘤 转移癌 某些代谢障碍性疾病:高雪(Gaucher)症 尼曼,匹克(Nieman-Pick)病 某些寄生虫病:疟疾、黑热病 一、骨髓细胞学检查结果分析 1.骨髓增生程度:表P39 2. 有核细胞分类和粒/红比值(myeloid:erythroid M:E) 有核细胞分类计数 计数200/500有核细胞，计算出各系统各阶段有核细胞百分数。 G:E=粒系总数/幼红总数 1.5-3.4:1 细胞分类计数时，巨核细胞另行单独计数 3. 正常骨髓象 粒系:增生活跃 占有核细胞50%? 各阶段细胞形态正常,比例适当: 原粒<2% 中幼粒<5% 细胞外铁(储存铁):骨髓铁以含铁血黄素形式贮存于网中晚幼粒各15% 嗜酸<5% 嗜碱<1% 状细胞 细胞幼红细胞含铁粒粗而多 巨核细胞:易见,主要为产板巨 原巨0~5% 20~70% 裸核0~30% 血小板簇易见 3.判断机体骨髓贮铁用完 细胞 少量 铁明显降低 or 消失。小细胞贫血而BM 铁粒幼比例增高 出现环形铁粒幼细胞 骨髓细胞检查报告例举 例一 正常髓报告方式 1. 取材佳、制片、染色满意 2. 有核细胞增生活跃、粒:红,2:1 3. 粒系原始粒以下各阶段比例正常，形态未见异 4. 红系各期比例正常、形态未见异常。 5. 淋巴系统正常。 6. 巨核系统全片查见20个，均为成熟形，散在成 簇血小板易见。 5.非缺铁性贫血观察 溶贫 AA leukemia BM 白细胞减少症 血小板减少性紫癜 鉴别诊断:全血细胞减少症:脾亢 巨幼红贫 恶性网状意见:正常骨髓象。 细胞症 非白血性白血病 AA ( aplastic anemia) 例二P43 北京大学医学部 - 12 - 例三 粒系:40,;红系:46,(中幼红20, ，晚幼红 With MD 上条+粒系和/巨核系MD 26,);粒:红0.87:1(粒红比倒置) 缺铁性贫血骨髓象 1. 取材佳、制片、染色尚可 2. 有核细胞增生明显活跃、粒:红,0.87:1 RARS Without MD 原始细胞 上条+粒系和/巨核系MD RAEB RAEB-I 原始细胞 5~10% RAEB-I 原始细胞 11~20% 3. 红系尤为活跃，以中晚幼红增生为主占46,，CMML 原始细胞0~20% 部分幼红细 胞体 积小，浆少偏兰，边缘残缺不急性白血病原始细胞形态鉴别:见表P50 齐，核固缩，成熟红细胞淡 染区扩大，可见嗜细胞 原粒细胞 原淋巴细胞 原单核细胞 多色红细胞。 4. 粒系相对欠活跃，余未见异常 。 5. 淋巴系统大致正常。 胞体(μm) 12,20 10,16 16,22 外形 规则 圆/椭圆 规则 圆形 圆形或椭圆形/不规 则有伪足 6. 全片查见巨核细胞30个，均为成熟形，散在成形态 圆形/椭圆 圆/椭圆有切迹 圆/不规则可有凹 簇血小板多 见，细胞外铁(,)，铁粒幼 红细胞5,。 意见:骨髓象符合缺铁性贫血。 骨髓细胞外铁及铁粒幼细胞染色临床意义:见表P47 缺铁性 地贫 贫血 铁粒幼细胞巨贫 AA 贫血 溶贫 陷折叠 偏于胞浆一侧 细 染色质细颗粒状; 颗粒状排列致密;纤维网状分布 均匀分布平薄感;浓染核膜及核仁 ; 不匀起伏不平 胞 着色浅 周围更浓集 着色较深 核膜 不清楚 最清楚 较清楚 核 核仁 2,5个 较小1,2个 清楚 1,3个大而易见 细 量 少 很少 环绕于核周 较多 常见伪足 胞 颜色 淡/中蓝清彻 淡/中蓝清彻 灰蓝色 半透明感 外铁 , ，~，， ，，，~，，，， ，，~，，，， 铁粒幼 红细胞 0~30,? 30~90, 50~90,? 40~90,? 细小色淡 多1-5粒 粗大色深 1-2粒 出现环形 粗大色深 多至30粒 浆 Auer小体 常见 无 常见有时不止一条 ALLP51 细胞特征 I 型 小细胞为主 II 型 大细胞为主 疏松 每例 III 型 各亚型的细胞学特征:见表 颗粒分布 MDS Myeloidysplastic syndromes 1.Definition 全潜能造血干细胞(Totipotent hematopoitic stemm cell)水平上的恶性病变，致分化/成熟障碍而引起的一组克隆性造血系统疾病。特点是向白血病转化。 2.Type RA (refractory anemia) RARS (~ with ring sideroblast) RAEB (~ with excess of blast) RAEB-t ( in transformation) CMML(chronic myelomonocytic leukemia MDS的WHO骨髓象诊断标准:见表P49 胞浆嗜碱 TYPE BM <5% RS<15% RA Without MD 原始细胞 胞浆空泡 不定 轻或中度 不定 有些深不定 深蓝 核仁 核形 细胞大小 较一致 呈细点状均匀 较规则 大细胞为主大 核染色质 较粗 每例结构较一致 规则 偶有凹陷和折叠 结构不一 不规则 凹陷 折叠常见 1或多个 明显1 或多个小泡状 不常见 /小而不清 清楚 少 较多 胞浆 不定 常较多 明显 蜂窝状 北京大学医学部 - 13 - Auer Claviform Body Definition 散在于细胞质中，棒头状or 棒杆状。深红色，排列不整。最多见于多颗粒网状细胞。 表:P53、54 AML的形态学/免疫学分型 亚型 描述标准 M0 MPO阴性 髓系标记阳性 M1 原始细胞>90%，MPO>3%阳性 M2 原始细胞20%~90% 单核系细胞<20% M3 早幼粒细胞样细胞，M3v M4 原始20%~90% 单核系细胞20~80% M5 原始细胞>80%，有单核系细胞 M6 BM幼红>50%原始细胞>20 M6B BM 80%幼红 M6D BM 20 %细胞原始粒 M7 原巨核细胞.20% Double 淋系与髓系细胞标记阳性 Phenotype 1. AML的形态学/免疫学分型 2. ALL各亚型的细胞学特征 3. MDS的WHO骨髓象诊断标准 5、 KPTT 90S(对照35S) 6、 TT 18S (正常对照17S) 7、 尿常规检查RBC满视野/HP 试问: 1、 以上检查哪些项目不正常, 2、 可能是哪种出血性疾病, 3、 应进一步作何试验, 肾功能检测 . 肾小管重 授课肾脏的生理单位和生理功能 二. 肾小球滤过功能的检查 三吸收和排泌功能的检查 四. 肾性酸碱平衡失调的检查 五. 肾功能试验的选择与评价 六. 病例分析 第一节 肾脏生理概述 一、肾 脏 的 生 理 单 位 肾单位 肾小球:毛细血管丛，肾小球囊 肾小管: 近曲、远曲小管，髓袢(每侧100万个。) 二、肾脏的生理功能 4. 骨髓细胞外铁及铁粒细胞染色在缺铁性贫血诊(一)生成尿液，清除体肾小球滤过作用:形成原尿(120ml/min) 2. 肾小管选择性重吸收:水、糖、电解质 3. 肾小管分泌和排泄作用:H，、Ca，，等 (二)调节水电平衡 根据发病机制可将出血性疾病分为哪两大类,它们1. Na、Cl、水的重吸收:肾小管 的检查可归为哪两大类,各类包括哪些K的重吸收:近曲吸收、远曲排泌 床意义。 DIC诊断的初筛和确诊实验各有何Ca、P的重吸收 (三)调节酸碱平衡 患者 男 22 岁 工人 因膝关节血肿伴血尿来院就1. HCO3,的主动重吸收:近曲小管 诊 实验室检查: 1分钟 2、 凝血时间 20分钟 3、 1、 出血时间 血小板 150×109/L 2. H，的排泌:远曲小管、髓袢 3. NH3 ，的排泌:髓袢 (四)肾素,血管紧张素,醛固酮系统 2. 1，25,二羟胆钙化醇(活性VitD3) 4、 PT 12 S(对照11 s) 3. 促红细胞生成素、前列腺素和激肽 北京大学医学部 - 14 - 三、肾功能检查的目的 低蛋白饮食、严重肝病等。 了解有无肾功能损伤、肾脏损失的程度和范围(累及肾小三、血肌酐(creatinine, Cr)测定 球、肾小管，或两者均累及)，借以制定治疗，观察(一)原理 其动态变化，判断预后。 第二节 肾小球滤过功能试验 一、概述 (一)肾小球滤过率(GFR) 每分钟肾小球滤过液的产量 Cr分肾小球通透性增加:炎症早期、缺氧 2. 肾小球通透性降低:炎症晚期、膜增生 3. 肾小球毛细血管压下降:大出血、休克 4. 肾小球囊44, ;女性 70,。 (四)临床意义 1.慢性肾炎:超过时有尿毒症可能。 2.急性肾炎:177,354 。 3.尿毒症:可达。 4. Cr减少:严重肝病。 四、肾性增高 1)不敏感，有效肾单位60,70,损伤; 2)慢性肾炎、肾盂肾炎、肾动脉硬化等; 3)尿毒症时有特殊价值，与病情成正比: 7.14~14.28 mmol/L 代偿期 14.28~21.4 mmol/L 失代偿期 尿毒症期 2. 肾前性增高 1)长期大量蛋白质饮食; 2)蛋白质分解过度:组织大量坏死、消化道出血等; 3)肾血流量降低:脱水、休克等; 3. 肾后性增高 尿道梗阻、前列腺肥大等; 4. BU减少 Cr全部清除出去。其清除率相当于肾小球滤过率。 (二)方法:无Cr饮食2,3天，同时检测静脉血和尿中Cr尿道和24h尿量。 (三)参考值 80,120ml/min/1.72m2 (四)临床意义 1. 较早判断肾小球的损害: ,正常值时提示肾小球损伤; 2. 对肾功能的初步估价: 51,70 ml/min 轻度损害 ,20 ml/min 早期 31,50 ml/min 中度损害 ,10 ml/min 晚期 重度损害 终末期 3. 指导治疗 ,40 ml/min 限制蛋白质饮食 噻嗪类利尿剂无效 应进行人工透析 4. 临床分型 北京大学医学部 - 15 - ，肾病综合征。 五、血尿酸(uric acid，UA)的测定 慢性肾炎普通型 (一)原理 重吸收相对正常，故尿量减少，尿比重增高。 2. 慢性肾小球肾炎:病变累及肾小管，尿浓缩功能障碍，尿量增加，尿比重降低，晚期尿比重固定。 尿酸是体慢性肾盂肾炎: 病变以间质炎症为主者，损伤肾小但98,在近曲小管被重吸收，清除率低。肾脏病变早期，管，尿量增加，尿比重降低。 血中尿酸浓度即可增加。 (二)方法:取静脉血检测。 (三)参考值 男性 女性 (四)临床意义 1. 血尿酸浓度升高 1)肾性增高:肾小球滤过功能损伤。 较血肌苷和血尿素较早反映肾功能损伤。 2)肾外因素:体肾小管排泌与重吸收功能试验 4. 其它:凡损伤肾小管功能的疾病，均可出现尿量和尿比重的变化。 二、酚红排泌试验(PSP) (一)原理 酚红(PSP)是一种无毒染料。注入体 25,50, 60min 10,15 , 30min 15,25, 120min 5,10, (四)临床意义 1. 年龄因素影响随着年龄增大而降低; 判断是否正常，更重要是15min排泌量(25,) 2. 慢性肾小球肾炎、肾动脉硬化 一、尿浓缩稀释试验(%， 提示血中可能有氮质储留 test) (一)原理 ， 提示肾脏有较重的损害 ， 提示肾脏严重损害 肾脏浓缩和稀释尿液的功能主要在远曲小管和集合管进3. 肾外因素 行。在日常或特定条件下，可通过观察病人尿量和尿比重心力衰竭、脱水等导致肾血流量降低。 的变化，判断肾脏浓缩与稀释功能。是判断远曲小管功能第四节 肾小管性酸中毒诊断试验 的敏感指标。 (二)方法 莫氏试验和改良莫氏试验 (三)参考值 尿总量1000,2000ml， 尿最高比重在1.020以上 夜尿量， 高低之比昼尿量:夜尿量为3,4:1 (四)临床意义 一、概述 近曲小管和远曲小管可通过重吸收HCO3,和排泌H，、 NH3，等离子，调节体急性肾小球肾炎: 肾小球病变，滤过减少，肾小管(二)方法 北京大学医学部 - 16 - (四)临床意义 取静脉血，密封送检。 (三)参考值: 断。但肾外影响因素较多，需排除痛风、白血病等疾病。 四、血浆尿素和肌酐 反映肾小球滤过功能的试验。在肾功能损伤到一定程度才 肾功能障碍时影响HCO,，血中NaHCO3 含量降低;其降有变化，故不能作为肾功能损害的早期诊断指标。但在肾低程度与代谢性酸中毒严重程度成正比。 三、血浆CO2结合力(CO2CP)测定 脏疾病的晚期或肾脏功能严重受损时，尤其是氮质血症或尿毒症时，有特殊的诊断价值，且增高程度与病情成正比。 (一)原理:CO2CP代表血浆中结合状态的CO2的量，间五、尿浓缩稀释试 (二)方法:取静脉血，密封送检。 (三)验 接反映血中NaHCO3 的浓度。 参考值:22,31 mmol/L (四)临床意义 测定远曲小管和集合管重吸收能力的试验。方法简便，敏感性良好，无痛苦。但不能精确地反映肾脏损害部位和范围，且尿中有糖或蛋白质时影响其准确性。 六、酚红排泌试验 肾性代谢性酸中毒时CO2CP降低。与酸中毒的严重程度成大致反映近曲小管的排泌功能，敏感性差，干扰因素多。正比。 22,18mmol/L 轻度酸中毒 18,14.4 mmol/L 中度酸中毒 重度酸中毒 极重度酸中毒 四、血液pH值测定 但因方法简便，目前临床仍在应用。 七、血浆NaHCO3 、 CO2CP和血液pH值测定 反映体尿常规:蛋白尿，有时有蛋白管型 2. 血清尿酸: 血浆肌酐: 1. 慢性肾炎损伤肾小管时， ，与病情程度成正比; 5. 尿浓缩稀释试验:尿量，比重尿毒症时明显降低; 3. 诊断代谢性酸中毒的依据。 第五节 肾功能试验的选择与评价 一、尿常规检验 非但对肾脏疾病的早期诊断有重要意义，而且对了解肾功能也有重要作用。 方法简便、快速、实用，无痛苦。应作为首选试验。 二、尿常规:蛋白尿; 少，可用于肾功能早期损伤的诊断，临床广泛使用。 三、血清尿酸 2. 血浆尿素: ; 3. 血浆肌酐: 肾脏病患的早期即可增加，有助于肾功能损害的早期诊4. 内生肌酐清除率: 北京大学医学部 - 17 - 5. 血清尿酸: 炎”。 6. 尿浓缩稀释试验:尿量，比重，晚期尿比重固定 1. 尿常规: 蛋白尿，有时有蛋白管型; 7. 酚红排泌试验: , ，, 2. 血浆尿素: ; What kinds of Laboratory Test Need Chronic Nephritis 3. 血浆肌酐: • • • • • • 1. Urine routine test 2. Blood urea 3. Creatinine 4. Endogenous creatinine clearance 5. Uric acid 6. Urine concentration test 尿浓缩稀释试验:24h尿量 4. 血清尿酸: ， 夜尿量， 比重， 7. 酚红排泌试验: , ，, 病例分析二 实验室检查指标为:血浆尿素22mmol/L，血浆肌酐，尿常规: 蛋白尿，红、白细胞管型等; 2. 血浆尿素: 7.14~14.28 mmol/L代偿期 14.28~21.4mmol/L失代偿期 尿毒症期; 3. 血浆肌酐: 晚期 血清尿酸: 尿浓缩稀释试验:异常 , ，, 7. 酚红排泌试验: 尿液检验 第一节 尿液标本的收集与保存 一、尿液标本的收集 适用于蛋白、 What kinds of Laboratory Test Need Chronic Rental (一)晨尿 糖、亚硝酸盐、细胞、管型等Failure Do? • • • • • • • 1. Urine routine test 2. Blood urea 3. Creatinine 4. Endogenous creatinine clearance 5. Uric acid 6. Urine concentration test 7. PSP excretory test 检测。 (二)随机尿 适用于门急诊化验。 (三)空腹尿和餐后尿 用于尿糖检测。 (四)导尿和中段尿 用于细菌培养。 (五)12小时尿 用于爱迪氏计数。 (六)24小时尿 用于蛋白、肌酐等检测。 (七)糖耐量尿标本 服用一定量葡萄糖后，分别于1/2小时、1小时、2小时、3小时留取尿液，同时 抽血送检。 (八)其他 如浓缩稀释试验、PSP等。 二、尿液的保存 病例分析 病例分析一 患者，男性，50岁。主述:乏力，下肢浮肿三个月。首尿液标本应及时送检，一般应在2小时内检测完毕，时间先应考虑什么疾病可能,应作哪些实验室检查, 太长会影响结果，留取12、24小时尿应加入适量的防腐 首先应考虑“肾脏疾病”可能，尤其是“慢性肾小球肾剂或进行冷藏。 北京大学医学部 - 18 - (一)防腐剂保存 1(甲苯 2ml/100ml,阻隔空气,利于化学检测. 病或肾周围淋巴管阻塞，腹腔肿瘤、肾盂肾炎等。 (三)外观及透明度 2(甲醛 0.2~0.3ml/100ml, 凝固蛋白,利于有型成份计常温下正常新鲜尿液清晰透明，放置后可出现微量絮状沉数。 3(盐酸 10ml/24小时尿，适用于激素检测。 淀物。新鲜尿液出现混浊见于: 1(尿酸盐沉淀 尿10ml/24小时尿，适用于醛固酮、5,羟色胺测淡红色或白色沉淀，遇碱或加热可溶解。 定。 5(其他 如麝香草酚等。 (二)冷藏保存 第二节 尿液常规检验 一、物理性状 (一)尿量 2(磷酸盐和碳酸盐 白色晶体状，加热加酸溶解，碳酸盐加热加酸溶解时，可产生气泡。 3(脓尿:尿2 :1 或 3 :2 1( 多尿:24小时>3000 ml为多尿。 摄入水过多 与大量饮水或输液有关的暂时性多尿。 尿呈酸性:痛风，肾结核，白血病，酸中毒，酮症酸中毒，4型肾小管酸中毒。 尿呈碱性:碱中毒，严重呕吐，变形杆菌感染，1、2、3 ADH性多尿 垂体分泌ADH不足或肾小管对ADH反应性降型肾小管碱中毒。 低(低比重)。 溶质性利尿 高比重或正常比重性多尿。 2(少尿:24h尿< 400ml或<17ml/h为少尿 (五)气味 尿液气味来自尿中的挥发性物质，受食物、饮料等的影响。 尿素分解——氨臭味 肾前性 少尿见于:休克、严重脱水、水肿、心衰等肾小酮症酸中毒——烂苹果味 球滤过不足 苯丙酮酸尿——鼠臭味 肾性 少尿见于:急性肾炎、慢性肾炎急性发作、肾衰等 (六)比重 肾后性少尿见于:泌尿系统结石引起的梗阻，前列腺肥大、又叫比密，与尿液所含溶质的浓度呈正比，与尿量呈反比。尿道狭窄等 3(无尿:24h尿< 100ml或12h 眼观血尿、镜检血尿。见于肾结核、急性肾小病理性比重增高:急性肾小球肾炎、蛋白尿、糖尿病、高球肾炎、泌尿系统肿瘤 及感染、出血性疾病等。 热、脱水、心功能不全、流行性出血热少尿期等。 2(血红蛋白尿:尿色呈红葡萄酒色或酱油色。见于血型病理性比重减低:肾实质性损害、肾小管功能疾病，如急不合的输血、溶血性贫血、恶性疟疾和阵发性睡眠性血红性肾功能不全，肾小管动脉硬化等。 蛋白尿。 精确评价肾脏浓缩稀释功能以测定渗透量为好。 3(胆红素尿:尿液颜色呈深黄色或黄褐色。见于阻塞性二、化学检验 黄疸及肝细胞性黄疸。 尿的化学检验项目很多，常规检测主要有蛋白、糖、酮体、 4(乳糜尿:呈乳白色，有时可带少量红细胞。见于丝虫尿胆红素、尿胆原、亚硝酸盐等。 北京大学医学部 - 19 - (一)尿蛋白检查 (定性) 1(加热醋酸法 2(磺基水杨酸法 3、试带法(干化学法) 临床意义 织分解代谢产物和尿路细胞分泌的蛋白质，主要为小分子量的蛋白或肽，一般方法无法检出。当泌尿系统受炎症、中毒或药物刺激后，组织分解代 1.0g。 谢产物增加或分泌蛋白质增多，导致蛋白尿，24h尿蛋白排泄量可达0.5,6.假性蛋白尿 肾脏各种泌尿道疾病而产生大量脓液、血生理性蛋白尿:正常人也可出现蛋白尿，如剧烈活动、妊液、粘液等含蛋白成分的物质，混入尿中。见于膀胱炎、娠期、长时间暴露在严寒中，精神紧张大量摄入蛋白质以肾盂肾炎等。 后。但尿蛋白定性一般不超过(+)，定量<5mg/24h。青春分 类 期男女可出现直立性蛋白尿，较长时间站立后尿中蛋白量轻度蛋白尿:含量<1g/24h，可见于功能性蛋白尿、体位增高，而平卧以后，尿蛋白又减少或消失。 性蛋白尿、间质性病变为主的肾脏疾病、肾小动脉硬化、病理性蛋白质尿:1.肾小球性蛋白尿 肾小球滤过屏障受隐匿性肾炎、急性肾炎恢复期、慢性肾盂肾炎等。 到损伤而产生的蛋白尿。 中度蛋白尿:含量为1.0-3.5g/24h，可见于急慢性肾小特点:以白蛋白为主，占70,78%，蛋白排出量较多，球肾炎、各种原因引起的肾病综合征、肾动脉硬化症，严常>1g/24h。蛋白排出量多少与肾小球滤膜损伤程度相关。重肾间质性疾病。 多见于原发性或继发性肾小球疾病、肾循环障碍、缺氧等重度蛋白尿:含量>3.5g/24h，多见于各种原因引起的肾引起的肾病综合征。 病综合症，急慢性肾小球肾炎等。 2.肾小管性蛋白尿 因肾小管炎症、中毒等引起肾小管损(二)尿糖检测 害，以致肾小管对肾小球滤液中小分子蛋白质重吸收功能正常人尿中仅含有少量的葡萄糖，24小时浓度为减退。 2.78mmol/L,定性试验为阴性.当血糖浓度>8.8mmol/L，超特点:尿中以小分子量蛋白增高为主，白蛋白正常或轻度过肾小管重吸收收能力时，葡萄糖从尿中排出过多，此时增加。尿蛋白排出量常<1g/24h。临床表现为肾小管-间质尿糖定性试验阳性。 性疾病。 1(班氏定性法 3.混合性蛋白尿 肾小球和肾小管均受损，尿中出现小分2(试带法 子和大分子量的蛋白质。 3(班氏定量法 特点:尿中大、小分子量的蛋白质都存在，24小时尿蛋4(邻甲苯胺法 白排出量较高。临床常见于肾小球肾炎后期，合并各种肾临床意义:尿糖阳性见于糖尿病、肾性糖尿病、甲状腺机小管间质病等。混合性蛋白尿还可见于全身性疾病，如系能亢进等。在短时间肾小球滤过及肾小管重吸收功能均正萄糖后，出现的糖尿，可伴有血糖增高。正常人一次进食常，但由于血浆中异常小分子量蛋白质，可经肾小球滤出，200g以上葡萄糖，即可产生糖尿。 肾小管不能完全重吸收，而产生的蛋白尿。 2.暂时性糖尿 因暂时性原因，如延脑血糖中枢受到刺临床常见于多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、急性溶血性疾激、颅脑外伤、脑血管意外、急性心肌梗塞等应激反应时，病、大面积肌肉损伤，随着原发病情进展进而引起急性肾或肾上腺素或胰高血糖素分泌过多，产生的暂时性高血糖功能衰竭。 和糖尿。 5.组织性蛋白尿 正常人尿液中可含有少量可溶性的组3.血糖正常性糖尿 血糖正常，但因肾小管对葡萄糖的重 北京大学医学部 - 20 - 吸收能力减退，肾阈值降低引起的糖尿，又称肾性糖尿。2.白细胞 尿中白细胞主要为中性粒细胞。在新鲜尿液中此类疾病与糖尿病区别在于，其血糖和糖耐量试验均正常分散存在，细胞完整、无色、呈圆形或椭圆形，胞核清常。 楚，加酸后更为明显，胞浆最常见于糖尿病，因胰岛素分泌量相参考值:正常人尿液中可有少数白细胞，一般不超过0,对或绝对不足，使体即乳糖、半乳糖、果糖等进食过多间质性肾炎和新月体肾小球肾炎。淋巴细胞增多见于 或体正常尿中可见到少量上皮细者进食过多水果后。戊糖尿见于遗传性缺陷或食入多量富胞。常见的有: 含戊糖的水果。 三、显微镜检查 (1)扁平上皮细胞(pavement epithelium) 细胞大而薄，外形不规则，核小呈椭圆形。 尿沉渣显微镜检查可发现尿中各种有型成份，如细胞、管参考值:正常人尿液中少量存在 型、细菌、结晶、滴虫、虫卵、微丝蚴、包涵体、粘液丝临床意义:多来自尿道粘膜层，一般无临床意义， 等，对泌尿系统疾病的诊断具有重要意义。 若大量出现并伴有较多的白细胞，则表示相应部位 原理:利用光学、干化学或光电学原理观察、计算和识别有炎症变化。 尿液的有形成份。 方法1〕光学显微镜法2〕干化学法3〕流式细胞术 (一)细胞成份 见课件18 (2)大圆上皮细胞(Large round epithelium) 胞体呈圆形，比扁平上皮细胞略小，核稍大，呈圆形或椭圆形。 参考值:偶见于正常人尿中 1.红细胞 新鲜红细胞为淡黄色圆盘形。在高渗尿(3) 尾形上皮细胞(tailed epithelium) 呈拖尾形或参考值:正常人尿中偶见红细胞，一般不超过 0,3个/HP 纺锤形，核较大，呈椭圆形或圆形，大小约20,40um。 临床意义:若每个高倍视野超过1,3个以上红细胞，而参考值:正常人尿中不含此细胞 眼观无色即称为镜下血尿。血尿常见于肾小球肾炎、急性临床意义:多来自肾盂、输尿管及膀胱颈部，见于 膀胱炎、肾结核、肾盂肾炎、外伤、运动、泌尿系统的肿肾盂或输尿管炎。 瘤和结石等，亦可见于出血性疾病，肾移植术后。 红细胞分型 (4) 小圆或多边形上皮细胞(small round or polygonal epithelium) 较白细胞略大，圆形或多边形，核大而圆， (1)均一型 红细胞形态基本正常，有时可出现少数淡核膜清楚，胞浆中常可见脂肪滴及小空泡。 影红细胞及棘形红细胞。此型多见于非肾小球型肾病。 参考值:正常人尿中不含此细胞 (2)多形型 红细胞形态多样，大小不等，多见于肾小临床意义:尿中大量出现多见于肾小管，肾小管病变和肾球性肾病(90% )。 移植后发生排异反应时,并可见上皮细胞管型。 (3)混合型 均一型和多形型红细胞均可见。此型表明(二)管型成份 见课件20 肾小管间质已受损，提示肾小球性肾病。 1.透明管型(hyaline cast)为无色透明内部结构均匀的 北京大学医学部 - 21 - 圆柱体，两端钝圆，偶尔含有少许颗粒。 参考值:正常人在浓缩尿液中偶见此管型 临床意义:此管型出现较多时，多见于肾动脉 硬化及肾病。 颗粒管型演变而来，提示严重的肾小管变性坏死，见于慢性肾炎晚期及肾淀粉样变等。 7.类圆柱体 形态与透明管型类似，两端尖细，且易呈扭曲或弯曲如螺旋状。其成因不明，可能是肾小管所分泌的 2.细胞管型(cellular cast) 管型基质在透明管型的基质中，含有较多的红 细临床意义:此管型出现较多时，多见于肾血循环 胞。 障碍或肾脏受刺激。 白细胞管型 在透明管型的基质中，含有许多白细 胞(三)结晶成份 见课件22 (或脓细胞)。 1.酸性尿管型的基质细尿酸结晶(uric acid crystal)肉眼观察似红砂细粒，常胞。 参考值:正常人尿中无细胞管型 临床意义:常见于急性肾炎。 沉于尿液盛器底层。显微镜下为黄色菱形或各种形态的结晶，可单个存在或堆集成簇。 草酸钙结晶(calcium oxalate crystal)肉眼可见尿浑浊。 3.颗粒管型(granular cast) 管型基质颗粒细小稀疏 粗颗粒管型 颗粒粗大浓密 参考值:正常人尿中无此管型 临床意义:颗粒管型的出现，提示肾单位有 淤滞现象。 哑铃形。 非晶形尿酸盐(amorphous urates)肉眼观察为黄红色沉淀物，在淡色尿又称铵镁磷酸 4.脂肪管型(fatty cast) 管型基质如含有多量脂肪滴，盐结晶，为无色透明闪光，呈屋顶形或楞柱形。有时可呈为肾小管上皮细胞变性所致。 参考值:正常人尿中无此管型 羽毛状或羊齿草叶形。 尿酸铵结晶(ammonium urate crysrtal) 为黄褐色、不 临床意义:尿中出现脂肪管型，见于类脂肪性肾病和肾病透明、常呈刺球形或树根形。通常见于腐败分解的尿中。型慢性肾小球肾炎等。 此结晶加酸可溶化而出现尿酸结晶。 5.肾衰竭管型(renal failure cast) 为急性或慢性肾功非晶形磷酸盐 (amorphous phosphate) 肉眼观察为白能衰竭时在集合管中形成，管型粗大，管型基质上带有大色沉淀物，显微镜下观察为无色颗粒，加酸可以溶解。 量颗粒。 参考值:正常人尿中无此管型 临床意义:尿液中出现此管型，见于血管呈浅灰色或蜡黄色的折光性，纹与同心纹。 质较厚，外形宽大而易断裂，有时呈扭曲状。 参考值:正常人尿中无此管型 酪氨酸结晶(tyrosine crystal) 为略显黑色的细针状晶体，常呈束状或羽毛样排列。 临床意义:蜡样管型是长期存留于肾小管中的细胞管型和胱氨酸结晶(cystine crystal) 为无色六角形片状结 北京大学医学部 - 22 - (3)疗效观察 (4)体检,耐受能力 晶，正常尿 分类蛋白质代谢的试验 脂类代谢的试验 维生素代谢的试验 糖类代谢的试验 酶类代谢的试验 免疫功能试验 胆红素代谢的试验 色素的排泄试验 药物转化功能试验 激素代谢的试验胆汁酸代谢 临床意义:肾盂肾炎，白细胞明显增多;急性肾小球肾炎，的试验 红细胞明增多。 第三节 尿液的其它检验 一、尿酮体 二、尿胆红素 三、尿胆原 四、亚硝酸盐 五、溶菌酶 六、β2微球蛋白 七、FDP 八、免疫球蛋白、补体3 九、AMY 十、含铁血黄素 十一、糖蛋白等 复习思考题 1. 尿液检验的意义, 2. 简述肾小球性蛋白尿的产生机理。 3. 混合性蛋白尿的特点是什么, 4. 简述血糖增多性糖尿的产生机理。 5. 显微镜检查主要包括哪些6. 尿沉渣检查 7. 临床上多见的蛋白尿是什么, 8. TH糖蛋白来源于何的有哪些, 处, 9. 高温高热引起的蛋白尿属于何种蛋白尿, 10.暂时性糖尿的原因有哪些, 二、蛋白质代谢试验 (一)血清总蛋白、白蛋白与球蛋白测定 1. 原理 总蛋白----双缩脲比色法 白蛋白----溴甲酚绿比色法 2. 参考值 3. 临床意义 白蛋白测定的临床意义 升高 较少见:严重腹泻、呕吐引起的脱水，广泛性烧伤，急性大出血 降低1.蛋白质摄入不足:慢性胃肠道疾病，营养不良，妊娠后期，哺乳期 2.白蛋白合成功能不全:肝硬化，肝功严重损伤，慢性感染，恶性贫血 3.蛋白质消耗太多:甲亢，糖尿病，慢性消耗性疾病，恶性肿瘤 4.蛋白质丢失增多:肾病综合征,严重烧伤 球蛋白测定的临床意义 升高 1. 肝肾疾病:慢肝，肝硬化，肾病综合征 2. 自身免疫病:风湿热，系统性红斑狼疮 3. 恶性肿瘤及某些血液病:多发性骨髓瘤，淋巴细胞性白血病 4. 感染性疾病:疟疾，丝虫病，血吸虫病 降低 1.γ 球蛋白减少或缺乏症 2.使用大量网状 1. 原理2. 参考值3. 临床意义 肝脏病常用的实验室检查 一、 绪论 目的(1)了解损害程度 北京大学医学部 - 23 - (不溶于水，不能由肾脏排出) ?肝脏 ?葡萄糖醛酸基转移酶 葡萄糖醛酸-胆红素(结合/直接胆红素) (溶于水，可由肾脏排出) (四)黄疸的发生机制 1.溶血性黄疸 2.肝细胞性黄疸 3.阻塞性黄疸 (1)胆红素形成过多(2)肝细胞处理胆红素的能力下降(3)胆红素在肝外的排泄障碍，逆流入血而引起黄疸 新生儿生理性黄疸成因:(1)葡萄糖醛酸基转移酶活性不 高(2)胆红素产生较多(3)缺乏Y蛋白摄取能力差 血清黄疸指数测定• 目测:以1:10000稀释度的重铬酸钾为一个单位 2-6 单位: 正常 7-15单位: 隐性黄疸 >15 单位: 巩膜染黄 结果受 溶血、脂血症、药物 的影响血清胆红素定量试验结合胆红素+重氮试剂--------偶氮胆红素 非结合胆红素+重氮试剂+加速剂-----偶氮胆红素 测定胆红素的价值在于: (1)发现隐性黄疸 (2)了解黄疸的发展和转化 (3)鉴别黄疸种类 尿中胆红素定性试验•尿中直接胆红素可被碘液氧化成绿色的胆绿素，而被检出。 尿胆原定性试验 在酸性溶液中，尿中尿胆原与对二甲氨基苯甲醛发生反应，形成樱红色化合物。正常人阴性或弱阳性。 四、血清酶学检查 (一)血清酶活性变化机制 1.肝细胞内酶生成亢进或低下 2.肝细胞膜通透性增高 3.肝细胞变性坏死 4.酶排出的障碍 北京大学医学部 - 24 - 5.激活剂、抑制剂的影响 (二)诊断肝胆疾病常用酶的分类 1. 肝细胞实质性损害:AST、ALT、GDH、LDH 2. 胆道疾患:ALP、GGT、5’-NT 3. 肝脏实质纤维化:MAO、b-NAH •膜结合糖蛋白 •肝，骨，肾，肠，胎盘，胆汁，白细胞 ALP基因••三种遗传基因控制 胎盘ALP，肠ALP，肝/骨/肾ALP 糖链结构差异 碱性磷酸酶( ALP或AKP) 磷酸对硝基苯，H2O ALP 对硝基酚，磷酸 4. 肝脏肿瘤:5’-NPDase、ACT(三)酶学检查 同工酶测定方法 1.转氨酶 丙氨酸氨基转移酶•物理学方法(电泳、层析) •选择性灭活法(抑制剂，热变性) ALT Glutamic pyruvic transaminase, GPT •免疫学方法 天冬氨酸氨基转移酶•电泳染色原理 β-萘磷酸钠+H2O?β-萘酚+磷酸钠 AST Glutamic oxaloacetic transaminase, GOT 丙氨酸氨基转移酶, ALT 谷丙转氨酶, GPT丙氨酸，a,酮戊二酸 ALT 丙酮酸，谷氨酸 丙酮酸， NADH LDH 乳酸，NAD 天冬氨酸氨基转移酶, AST谷草转氨酶, GOT天冬氨酸，a-酮戊二酸 AST 草酰乙酸+谷氨酸 草酰乙酸，NADH MDH 苹果酸，NAD转氨酶测定的临床意义 1.急性肝炎:早期诊断, 预后 2.AST/ALT比值 3.ALT与黄疸分离: 重症肝炎 4.ALT与AFP关系: 肝炎: AFP?, ALT? 肝硬化: AFP低水平升高 肝癌: AFP进行性升高 AST/ALT比值 AST/ALT 正常人 1.15， 急性病毒性肝炎早期 或轻型肝炎时 0.56(<1) 至恢复期比值逐渐上升 肝硬化 代偿期为1.5?0.7 失代偿期为1.8?0.7 肝癌 半数病例>3.0 碱性磷酸酶•Alkaline phosphatase, ALP, AKP, EC3.1.3.1 •磷酸单酯磷酸水解酶 •磷酸单酯+H2O——?磷酸+酚(醇) β-萘酚+固蓝B?紫色 •酶定位 肝ALP:α2 骨ALP:α2-β 肝骨混合带:α2-β 肠ALP与胎盘ALP:β-γ 胆汁ALP:α1• 参考值:肝，骨 热稳定性试验 ALP同工酶 56?10min(%) 65?10min(%) 骨 0.19-5 0 肝 1.77-8 0 肠 69.5-81.3 0-0.95 胎盘 90.7-99 87~94 抑制剂的敏感试验•3.8mol/L尿素, 9.9mmol/L苯丙氨酸 •尿素-ALP/总ALP=0.1-0.2 肝ALP •尿素-ALP/总ALP=0.01-0.09 骨ALP •苯丙-ALP/总ALP?0.6 胎盘ALP •苯丙-ALP/总ALP?0.7 非胎盘ALP ALP测定的临床意义 生理性增加:骨生长、妊娠、脂肪餐后 病理性增加:1.肝损伤 2.成骨性损伤 3.肿瘤 4.胆汁淤积 有助于黄疸的鉴别 1. 80%的阻塞性黄疸ALP升高，ALT仅轻度升高 2. 肝细胞性黄疸ALT很高，ALP正常或稍高。 3. 肝内局限性胆道阻塞时，ALP明显升高，ALT无明显增加，胆红素不高。 血清ALP增高机制 北京大学医学部 - 25 - •膜—胆汁—从膜分离—透入血中 •肿瘤细胞合成 •炎症刺激邻近肝细胞产生ALP •成骨细胞增生 ALP同工酶的临床意义 胆汁型ALP: 肝外阻塞性黄疸, 转移性肝癌 阳性率高; 肝 原发性肝癌 阳性率低. 胎盘型ALP: 测定胎盘功能的指标 胆汁型ALP对监测肿瘤肝转移具有较高的价值。 胎盘ALP: 妊娠最后三个月时在血清中增加很快，分娩前突然 下降，产生3,4天即消失一半，作为胎盘功能好坏的指标。 骨ALP:?:病理性成骨、破骨、生长发育 不能用于鉴别非恶性骨病的恶性肿瘤骨转移，但 骨肿瘤的阳性率高。 肠ALP:正常胃及食道粘膜无ALP，当肠腺化生时，ALP 可以增高，此种ALP证明是肠ALP，对早期发现胃癌有所帮助。 类胎盘ALP: Regan ALP:常见于睾丸、卵巢和胰腺癌 Nagao ALP:胰尾部腺癌和转 认为这些类胎盘ALP是胎盘型ALP在癌组织的异位 移性胆管腺癌 合成 ALP糖链•恶性肿瘤所产生的胎盘ALP和肝ALP的糖链不同于正常器官所产生的ALP的糖链。正常器官的糖链改变成为肿瘤特有的糖链，与细胞的恶性转化有关。 γ -谷氨酰基转移酶• γ-Glutamyltransferase,γ-GT,GGT，EC2.3.2.2. •γ-谷氨酰-多肽:氨基酸γ-谷氨酰基转移酶 •谷胱甘肽+氨基酸----?γ-谷氨酰氨基酸+Cys-Gly •膜结合糖蛋白 •肾:胰:肝=44:13:4 •尿>血 GGT基因•人类基因组中有一GGT基因家族 •Courtay证实人基因组中含有多个GGT基因组序列 γ-谷氨酰基转移酶 (γ-GT或GGT) γ,谷氨酰对硝基苯胺，双甘肽 ?γ-GT γ,谷氨酰基双甘肽，对硝基苯胺 电泳染色原理γ-谷氨酰α萘胺 + Gly-Gly? -谷氨酰-Gly-Gly + α萘胺 α-萘胺 + 固蓝B?紫红色 酶定位GGT1: 白前γ ——白区 GGT2:白后——α1区 GGT3:α1后——α2区 GGT4:α2 β区 GGT5:β后——γ区 参考值:GGT1，GGT2:+ γ-GT临后—— 床评价 当ALP增高时可用于鉴别此增高的ALP是来源于肝还是骨，此点在孕妇尤为重要. 确定酒精和某些药物对肝脏潜在危险性。 γ-GT同工酶电泳发现γ-GT4增高与血清胆红素增高密 切相关，出现γ-GT1者均有肝功能异常。 同工酶检测及临床应用 The Assay and the Clinical Application of Isoenzymes 第 一 节 概 述 一、同工酶的定义 1、同工酶是以多种分子形式存在于机体的酶 2、催化功能相同 3、分子结构不同 二、检测同工酶的目的 1、检测同工酶活力比单测定酶的总活力更具 有脏器特异性和高灵敏性等优点，因而提 高了临床诊断价值 2、早期诊断某些疾病，阳性率高，特异性强。 3、可以估计病情严重性和判断预后。 三、同工酶的命名 国际化学联合会(International Union of pure and Applied Chemistry IUPAC)建议: 1、在命名同工酶时应采用规定的酶的名称 北京大学医学部 - 26 - 2、如同工酶电泳图上各主要区带旁还分出若干亚区带时(三〕遗传变异体同工酶 可以用 a, b, c, d 注于主要区带的右下方。 这是一类由位点上单一突变性等位基因所决定的 同工 3、经明确鉴定过的特异同工酶，可以附加诸如分子量，酶，也 可 称为复等位基因同工酶。 这类同工酶的 发生稳定性，亚单位等参数。 是由亲代机体中的某一基因发生突变而出现了等位基因， 4、同工酶不应该用组织的分布来加以注解(如脑型，心这一等位基因表达了一条特异的多肽链。 肌型等〕 因为这类同工酶在别的生物机体中不一定存在典型代表:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD) 于同一组织中。 目前广泛地应用于临床的同工酶: 乳酸脱氢酶同工酶 Lactate dehydrogenase,LDH 肌酸激酶同工酶 Creatine kinase,CK 碱性磷酸酶同工酶 Alkaline phosphatase,ALP 天冬氨酸氨基转移酶 Aspartate transaminase,AST γ - 谷氨酰转移酶 γ- - 淀粉酶同工酶 --N-乙酰氨基已糖甘酶同工酶-N-acetylheyxosaminidase 四、同工酶的基因基础 第二节 同工酶的分析方法 正是由于同工酶的一级结构 (氨基酸序列)及高级结构(构象)的不同，因此，一种酶的各个同工酶在化学，物理化学，生物化学等方面的性质也就有所差异，这些差异就提供了分析和鉴定同工酶的理论基础。 一、电泳法 在研究同工酶的所有方法中，电泳法的使用最为广泛。因为此法简便、快速、分离效果良好，并且一般不会破坏酶的天然状态。 (一)定义:在电场中带电粒子向相反电荷的电极移动，称为电泳。 由于一种酶的各同工酶的氨基酸序列不同， 同工酶的最主要特征是由遗传基因决定的一级结构不同因而在一定 PH的缓冲液中，所携带的电荷不同， 荷质的多种形式的分子。有三种遗传原因可以使机体中出现同比及 分子形状也不同。电泳时， 各同工酶组分的 电泳工酶 (一〕复基因位点同工酶 率也就不同，于是各同工酶组分便得以分离。例如，LDH同工酶。LDH2、LDH3、LDH4、LDH5都比LDH1有较多的碱 由不同染色体上的基因或是同一条染色体上不同的基因性氨基酸，在pH8.6的巴比妥缓冲液中LDH1带有更多的片段各自编码有相同催化功能的同工酶 负电荷，因而向阳性泳动最快。 (2)有些酶虽然由不同染色体上的基因编码，所合成的(二)介质 酶分子多肽本身的分子大小和电荷使它们能互相组装成醋酸纤维薄膜—简便，成本低，标本量少， 杂化酶。 分离能力良好，脆性物质，不宜保留，常规用。 乳酸脱氢酶(LDH) 就是由两种不同多肽链组成的四聚琼脂糖—简便，成本低，透明性好，胶板可染色后定量分体。这两种多肽(A和B)是分别由11号染色体上的 LDHA 析，干燥保留，常规用。 基 因 位点和12号染色体上的LDHB基因位点编码。这两聚丙酰胺—成本较高，透明性好，分辨率最高，试剂对皮种多肽一旦合成后在不同组织中能互相组装成五种四聚肤和神经系统有毒，一般用作科研。 体同工酶。 (二〕复等位基因同工酶 (三)仪器 电泳仪:手工 全自动电泳仪 在生物群体常常会出现多个不同的等位基因，每一个等位(四)同工酶的活力检测方法 基因表达一个变异的多肽的氨基酸序列，各等位基因的差电泳法只是分析某一酶的各种同工酶的组分,各组分的活异可使同一种族中同一酶的一级结构各不相同。 典型例子:小鼠的LDH复等位基因同工酶 力检测需依靠以下三种方法。 紫外吸收和荧光分析;光密度计测定;染色法 北京大学医学部 - 27 - 二. 免疫化学法 性，乘以2即为CK-MB活性。 (一)定义:由于同工酶的一级结构不同，因而免疫化学(四)CK同工酶的临床意义 性质也不同，用纯化的同工酶免疫动物可得到特异性的抗1(急性心肌梗死 体。此抗体只与该同工酶产生特异性免疫反应。 (二)方法:免疫抑制法，免疫沉淀法,免疫酶标法 三. 动力学分析法 (1) CK总活性在急性心肌梗死后的4小时便开始升高，至20-30小时达高峰，3-5天后下降至基础水平。此酶为诊断心肌梗死的一个极灵敏指标。 (一)定义:酶的动力学是研究反应速度与反应机制的科(2)CK-MB主要存在于心肌细胞其共有三种同工酶:CK-MM,CK-MB和CK-BB。在细胞线粒体中半数以上可检出CK-MB，(CK-MB/CK,5%)而心电图都无0% CK-MB 0~3% CK-MM 97~100% CK-Mt 5% CK-MB的阳性决定水平为 5% 2.免疫抑制法测定 • 检出CK-MM，而CK-BB含量甚微，这是由于CK-BB难于透过血脑屏障之故。 4(神经肌肉疾病的诊断和监护 急性肌损伤、慢性肌病、进行性肌营养不良CK及CK-MB均增加,但CK-MB/总CK<5%。 CK亚型 原理:用羊抗CK-M抗体与病人血清共同温育，血清中的CK-MM亚型: MM3?基因型、组织型 M2M2 CK-M亚单位全部被抑制，测定剩余的非 M-CK 活性，即 MM2? -Lys M1M2 代表 CK-BB和 CK-MB中的B亚基，由于正常人和心脏， 肌 MM1? -2 Lys M1M1 肉疾患病人血清中CK-BB的含量极低，故一般忽略不计，CK-MB亚型: CK-MB1, -2Lys, 此时测得的非 M-CK 活性实际上代表CK-MB中的B亚基活 CK-MB2(组织型) 北京大学医学部 - 28 - 电泳法正常参考值:CK-MM1 42?6% CK-MM2 31?3% 4.生殖细胞恶性肿瘤和肾胚细胞瘤:LDH1?, 1 > 2 CK-MM3 19?5% CK-MM3/ CK-MM1 0.5?0.2 当病人伴有心衰或发生心源性休克时，由于心泵打出的血 临床意义:CK-MM亚型测定对早期心肌梗死的检出高度敏液减少，侧肢循环及心脏收缩力减弱，心博量和心排出量感，约有94%的病人在首次采血时即证实AMI。 下降，引起全身组织缺氧，肌体产生无氧代谢，造成肝脏 CK-MB测定的干扰:巨CK1:CK-BB-IgG(A), CK-MM-IgG(A)受损，肝细胞膜通透性增高，向血中释放LDH5。 巨CK2:低聚线粒体CK，CK-Mt CK-BB: AK: 腺苷酸激酶 充血性心力衰竭，心源性休克等是急性心肌梗死(AMI)病人发病期间的主要并发症，也是影响病人死亡率的重要因素。 二.乳酸脱氢酶同工酶(Lactate Dehydrogenase),简称34例AMI电泳结果LDH1显著升高，16例AMI伴有并发症LDH, LD, EC 1.1.1.27 (一) 组成与分布 LDH 1,5 H, M, MW 140,000. LDH 1,2: 心肌, 肾, 红细胞 LDH 3: 肺, 脾, 胰, 甲状腺, 肾上腺, 淋巴结 LDH 4,5: , 肝 LDH x: 睾丸, 精子 骨骼肌 (二) 检测方法--------琼脂糖电泳法 原理: 以琼脂糖胶作为介质,LDH可分离出 五种同工酶区带,根据其电泳迁移率的快慢, 将迁移最快的命名为 LDH1, 依次为 LDH2, LDH3,LDH4和LDH5,最后显色,扫描确定其 百分率. (三) 参考值 LDH1 28.4 ? 5.3% LDH2 41.0 ?5.0% LDH3 19.0 ? 4.0% LDH4 6.6 ? 3.5% LDH5 4.6 ? 3.0% (四)LDH同工酶的临床意义 1. 急性心肌梗死: 总LDH: 12,18h??3d??7,14d LDH1: 6h??24h LDH1/LDH2>=1 24h 轻症: 总LDH正常,同工酶有变化 2. 肝病: 急肝: LDH1,2?, LDH5? 肝硬化: LDH2?, LDH5? 者结果LDH1偏低，LDH5升高。 三.天冬氨酸氨基转移酶同工酶Aspartate Transaminase, 简称AST, GOT, EC 2.6.1.1 (一) 组成与分布 AST有二种同工酶,位于组织细胞的线粒体仅见非深染的ASTs酶带. (四) AST同工酶临床意义 1.急性心肌梗死: ASTm? 2. 肝病: 急、慢性肝炎, 活动性肝硬变ASTm?，评价预后 3. 肿瘤: 局灶性肝恶性变 ASTs:ASTm=1:1 4. 肌营养不良:均升高 四.碱性磷酸酶同工酶Alkaline phosphatase 简称:ALP,AKP EC3.1.3.1 磷酸单酯磷酸水解酶 膜结合糖蛋白 肝,骨,肾,肠,胎盘,胆汁,白细胞 ALP同工酶的临床意义 胆汁型ALP:肝外阻塞性黄胆,转移性肝癌 阳性率高 肝原发性肝癌 阳性率低 胎盘ALP:妊娠最后三个月时ALP在血清中增加很快，分 3. 肿瘤: M?100% LDH5? 93.7% LDH4? 66.1% LDH3? 娩前突然下降，产后3,4天即消失一半，作为胎盘功能 北京大学医学部 - 29 - 好坏的指标。 骨ALP:?:病理性成骨、破骨、生长发育 2. 医院感染的来源 (1) 病人本身的正常菌群引起。 不能用于鉴别非恶性骨病的恶性肿瘤骨转移，但骨肿瘤的(2)外源性感染 病人身体以外的微生物。 阳性率高。 3. 易感宿主 主要是由于各种原发疾病导致机体抵抗力 肠ALP:正常胃及食道粘膜无ALP，当肠腺化生时，ALP低下的住院病人。 可以增高，此种ALP证明是肠ALP，对早期发现胃癌有所(三)医院感染常见的临床类型 帮助。 1. 呼吸道感染:误吸、气管切开等，最常见 类胎盘ALP:Regan ALP:常见于睾丸、卵巢和胰腺癌;Nagao 2. 泌尿道感染 :留置导尿 ALP:胰尾部腺癌和转移性胆管腺癌 认为这些类胎盘ALP3. 胃肠道感染:口服抗生素所致菌群失调 是胎盘型ALP在癌组织的异位合成。 4. 伤口感染:手术器械或医护人员手污染，胃肠道、 γ -谷氨酰基转移酶同工酶γ-glutamyltransferase,简泌尿生殖道或皮肤正常菌群污染 称: γGT,GGT 5. 血液感染:输液、血透或拔牙、手术等 当ALP增高时可用于鉴别此增高的ALP是来源于肝还是6. 皮肤和软组织感染:直接接触 骨，或是胎盘，此点在孕妇尤为重要. 思考题 同工酶的定义及检测目的 同工酶检测的几种常用方法 (四)医院感染与传染病的比较 * 表1 医院感染与传染病的比较 病原体 耐药性 医院感染 传染病 病原学 医院感染及其实验诊断 主要授课2. 医院感染的微生物学检验 3. 医院感染的检测 4. 医院感染的控制原则 一、医院感染的概念、特点与临床类型 条件致病菌为主 典型致病菌 常呈多重耐药 不如前者突出 病原学诊断 * 不易判断 较易判断 流行病学 感染来源 外 源性 传播方式 常为特殊方式 常见途径 感染对象 病人，尤其免疫低下人群 健康人群 爆发频率 医院 社会爆发多 高 (一)医院感染的定义:医院感染(nosocomial 传染性 低 infection)，又称医院获得性感染(hospital acquired 隔离意义 保护性隔离 病原性隔离 infection)，是指在医院复杂和不典型 单纯和典型 诊断 需微生物学定性、定量、定位分析 临床和 (1)微生物种类:细菌(bacteria)、病毒(virus)、真菌流行病学分析，必要时作病原学诊断 (yeast)、寄生虫(parasite) (2)细菌种类:条件致病菌 (3)细菌来源:主要来自病人 * 治疗 较难 较易 二、医院感染的微生物学检验 (一)标本采集与处理 (4)细菌的量:引起健康人和病人感染所需的细菌的量1. 标本采集原则 差别很大 (5)不同时期主要病原菌不同 1)及时采集 (2)无菌操作 ( 北京大学医学部 - 30 - (3)立即送检 (4)定量或半定量培养 (5)药敏试验 (6)分级报告和限时报告 2. 各种临床标本的采集方法 (2)血液标本 1) 采血时间与次数 抗菌药物治疗前、发热初期或高峰期;连续2,3次。 2) 采血部位:肘静脉 采集方法:注射器抽取 采血量:成人 5,10ml，儿童 1,2 ml (3)痰、咽拭等呼吸道标本 2)平板划线接种 四区划线法 (3)初代培养 1)初代培养最好含5,10, CO2(尤其是嗜血该菌、奈瑟菌等) ,，培养18,24h (分枝杆菌2,4w) (4)分离纯化 初代 2)35 培养分不出单个菌落时应重新分区划线接种。 3. 生化鉴定 利用细菌可以分解、发酵不同的底物(葡萄糖、乳糖等糖类，氨基酸、盐类等等)，产生不同的代谢产物(酸性、碱性、产气等等)的特性，鉴定不同种类的细菌。 4. 血清学反应 1)采集时间:晨痰为好; 2)方法:自然咳痰法方便。 观察待检菌株与已知抗体的凝集反应，鉴定各种细菌，并(4)尿标本 1)中段尿:最常用 2)两侧肾盂尿:单侧肾脏感染 3)膀胱穿刺:厌氧菌培养 (5)粪便标本 1)自然排便:最常用 2)直肠试子:排便困难或婴儿 (二)微生物学检查 1. 染色镜检 (1)直接镜检:湿片法或悬滴法，观察细菌动力。 分型。(如沙门菌、志贺菌、致病大肠埃希菌、霍乱弧菌等抗血清。) 三、 环境细菌的监测 (一)环境监测的主要对象 1. 手术室和重症监护病房 2. 爆发流行时的调查 3. 血液透析室和临床实验室的监测 (二)空气中细菌污染的监测 1. 沉降法采样监测 同一平面五个不同的点，打开平皿水平静置30 min。 3 (2)革兰染色镜检: 革兰阳性,紫色;革兰阴性,红色 细菌数(CFU)/m (3)抗酸染色镜检: 抗酸菌,红色 2. 空气采样器采样法监测 (4)其它特殊染色镜检: a.荚膜染色; b.鞭毛染色;c.空气采样器在同一平面五点采样。 异染颗粒染色 2. 分离培养 (1)培养基的选择 1)增菌培养基:肉汤、碱性蛋白胨水 2)基础培养基:营养琼脂、水解蛋白琼脂 3)选择培养基:麦康凯琼脂、SS琼脂 4)鉴别培养基:胆汁七叶苷琼脂 5)厌氧培养基:厌氧血平板 (2)接种方法 1)肉汤增菌 (三)物体表面细菌污染的监测 1. 涂抹法:无菌棉拭，区域涂抹10次，放入定量无菌盐水中混匀、接种。 2. 压印法: Rodac平皿(直径5cm,表面积19.63cm，培养基高出平皿1,2mm)，直接压贴在待查物体表面10,20s。 (四)医务人员手部细菌污染的监测 1. 目的:(1)通过定性和定量检查，了解手部细菌污染情况; (2)评价手的清洁和消毒效果。 2. 方法:(1)涂抹法 (2)压印法 2 北京大学医学部 - 31 - (五)环境细菌监测的卫生学标准 1. 细菌总数标准 * * 手 * 2 2 (1)消毒剂使用过程中污染细菌的监测 1)稀释中和法:加入相应浓度的中和剂，中和消毒剂的杀菌作用; 表3 各类环境中的细菌总数卫生学标准 空气 物体表面 医务人员2)滤膜过滤法:用火棉胶微 环境类别 范围 孔滤膜(孔径0.22~0.45µm) 过滤、洗涤、培养。 (CFU/m) (CFU/m)(2)消毒剂应用效果的监测 2 (CFU/m) * I类 ? 1)常用菌种:金葡ATCC6538 大肠ATCC8099 绿脓ATCC9027 枯草ATCC9372 白念ATCC10231 2)培养基:细菌,营养琼脂 真菌,沙保培养基 3)方法: 定性试验 定量试验 四、医院感染的控制原则 IV类 ? , II类 ? III类 ? (一)医护人员的医德和专业教育 1. 具有良好的医德 ?层流洁净手术室、层流洁净病房; ?普通手术室、产房、婴儿室、早产儿室、普通保2. 自觉遵守各项无菌操作、 消毒隔离和洗手等。 护性隔离室、供应室无菌区、烧伤病房、重症监护病房; (二)消毒灭菌质量控制 * ?儿科病房、妇产科检查室、注射室、换药室、治1. 高压蒸汽灭菌效果 疗室、供应室的清洁区、重症抢救室、化验市、各类普通2. 化学消毒剂消毒效果 病房; * ?传染病科及病房。 3. 不耐热医疗器械消毒效果 4. 药品无菌 5. 血液污染控制 2 . 病原体指标 (1)物体表面和医务人员手:婴儿室、儿科病房,,不(三)合理使用抗生素 得检出沙门菌;及早确立病原学诊断，根据细菌培养和药敏结果及单胞菌; 3 治疗情况调整用药; (2)空气:各科室、门诊,,乙型链球菌不超过20/m; 2. 掌握对应药物的性能。如抗菌谱、 抗菌活性、药代、外科、妇产科,,不得检出铜绿假单胞菌。 药动学、适应症、适当剂量和不良反应等; (3)凡消毒后的医疗用品,,不得检出病原菌;凡灭菌 3. 根据患者生理、病理和免疫状态，合理用药。 后的用品不得检出任何微生物。 (六)消毒灭菌的效果监测 (四)建立必要的感染控制制度 1. 各种诊疗手段的无菌操作制度 1. 高压蒸汽灭菌效果的监测: 生物指标的监测为直接2. 保护性隔离制度 检查灭菌效果，通常应用嗜热脂肪芽胞杆菌(NCTC 100033. 重点区域卫生保洁制度 或ATCC 7953)。 2 . 紫外线杀菌效果的监测: 生物学监测用枯草芽胞杆 菌黑色变种(ATCC9372)。 要求对试验微生物的杀菌率达主要授课合理使用抗生素制度 细菌耐药性检查 北京大学医学部 - 32 - 3. 抑菌试验 4. 杀菌试验 5. 体外联合药敏试验 6. 特殊的药敏试验(MRSA、ESBL) 第一节细菌耐药性检查的概述 2. 减少不必要的抗菌药物的使用，降低治疗费用，也降低对病人机体的损害。 3. 减少耐药菌株的产生。 4. 辅助鉴定细菌。 第二节 细菌体外药敏试验的抗菌药物选择 一、细菌的耐药机制:细菌可通过基因突变、质粒介导和肠杆菌科 转位因子插入等，产生抗生素灭活酶、改变细菌细胞膜的首选氨苄西林和头孢唑啉;次选庆大霉素、阿米卡星、青结构或抗生素结合位点等，使抗生素失去对其杀灭或抑制霉素与-临床分离菌株必须进行常规药敏试验以提供临床选亚胺硫霉素、头孢氯氨苄、环丙沙星、强力霉素。 择药物时参考。 淋病奈瑟菌 2. 临床因治疗的反应差而考虑更换抗菌药物时，应对拟首选青霉素G;次选壮观霉素、强力霉素、环丙沙星、头选药物进行药敏试验。 孢克肟、头孢美唑。 3. 了解所在医院或地区常见病原菌耐药性的变迁情况。 第三节抑菌试验 4. 评价新抗菌药物的抗菌谱和抗菌活性等药效学特性。 用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长大效力的试验。实验5. 对细菌耐药谱进行分析和分型有助于某 些菌种的鉴方法主要有进行定性测定的纸片扩散法(disk diffusion 定，并作为医院感染流行病学调查的手段之一。 四、细菌耐药性检查的意义 test)，定量测定的稀释法(dilution test)和E试验法(E test)。 1. 指导临床合理选择敏感的抗菌药物，及时控制细菌感一、纸片扩散法 染。 临床常用的是纸片琼脂扩散法(disc agar diffusion 北京大学医学部 - 33 - method)，即Kirby-Bauer(K-B)纸片琼脂扩散法。 1. 抗菌药物的配制与稀释 1. 原理 :将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检用蒸馏水或 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6)稀释抗菌药菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶物。 解后不断向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度，在纸2. 待检菌和质控菌的准备 同K-B法。 片周围抑菌浓度范围接种、孵育 最终接种浓度为 。 抑菌圈，抑菌圈大小与该药对待检菌的最低抑菌浓度4. 结果判读 肉眼可见生长的最低药物浓度为MIC。 (MIC)呈负相关关系。 直径6.35mm，吸水量为。 3. 培养基 水解酪 2. 抗菌药物纸片 蛋白(M-H)琼脂。 4. 操作方法 (1)转种肉汤，制备菌液(0.5麦氏单位); (2)接种平板，贴药敏纸片; (3) ?，18,24h)。 5. 结果判读 孵育(35 5. 质控控制 (二)微量肉汤稀释法 用无菌96孔聚苯乙烯U型微量板代替试管，其他方法同肉汤稀释法。 (三)琼脂稀释法 本法的优点是可以同时做多株菌株的MIC测定，结果重复性优于肉汤稀释法，且易于发现污染或耐药突变菌株。 1. 含药琼脂的制备 取稀释后的抗菌药物 2ml，分别加入18ml消毒后、冷却至50?左右的琼脂中。 5 敏感(susceptible) 表示待检菌能被测定药物常规剂2. 接种 定点接种1,菌液。 量给药后在体孵育 35?18,24h。 中度敏感(intermediate) 指待检菌可被测定药物大剂4. 结果判读 菌落生长完全被抑制的最低药物浓度量给药后在体表示待检菌不能被体 原理: E试验结合了稀释法和扩散法的原理和特点，能达到的抗菌药物浓度所抑制。 6. 影响纸片法药敏结果的因素 (1)培养基的质量 (2)药敏纸片的质量 (3)接种菌量 (4)孵育条件 7. 质量控制 金黄色葡萄球菌 ATCC25923大肠埃希菌 ATCC25922 铜绿假单胞菌 ATCC 27853 二、稀释法 (一)肉汤稀释法 操作简便同扩散法，但可以同稀释法一样直接定量检测药物对待检菌的MIC。同纸片扩散法的主要区别在于E试验所用的是一条宽5mm、长50mm，方法 培养基、菌液准备和接种均同K-B法，贴E试验试条(90mm平皿可贴1,2根，140mm平皿可贴6根)。 3. 结果判读 孵育后围绕试条可形成一个椭圆形的抑菌圈，抑菌圈与试条的横向相交处的读数即为抗菌药物对待检菌的MIC。 第三节 杀菌试验 稀释法是定量测定抗菌药物抑制细菌生长作用大体外方一、最低杀菌浓度的测定 法，分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。稀释法所测得的某种最低杀菌浓度为某种抗菌药物能杀灭99.9%以上待检菌的抗菌药物能抑制待检菌肉眼可见生长的最低浓度称为最最低药物浓度。 低(最小)抑菌浓度(minimal inhibitory concentration1. 方法:规测定方法的前部分同MIC测定试管稀释法。MIC)。 后续步骤如下: 北京大学医学部 - 34 - 7(1)含菌量稀释至10CFU/ml待检菌菌液在接种的同时2.治疗多种细菌所引起的混合感染。 用MH肉汤以1:10的方式连续稀释4次，最后一管含菌3.对于某些耐药菌株可取得协同抗菌作用。 量为10CFU/ml，然后分别取0.1ml加到2个血平板上，4.减少或推迟治疗过程中细菌耐药性的产生。 均匀涂布，孵育，次日计数并计算其平均数。0.1,最初5.减少某些治疗指数低的抗菌药物的用量，从而减轻其毒接种菌量的菌落数I,N/2+2N/2 。 性副作用。 3 (2)MIC测试管孵育20h将无肉眼可见生长的各管旋涡二、抗菌药物联合应用后的结果 均匀后再孵育4h，取0.1ml加到2个血平板上，均匀涂1. 协同作用(synergy) 布，孵育，次日计数并计算其平均数。 2. 相加作用(addition) 2.结果判读:落计数等于或小于0.1%。最初接种菌量的最3. 无关作用(indifference) 低药物浓度为该药对待检菌的最低(或最小)杀菌浓度。 4. 拮抗作用(antagonism) 二、时间-杀菌曲线法 时间-杀菌曲线法主要用于三、联合抑菌试验 评价一种抗菌药物对待检菌的杀菌速率，以及两种或两种实验方法分为扩散法和稀释法。 以上抗菌药物对待检菌的联合杀菌活性。 扩散法包括单药纸片法、搭桥法和纸条扩散法等，可用于本法所用的培养基和待检菌的准备等与测定MIC的肉汤定性粗筛。 稀释法相同，测定方法如下: 1.取无菌试管5支，分别加入MH肉汤10ml。 稀释法为目前临床实验室常用的定量方法，按使用培养基的不同，分为试管棋盘法、微量棋盘法和琼脂棋盘法。临 2.在各试管中加入定量的测试药物，其含量 一般为该药床常用试管棋盘法。 在体 根据测定结果，按照下列公式计数部分抑后分别取0.1ml接种到4个血平板上;生长对照管旋涡稀菌浓度。 释后稀释1:1万和1:10万后各取0.1ml接种。孵育后FIC指数,A药联合时MIC/A药单测时MIC，B药联合时作菌落计数并取其平均数。 MIC/B药单测时MIC 6. 8h管的处理方法同4h管，生长对照应稀释1:100万判断标准 FIC指数 协同作用 倍。 FIC指数 0.5~1 相加作用 7. 24h管旋涡均匀后分别取0.1ml接种到2 FIC指数 1~2 无关作用 生长对照管应稀释1: 1千万,1:1亿倍。 FIC指数 拮抗作用 8.将各时间点测得的平均菌落数在半对数坐标纸上绘制四、联合杀菌试验 杀菌曲线。 第四节 体外联合药敏试验 一、联合用药的指征 联合杀菌试验所用的方法同前述的时间-杀菌曲线法。分别测定并绘出两种药物对待检菌的单独杀菌曲线和联合后的杀菌曲线。 1.病原菌尚未确定的急性、重症感染的经验治疗，以扩大第五节 特殊药敏试验 治疗的覆盖面。 一、-内酰胺酶的检测 北京大学医学部 - 35 - 1.测目的: -临床意义:产ESBL大肠埃希菌和克雷伯菌不论体外耐药。 -临床意义:ESBL阳性表示对不耐酶的青 3. 注意事项:革兰阴性菌不检测 霉素和头孢 菌素耐药。 3. 注意事项:产ESBL的大肠埃希菌和克雷伯菌对所有 青霉素和头孢菌素耐药。 三、耐药基因的检测 1. 检测目的:所有产生耐药的细菌，不论其产生的机制 如何，都与起基因位点变化有关，可通过分子生物学技术 (DNA探针、PCR等)检测。 2. 临床意义:阳性的基因检测表示对该抗生素耐药。(见 P293表7-13) 3. 注意事项:临床上多采用PCR检测技术。PCR检测需 有严格的质量控制。 四、临床耐药流行菌株的检测 1. 耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA)的检测 1)定义:苯唑西林纸片的抑菌圈直径，或其MIC 的金黄色葡萄球菌、 对苯唑西林纸片的抑 菌圈，或其的凝固酶阴性的葡萄 球菌。 2)临床意义:MESA不论体外药敏结果如何，对所有-临床意义:对VRE目前尚无有效的治疗方法。 3. 超广谱-内酰胺酶(ESBL)肠杆菌的检测 北京大学医学部 - 36 -