苯巴比妥对大鼠额叶、顶叶、小脑神经元及神经胶质细胞凋亡的影响（可编辑）

苯巴比妥对大鼠额叶、顶叶、小脑神经元及神经胶质细胞凋亡的影响（可编辑） 苯巴比妥对大鼠额叶、顶叶、小脑神经元及神经胶质细 胞凋亡的影响 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师或指导小组的指导下,由本人独立完成。 本学位论文研究所获得的研究成果,其知识产权归河北医科大学所 有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表 与学位论文主要相关的论文,第一署名单位为河北医科大学,试 验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。 否则,承担相应的法律责任。 研究生签名:希辱兵导师签章: 日 ‘ 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果,除了 文中特别加以标注等内容外,文中不包含其他人已发表或撰写的研究 成果,指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写,文责自负。 研究生签名: 导师签章: 罗日/删四四四删 芎葺。 目录 中文摘要英文摘要研究论文苯巴比妥对大鼠额叶、顶叶、小脑神经元及 神经胶质细胞凋亡的影响 前言.?.?..??.?..?...?.. 日 吾............................?................?...........?......... ..... 材料与方法结果..??.....??..........?......??..?.. 附图?..?.?... ;;表.....?.?......??.......?.....?...?....??.. 讨论?..........?..?... 结论......?....??.....??..?..??....?........?....?.....?.. 参考文献 综述线粒体及各种细胞因子在细胞凋亡中的作用和调节机制研究 进展..?.??.?.?. 致 射?...................?..............?......................?......?? ..... 个人简历??申文摘要 苯巴比妥对大鼠额叶、顶叶、小脑神经元 和神经胶质细胞凋亡的影响 摘 要 目的:癫痫是大脑神经元异常放电所引起的短暂中枢神经系统功能失 常为特征的脑部疾病,是神经系统常见病,目前仍以长期口服药物治疗为 主口苯巴比妥舳由蹴,虽然不是最理想的抗癫痫药物,但它 具有疗效肯定、价格便宜、药源充足的优点。随着临床研究的深入,人们 发现它还有许多抗癫痫以外的作用。在儿科它可用于治疗新生几缺氧缺血 性脑病、预防早产儿颅内出血、预防热性惊厥的复发;在消化内科可用于 治疗急性黄疸型肝炎、胆道蛔虫症;在神经科可用于治疗重症流行性乙型 脑炎、蛛网膜下腔出血、眩晕症、神经营养障碍性水肿、预防开颅术后癫 痫发作等【】因此,虽然目前有多种抗癫痫药物可供选择,仍有很广 泛的应用人群。 目前关于抗癫痫药物对幼鼠脑损害的机制已有深入的研究,并发现抗 癫痫药通过影响基因表达、离子通道、神经递质和第二信使系统导致了神 经元凋亡;还可通过影响细胞的迁移、分化、突触形成及突触可塑性,神 经纤维髓鞘形成等过程来影响幼鼠脑发育。学习、记忆、情绪活动和癫痫 电波的播散有相同的途径,在抑制癫痫发作的同时必然也导致了上述生理 过程受损【】。查新显示,对成年大鼠额叶、顶叶、小脑细胞凋亡的影 响报道较少,是否这些部位的细胞凋亡引起了其神经系统不良反应就值得 我们去研究。 本课题主要研究其中枢神经系统不良反应,应用给正常大鼠灌胃, 心蠡潞 用原位末端标记法田血谢 晌伽曲哒嘲脯哟吣啦妇铋 蛐,腿,观察大鼠 额叶、顶叶、小脑神经元和神经胶质细胞阳性表达数目,应用免疫组化法 检测大鼠额叶、项叶、小脑神经元和神经胶质细胞戤和蛋白表达 的变化,来判断这些结构变化跟不良反应之间的关系。 方法: 研究对象:选用清洁级健康雄性日龄朔圈曲大鼠中文摘要 只,随机分为组,每组只。 组:生理盐水组,生理盐水以州矾给大鼠灌胃,分为两个亚 组,分别于灌胃满天和天时各取只处死取脑; 组:治疗剂量短程组,以俺班给大鼠灌胃,灌胃天时处 死取脑; 组:治疗剂量长程组,以吲堍艏给大鼠灌胃,灌胃天时处 死取脑; 组:高剂量短程组,以删给大鼠灌胃,灌胃天时处死 取脑; 组:高剂量长程组,以煳给大鼠灌胃,灌胃天时处死 取脑; 实验方法:用自制的灌胃器对各组大鼠进行灌胃,用药达到观察时间时 处死取脑,做石蜡切块,行腿染色和免疫组织化学染色。光镜观察 各组脑片额叶、顶叶、小脑凋亡细胞形态及数量上的改变。 统计学方法:采用.统计分析软件,用方差分析法进行统计分 析,以.为检验水准,认为统计学上有意义。多组间均数用. 趟帆检验比较,各组均数间两两比较用阶?检验。 结果: ’烈,法显示组大鼠额叶可见大量棕黄色细胞,余各组各脑区仅见 少量阳性细胞。组额叶凋亡细胞与组相比,.,有统计学意义。 组额叶凋亡细胞与组长程亚组及组比较砌.,有统计学意义。 组与组、组与组长程亚组、组与组项叶、小脑细胞凋亡数量 比较.,无统计学意义。组与组短程亚组、组与组各脑叶 细胞凋亡数量比较.,无统计学意义。组与组、组与组短 程亚组、组与组长程亚组各脑叶细胞凋亡数量比较.,无统计 学意义。组两个亚组间各脑叶细胞凋亡数量比较加.,无统计学意 义。 免疫组织化学法染色:酝与细胞核、浆着棕色为阳性表达。 组短程亚组与长程亚组额叶、顶叶、小脑均有.、觚少量表 达,组间比较.,无统计学意义? 组与组额叶、顼叶、小脑均有、觚少量表达,组间比较中文摘要 .,无统计学意义。组与组短程亚组、组与组长程亚组额 叶、顶叶、小脑.、觚阳性表达数目比较,.,无统计学意义。 组额叶觚表达明显多于组,组间比较.,有统计学意义。 组额叶觚表达明显高于组长程亚组与组,组间比较.,有 统计学意义。组与组额叶.均少量表达,组间比较.,无统 计学意义。组额叶阳性表达与组长程亚组及组相比,组间比 较.,无统计学意义。组、组项叶及小脑均有.、少量 表达,组间比较.,无统计学意义。组顶叶、小脑.、觚阳 性表达数目与组长程亚组及组比较,.,无统计学意义。组 额叶、顶叶、小脑、【阳性表达数目与组短程亚组及组比较, .,无统计学意义。 结论: 治疗剂量的对大鼠额叶、项叶、小脑神经元及神经胶质胞的凋亡无 明显影响。 长时间应用高剂量的使大鼠额叶弧蛋白表达明显增高,额叶神经 元和神经胶质细胞凋亡增加,提示可能通过增加觚的表达引起细胞 凋亡。 长时间应用高剂量的对大鼠顶叶、小脑神经元和神经胶质细胞的凋 亡无明显影响。 关键词:苯巴比妥;额叶;顶叶;小脑;神经元神经胶质细胞;凋 亡英文摘要 .... :印 鹏咖铋 劬 如‘滴 锄 玛. ‘加 心??枷如?.伍髓 印删?鼬栅恤 撕锄 印印.? 哪瞄 唱, 舔缸敏跚 印锄 咖璐 嬲 .? 如以伽锄印面 伍.. 惦 骶 拙 斌撕, 砌埘晒? 协 皎锄证抽:心?枷 锄【】耐 烈洲,目瑚 试 删?. ? 阳? 斟印?咄 饥 : 酏 印 哆弱弱. 印鲫咖 肌, 觚?鹕 ,础油 觚嫩舱印舳疵舶印 瞰础强肾, 硎, 鹏帅田删 钆 觚畔 砌。衄瑕 ?鹏?.鹏?内 锄 印 撕 】翻曲 . 饥缸:角略咖娉锨聪鹪 池巧 硫跏印 砸;删仃 印印 雄屯 球?也如赶梵血 】【鹏 , 姗匝碱, 吼蜘髂觚 ?? ? 钉即啮.:印砸 酣粗麟妇砌撇缸璩卿 ,删玛 剐咄?内彻 掣擒砸 疵饥饿? 贫琴碱. ??鼢 也研 曙恕陀咖豫即?懿瓶 妇锄 . ? ,恤 嗍: 甜她删觚 埘孵如孙 : 勰瓯? 饥仪咖辩糟.黝睽煳 行. 锄乏, 珥怖 球乳锄联百惋自 英文摘要 .锄 眦糯: 瑚鹏:. 咀 ,撕 血 加 也?够舔: 雄’埘 沏锄球凇班屯 池也 ?仔. 咖. 鸲 ? 崩? 弱 豫’ . 媳而乞 懿百豫 髓.加咀锄玳籼‘刁他叩,幻 锄 豫: 豳出嗽澎 自越,咖 咖 小?酗【慨: 小删“枷量钯 一嘲培.嘴 印叩啪 砌 眦眦 瑚枷酏枷酏叮洳. 恤: 饥【袱鹏 . 嘴、?弱慨纳嘶 .觚 鹏// 豁 、, 谢 虹 曲咖砒砒, 霉,锄哪慨 觚 .咖脯讹砌 酏蚋 弱讹 髓锄.咖 油叫蛞/伽啊.衲 弱仃耐埘 鲫刚 蜘.咖嗍删、?? 他戚酣 略他 】鲈吲『矗阿衄.髓【肫绷 洳幻 舳.? 玎心嘲缸 吐地 啪 印 即觚 麟? 觚 锄: 娜一 『她, 血叩. 僦:?吣删姗娥 ??鲫, 锕钮 砒..锻犯 撕 、?弱? 瓯:粕. 鹪缸: 勰 【肥 咖 酬.跚删哆 ,?臃 、糊?涮 .. ?.曲 印 鲈 ,印 ,舯 聊 矗: , 娜妣 丘.. 坝曲叩姗血 掣伽 ,罂 ,乎坝 屯瞰觚?嘲潮?, 删酬 咖锄..如吼妙跏唧血 弛掣瑚 咖鲫孕,掣 自删,英文摘要 觚 啪, 姬鲥 鲥觚..吐.曲 撕晚 眦咖,觚哪 跏 删吨砌印 ,印 觚 供 ?孕伽 锄跚【伊饥.自删.,驰 嘶觚.廿】叩吡 廿 自羽, 唧 .咖乎. 帏舰:咖鲫缪伽钌玛 啪 嘶丘觚. 撕酊锄 嘴 . 【 咖锄 ? . 坞盯 印 嬲跚谢 觚 .姗锣 他咖鲈.跏.?曲班 .懒印 唧 ’ 盯, ?咖培 丘面, 删 嘶. 锄铀? 叩嘴 加 墙蚵 锄 五渤 加 ..?】?岷 叩 伽叩痂砌 , ,耐 删鲥 嘶.加. 钮 掣 伽痂 孕 孕锄孕. 锄 伽 印 啦眦鲫 删,撕玛 撕 蛳. . 嬲觚盘. 伽 衲印.曲饥曲掣饥 唧她池孕伽 ,掣加 ,黟 .觚觇卿盘。嘣 , 硒 咖锄.托? 一 鳓 锄:哆 冲 】呻 】咖 研 ,.廿咖曲删 唧 池加 , , 自 ?, 璐: 掣. 吼掣 班锄. 一 锄 衲 峨哦嫩删够 代 抽 耐 凹...?.硅;淑呷伽叩培 ?锄 锄 ? ,掣 ,掣. 掣硼 坞弛 勰蚍如 蛐丘锄..也】舢 漱 他咂觚锄 ? 傩咖砌鲈岬 ‘“锄如咖, 尔,: 盹’ ,埘 锄. 英文摘要 : 韶衄蛾 彘 吐怆 位壬‖/ 嘶锄 ‘ . 锄酉 心删锄 仃 曲删 麟妇 删班/ 觚觚 嬲 啪 硒 啾呻 姗蹴? 鹏啪趾 鹳 姗 】嗍蛐印叩 . 孙鸿硒也 【坞锻 腩 啪 印矗觚 印幻 百 耐 锄 粼掰仃撕衄 “龇. 刊啪加栅锄 ?:髓而;讯 ;撕 ;啪; 钒;密他;惦研究论文 苯巴比妥对大鼠额叶、顶叶及小脑神元 和神经胶质细胞凋亡的影响 前 言 由于经口服吸收后作用于全身各个系统,并且在脑组织中浓度最 高,在给患者带来福音的同时不可避免的产生一些副作用。研究发现长期 应用可出现神经系统不良反应,如睡眠紊乱、步态不稳、共济失调、 眼球震颤、眼肌麻痹、上睑下垂等慢性中毒症状。在儿童中可引起兴奋、 激动、攻击行为、注意力不集中等表现,在有脑损害或精神发育迟缓的儿 童尤为常见。有少数老年人服用可引起兴奋,表现为不安、精神错乱、谵 妄、头痛等。动物实验研究大多观察苯巴比妥对幼鼠颞叶或海马区神经细 胞的作用,虽然观察对象、用药剂量、持续时间及观察指标不同,但都得 出一致的结论,即苯巴比妥对幼鼠脑发育有损害作用。本课题主要研究其 中枢神经系统不良反应,用苯巴比妥给正常大鼠灌胃,用?姨原位末端 标记法检测大鼠额叶、顶叶及小脑神经元和神经胶质细胞凋亡,应用免疫 组化法检测大鼠额叶、顶叶及小脑神经元和神经胶质细胞和.表 达的变化,来判断这些结构变化跟不良反应之间的关系。 材料与方法 材料 .动物 健康雄性日龄髓大鼠只体重圭,由河北 医科大学实验动物中心提供许可证号:?“冀..,合格证编 号为:】,分笼饲养于动物房内,每笼只,自然昼夜,环境温 度?。换气扇通风,饲料喂养,自由进食、水。定期打扫卫生, 每周更换三次垫料,保持饲养室通风良好、空气新鲜,使饲养室环境条件 达到国家标准的规定要求。 .试剂及药物研究论文 生理盐水 石家庄市第四制药集团 磷酸二氢钠 天津化学试剂三厂 磷酸氢二钠 天津化学试剂三厂 氯化钠 天津化学试剂三厂 多聚甲醛 天津化学试剂三厂 二甲苯 天津化学试剂三厂 乙醇 天津化学试剂三厂 石蜡 天津化学试剂三厂 柠檬酸 天津化学试剂三厂 柠檬酸三钠 天津化学试剂三厂 双氧水 天津化学试剂三厂 兔抗鼠.及觚多 武汉博士德生物有限 克隆抗体稀释液 公司 弧.腿试剂盒 美国删公司 北京中山生物技术有限公司 大鼠试剂盒 .显色试剂盒 北京中山生物技术有限公司 苯巴比妥 上海新亚药业有限公司 生产批号: .仪器 电子分析天平 瑞士砸嘎 型 石蜡切片机 德国莱卡砌舵 型 快速恒温水箱 湖北黄石市医疗器械厂 电热恒温鼓风干燥箱 湖北黄石市医疗器械厂 光学显微镜 德国姗,?蝴 数码照相机 日本?溺型 多功能彩色细胞图像分析系统美国 灿酣公司 .主要试剂及溶液配置 研究论文 .. . %多聚甲醛 调整衅..“ 吼? . 二?二 多聚甲醛 魄 蒸馏水 .. . 液的配置 调整值. 。 . 肿。 . 二?工二 蒸馏水 .. . 缓冲液 调整值. 龇’ . 。 . 蒸馏水 氯化钠 .. 抗原修复液的配置 调整值. 柠檬酸 . 柠檬酸三钠 . 蒸馏水 .. ‘酶反应液的配置 ?廿 伍毒 ,皿 四, 止 .. 终止液工作液的配置 脓 加 蒸馏水 .. .显色液 ?心反应显色试剂盒,“. 中加入、、液各一 滴,混匀即可。 实验方法 研究论文 .实验动物分组 采用随机数字表法,按完全随机分组方法,将清洁级健康雄性周 龄大鼠只,随机分为组,每组只 组:生理盐水组,生理盐水以叫/给大鼠灌胃,分为两个亚 组,分别于灌胃满天和天时各处死只取脑; 组:治疗剂量短程组,以嘶班鲋给大鼠灌胃,灌胃天时处 死取脑; 组:治疗剂量长程组,以拶『星归给大鼠灌胃,灌胃天时处 死取脑; 组:高剂量短程组,以艄给大鼠灌胃,灌胃天时处死 取脑; 组:高剂量长程组,以划给大鼠灌胃,灌胃天时处死 取脑; .药物干预: 将苯巴比妥片研磨后用生理盐水溶解,以鲫叫的剂量对、 组大鼠进行灌胃,以删的剂量对、组大鼠进行灌胃,组则 以州鲋生理盐水灌胃。此工作均于每天的上午:.:完成。 .动物处死和标本的制备: 分别于喂药满天和天时,对组大鼠分别制备: 取材:以%的水合氯醛/沁腹腔注射麻醉动物,称重后固 定于架台上,剪开左下侧胸腔,剥离出心尖及右心耳,以注射器针头 由心尖部进入升主动脉,剪开右心耳,同时打开液器,以“生理盐水 全速冲洗,继之以糊多聚甲醛磷酸盐缓冲液?,.先快分 钟、后慢.小时缓慢灌注固定,带鼠颈鼠尾尖变硬后断头取脑。 固定:将变硬的脑组织放入%多聚甲醛溶液溶液中固定小时至 周,然后彻底冲洗,除去固定液。 脱水:将脑组织依次经过%乙醇小时,%乙醇小时,%乙 醇小时,%乙醇过夜,%乙醇 .小时,%乙醇?.小时。 透明:脑组织依次经过二甲苯即酒精:二甲苯为:的混合物 ,在第二次透明时进行持续观察,以便掌握合适的透明程度。 浸蜡:脑组织放入.?石蜡液中,在蜡盒内约放置?小时,以研究论文 便石蜡浸入脑组织,利于组织固定,便于切片。 翰包埋:用加温的镊子轻轻将组织块放入蜡槽中,并放入对应的标 记纸条,包埋温度不宜过高,以防烫伤组织块,包埋温度与组织块温度相 近,同时防止其凝固。 修块:蜡块稍凝固后,可去除蜡槽,将蜡移入冰箱或冷水中速凝 固待蜡块完全凝固尚未变硬时进行修块,石蜡边缘距组织.,以利于 切片。 切片: 将修好的蜡块固定于切片机上,切成岬的连续切片,放 入恒温水浴箱中,以?水温使切片平展后,多聚赖氨酸处理过的载玻片 捞起切片。 干燥:将载玻片放入干燥箱内小时后即可使用。 .免疫组化染色步骤: 石蜡切片常规脱蜡至水:二甲苯嘶×次,%、%乙醇各 】血×次,%、%乙醇各妇×次 放入蒸馏水 %室温孵育妇,消除内源性过氧化物酶的活性。 .冲洗,×次 加抗原修复液,放入微波炉加热,使容器内液体温度保持在 ??之间,并持续约血。取出容器,室温冷却,浸泡 加。 %正常山羊血清稀释封闭,室温孵育蛐。清去血清、 勿洗,低价适当比例稀释的一抗 :,戤:,?过夜。 冲洗,×次。 滴加试剂黄色液体,室温或?孵育.血。 冲洗,×次。 滴加试剂橙色液体,室温或?孵育.山。 冲洗,×次。 每张切片加滴新鲜配制溶液,显微镜下观察 . 自来水冲洗,苏木紫复染。 流水冲洗,酒精脱水,二甲苯透明。研究论文 树胶封片,观察结果。 .,腿.法操作步骤如下: 二甲苯脱蜡后梯度酒精水化步骤同免疫组化法 冲洗,×次 在湿盒内加蛋白酶,室温孵育.血 冲洗,血×次 蚴瞰室温孵育晚,消除内源性过氧化物酶的活性 冲洗,×次 滴加【腿反应混合液液与液按:混合 盖上盖玻片,置于?湿盒孵育,阴性对照用代替液 移去盖玻片,冲洗,曲×次 滴加正常山羊血清,室温血封闭生物负电荷 甩干后滴加转换剂,?湿盒孵育 冲洗,×次 显色 苏木素复染细胞核 上行梯度酒精脱水,二甲苯透明 树胶封片,观察结果 数据处理 采用.统计分析软件,采用析因检验,值小于检验水 平籼.,统计学上有显著性差异,统计有意义。均数以标准差士 表示。各组均数间两两比较行检验。 结果分析方法 腿:日本娼删型光学显微镜观察大鼠额叶、顶叶及小 脑神经元及神经胶质细胞的改变。 免疫组化:染色结果应用多功能真彩色细胞图像分析管理系统对切片 进行图像分析。所有切片均在同一光强度下、同一放大倍数×下 分析。每例动物额叶、顶叶及小脑测两张切片,随机取个视野,测定每 平方毫米视野内、觚阳性反应细胞数。分析平均阳性反应细胞数, 各组间比较行检验,前后不同时间点比较选用配对检验。研究论文 结 果 结果由于在光镜下有些神经元与神经细胞不能明确的区分,因此在 这里并称为神经细胞。 ,染色光镜下分别观察不同组、不同时间、 不同部位细胞凋亡情况。 组天与天组各脑叶可见少量凋亡细胞,组天时各部位 平均凋亡细胞数量为额叶.士.,顶叶.士.,小脑 .士.;组天时额叶、顶叶、小脑平均凋亡细胞数量为 .士.、.士.、.士.,组间比较额叶、顶叶、小脑 三个部位平均细胞凋亡数量比较.,无统计学意义。 组各脑叶光镜下均可见少量凋亡细胞,各部位平均凋亡细胞数量为 额叶.士.,顶叶.土.,小脑.主.。与组 天亚组相比,额叶、顶叶、小脑三个部位平均细胞凋亡数量比较加., 无统计学意义。 组各脑叶光镜下均可见少量凋亡细胞,组额叶、顶叶、小脑平均 凋亡细胞数量为.士.、.士.、.士.,与组 天亚组相比,各部位间平均细胞凋亡数量比较加.,无统计学意义。 组与组相比,即相同浓度下不同时间对额叶、顶叶、小脑平均凋亡细 胞数量的比较加.,无统计学意义。 组在光镜下各脑叶细胞凋亡数量没有明显增多,额叶、顶叶、小脑 平均凋亡细胞数量为.士.、.士.、.士.,与 组天亚组相比,额叶、顶叶、小脑三个部位平均细胞凋亡数量比较 加.,无统计学意义。与组相比,额叶、顶叶、小脑三个部位平均细 胞凋亡数量比较.,无统计学意义。 组光镜下额叶平均细胞凋亡数量明显增多,为.士.,与 组天亚组相比,额叶平均细胞凋亡数量比较.,有统计学意义; 组与组相比,即不同浓度相同时间对额叶平均细胞凋亡数量的比较 .,有统计学意义;组与组相比,即相同浓度下不同时间对额叶 平均细胞凋亡数量的比较刚.,有统计学意义。组在光镜下顶叶和小 脑平均细胞凋亡数量为.士.、.士.,与组相比,即不 同浓度相同时间对顶叶和小脑平均细胞凋亡数量的比较如.,无统计学 研究论文 意义。组与组相比,即相同浓度下不同时间对顶叶和小脑平均细胞凋 亡数量的比较加.,无统计学意义。 免疫组织化学染色:阳性表达主要出现在细胞核,觚阳性表 达主要在细胞质,阳性细胞呈棕黄色。 组天亚组,额叶平均阳性表达数为.士.,平均 觚阳性表达数为.士.,平均觚/.为.士.;顶叶平 均.阳性表达数为.士,平均戤阳性表达数为 .士.,平均/为.钍.;小脑平均阳性表达 数、平均觚阳性表达数位和平均觚/.分别为.士.、 .士.、.士.。 组天亚组,额叶平均.阳性表达数、平均觚阳性表达数 位和平均懿/比值分别为.士.、.生.、.士.; 项叶平均、平均觚阳性表达数位和平均锻/为.士.、 .士.、.士.;小脑平均阳性表达数、平均【阳性 表达数位和平均双/比值分别为.士.、.士.、 .士.;与组天亚组相比,各脑叶平均.阳性表达数、平 均越阳性表达数位和平均/.比较.,无统计学意义。 组额叶平均.阳性表达数、平均觚阳性表达数位和平均 戤/.比值分别为.士.、.士.、.士.;顶叶平 均阳性表达数、平均觚阳性表达数位和平均戤/.比值分别 为.士.、.士.、.士.;小脑平均.阳性表达 数、平均暇阳性表达数位和平均懿/比值分别为.士.、 .圭.、.钍.。与组天亚组相比,各脑叶平均. 阳性表达数、平均觚阳性表达数位和平均/比较.,无统 计学意义。 组额叶平均阳性表达数、平均双阳性表达数位和平均 戤/.比值分别为.士.、.圭.、.士.;顶叶平 均阳性表达数、平均觚阳性表达数位和平均舣/比值分别 为.士.、.士.、.士.;小脑平均.阳性表达数、 平均双阳性表达数位和平均默/.比值分别为.士.、 .士.、.士.。与组天亚组相比,各脑叶平均 研究论文 阳性表达数、平均阳性表达数位和平均/.比较.,无统 计学意义。组与组相比,即相同浓度不同时间对各脑叶平均.阳 性表达数、平均阳性表达数位和平均/.比较.,无统学 立小, 思义 组额叶平均.阳性表达数、平均阳性表达数位和平均 .士.、 . /.比值分别为 士.、.士.;顶叶平 均.阳性表达数、平均阳性表达数位和平均/.比值分别 为.士. 、.士.、.士.;小脑平均.阳性表达 .士.、.士.。与组天亚组相比,各脑叶平均. 阳性表达数、平均阳性表达数位和平均/.比较.,无统 计学意义。与组相比,即不同浓度相同时间对各脑叶平均.阳性表 达数、平均阳性表达数位和平均/.比较.,无统计学意 义。 组额叶平均.阳性表达数、平均阳性表达数位和平均 /.比值分别为.士.、.士.、.士.。顶叶平 均.阳性表达数、平均阳性表达数位和平均/.比值分别 为.?.、.士.、.士.;小脑平均.阳性表达数、 、 平均阳性表达数位和平均/.分别为.士. .士.、.士.。 组与组天亚组额叶比较,平均默 阳性表达数位和平均/?比较.;组与组即不同浓度相同 时间对额叶平均阳性表达数位和平均/.比较.;组与 组即相同浓度不同时间对额叶平均阳性表达数位和平均刹比较 .。组与组天亚组额叶比较,额叶平均.阳性表达数比 较.,无统计学意义;组与组即不同浓度相同时间对额叶平均 .阳性表达数比较.,无统计学意义。组与组即相同浓度不 同时间平均.阳性表达数比较.,无统计学意义。组与组 天亚组顶叶、小脑比较,平均.阳性表达数、平均阳性表达 数位和平均/.比较.,无统计学意义;与组顶叶、小脑比 较,平均.阳性表达数、平均阳性表达数位和平均/.比 较.,无统计学意义;与组项叶、小脑比较,平均.、平均 阳性表达数位和平均/.比较.,无统计学意义。研究论文 ???????????????????????????????????????????????一一 附 图 墨一暑。卫,暑?重奠墨一?卜爱圣 觚咖 删谢 蜘仃删鲫 暑工一鼻?暑卫 童冀五一 . 皇 ?脒釉姗撕削毗触骶咖肿研究论文 量一暮互工,鸯暑?昌己.曩 啪 .涨粕?腿 缸 触恤删鲈唧 童卫一墨重工盖,:? ? 锄觚/ . 删池蜘慨删鲫呻 研究论文 量 霎 三 耋 耋 觚觚/一 耐砌、袖融哪骶缸印 重 量 呈 仝 量 重 璩锄拭【/ 朗?啪砌妇白删?翻啪阻鲫研究论文呦 .曲 肋 腑 撕×啦 【哟 .曲 . 舭 酣‖铽× , 一 一 .、 、、. ,二‘暴。 。 ,? ? . 一一矿 , 。. 幽 ?. ,。 。 焉一‘曩铲 ,,.毒褥 :: 黟 一乙广 .、、‖ .. .,譬 . . ? , ? , 一 一汰 , ; 巴 哆 ?. .? ?? ? 矿’ :露 , ?? ? , ’曩 。..椿‘ 哆。。.? 。 ? ,,誓 簟 建叠. . 曲 .士. 天 .士. .生. /【/ .士. .士. 天 .士. 哦啦/ .士. .士. .士. 哑班酣天 研究论文 毹 蜘讹缸 玳 彘妣西。璐个/眦 ,. 、, 磁研究论文。 ???????????????????????????????????????????????????一一 ’’彘 岱猢讹恤 龇托 批. ?????????????????????????????????????????????????一一一啪 撕 ??????????????????????????????????????????????????一 .士. 天 .士. .钍. .士. 天 .士. .士.. 天 士. /【;厂 .士. .士. 天 .士. 佃班 .士. .圭. 天 .士. 岁?/ .钍. .士. 划天.?. .?. .?. ??????????????????????????????????????????????一一 .唧躺、析砌班呷研究论文 ’’职锄 虢蜕触骶删恤印 册西 艉啪蛐代西个/‰ 撕 天 .士. .士. .士. 天 .士. .仳. .士. 天 .士.“ .士. 理啦, .士. 天 .士. 蟮啦/ .士. .士. 天 .士. /】崦/ .士. .?. 天 .士.丫 哦啦/ .士舯 .士. ????????????????????????????????????????????????????一一一 .唧跚曲础鲈研究论文 讨 论 细胞凋亡是在一定的生理或病理条件下,触发细胞内预存的死亡程序 而导致的细胞生理性死亡。凋亡细胞的特点是质膜发泡、核固缩、染色质 凝集及凋亡小体形成。细胞凋亡大致可分为凋亡信号转导、凋亡基因激活、 凋亡的执行和凋亡细胞清除四个阶段。 细胞凋亡有内源性和外源性信号通路,分别由线粒体和死亡受体介导 【】。线粒体通路是指细胞在应激或受到凋亡诱导信号作用时,线粒体内外 膜之间通透性转运孔伽脚埘璐 赡瑚盯开 放,导致线粒体膜的通透性增加、线粒体肿胀、线粒体内膜跨膜电位下降, 凋亡启动因子细胞色素被释放到胞浆中,在的协同作用下,细 胞色素与凋亡蛋白激活因子.柞结合并使之活化。后者经其 辩结构域与锻前体结合,导致自身剪切和活化。 活化的舔弱.激活其下游的瓣,后者活化后引发一系列酶促反 应最终导致细胞凋亡。死亡受体通过与相应配体结合,通过其胞浆内的死 亡结构域传递细胞凋亡信号。最终这两个通路都激活嬲,后者进 一步激活核酸内切酶,导致染色质浓缩和细胞骨架重组,最终导致凋亡小 体形成,这也是烈,阳性细胞的形成过程。 由于细胞凋亡与体内许多病理生理过程密切相关,近年来受到生物医 学领域的广泛关注。在研究中选择合适的检测方法至关重要。目前常用的 检测方法有如下几种川: 形态学观察:普通光镜可以观察到细胞凋亡的大体形态,而透射电 镜可以清楚地观察到细胞结构在凋亡不同时期的变化。但是它只能定性, 不能定量。 流式细胞技术:是目前常用的凋亡定量分析方法,它通过形态学检 测可以检出凋亡细胞的百分比,它还可以同时检测细胞表面标志物以明确 发生凋亡的细胞种类。但是它不能检测出早期凋亡,敏感性和特异性较差, 一些坏死的细胞碎片可在二倍体前形成亚峰导致误检口 降解的产物检测细胞凋亡:?矾腿法:此法特异性敏感性 强,能够定量凋亡细胞和动态观察凋亡细胞超微结构变化。袁永辉等阎 对肘,法进行改进,使凋亡细胞核显示为棕黄色,正常细胞核为蓝色,研究论 文 对比更明显,敏感性和特异性显著提高。?酶联免疫吸附法:此法灵敏度 高,适合单一细胞成分的检测。?凝胶电泳:抽提细胞的呲确定 样品中呵的量和纯度,然后在琼脂糖凝胶上电泳。此法适用于体外培养 的非增殖性细胞的检测。 凋亡调控基因或其表达产物的分析检测细胞凋亡:细胞凋亡是一个 受细胞内多种基因调控的严密的程序性进程。目前研究较多的基因有 .家族、嬲基因、、嬲等,检测它们或其表达产物也是检测 细胞凋亡的一种常用方法。可以用免疫组化方法、流式细胞分析技术、免 疫印记技术、、赆等方法检测这些基因或蛋白】。 细胞凋亡相关酶学分析:目前研究较多的是唧缴.的活化。通 常獬.以非活性形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段被激活。活 化的嬲又活化其它螂缴酶和多种胞浆内成分和核内成分【姗, 它们可裂解相应的胞浆、胞核底物,最终导致细胞凋亡【】。因此, 常被用作早期细胞凋亡的指标。通过对?.活性的测定可以了解细 胞凋亡的程度和时间。 本实验采用改进的烈,法和检测觚和的表达产物的方法 检测细胞凋亡,从形态学和分子生物学两方面来印证长期应用苯巴比妥可 以引起细胞凋亡增加。 对于的中枢神经系统不良反应研究最多的就是它对认知的影响。 国内外学者对此做了大量的研究。鼬啾呦等【】对单独应用的名 患儿随访了.年,发现对患儿的认知功能尤其是语言表达可能产生 长期的不良影响。等【】对发作完全控制的儿童撤药前后的认知 功能比较发现,撤药后有明显改善,说明对儿童的认知功能影响 较大。等【刀通过对名健康志愿者的一个随机双盲不完全区组交 叉对照试验发现,、苯妥英钠四、丙戊酸钠?’均造成认知损害, 但对认知影响最大。也有一些研列摊”结果表明苯巴比妥对认知没有 影响。关于苯巴比妥对认知的影响各家报道不一,这是由于认知与癫痫发 作类型、起病年龄、发作频率、病程,抗癫痫药物、家庭及社会因素等多 种因素有关【】,并且与采用的神经心理测试和神经电生理检查方法、样本 量及观察时间不同有关。 单一药物因素是否引起认知或其他神经功能障碍由于伦理学的原因研究论 文 很少进行临床实验。于是人们转向从动物实验中寻求是否引起认知相 关结构形态学和分子生物学的变化。踟等【】对生后天幼鼠一次性 腹腔注射 ,一周后发现脑重量较正常对照组轻。同时发现 / 生后~天幼鼠应用 /,小时以上可引起神经细胞明显 过度凋亡,且呈剂量依赖关系。他们还发现导致神经细胞两大生存促 进途径的重要因子:胞外信号调节激酶哪/和蛋白激酶脚磷 酸化水平降低,同时抑制脑源性神经营养因子、神经营养因子、等多 种生物因子的合成,造成了神经保护和破坏间内环境的不平衡,促发过度 凋亡过程。&湖等 】通过对幼鼠长期使用,发现可引起脑内 受体、运载体和合成酶亚型永久性改变。. 等【对幼鼠连续注射删,共,发现通过干扰海马胆 碱能神经传递来阻止蛋白激酶研脚的激活,从而导致大鼠认知损 害。吴晔等【】对天鼠用 删灌胃,共天,发现其学习记 忆能力受损,并推测是由于叠研的激活受阻引起的。朱海霞等【】对生后 天和个月的大鼠用苯巴比妥吲醚舶灌胃,分为周短程和周长 程给药组,发现幼鼠长期应用苯巴比妥可以引起脑组织重量的下降,血清 神经元特异性烯醇化酶浓度升高,在海马和额叶可以观察到明显的神经退 行性变、神经元坏死和神经元数量的减少,额叶戤蛋白表达增高,. 蛋白没有明显变化,阳性细胞也明显增加,短期应用苯巴比妥的 幼鼠与对照组没有差别。成年大鼠无论短程还是长程用药都与对照组无差 别。后续的研究发现即使停药周后,组依然存在胞体肿胀、核染色 质碎裂溶解等超微结构异常,提示引起的幼鼠脑损伤存在不易恢复的 可能性田】。等【】研究发现苯巴比妥抑制幼鼠海马齿状回神经元 的增殖,这种抑制作用可以持续到停药后很长时间,并推测是通过提高 介导的抑制作用来实现的。 之前的研究大多数是针对幼鼠进行的,基本上都得出损害幼鼠脑 的发育,并引起认知损害。成年大鼠长期应用是否会引起脑损害,若 出现脑损害是由何种机制引起,与剂量及时间是否有关还没有系统的研 究。 本实验应用给正常大鼠灌胃,参考朱海霞等的剂量标准,分别给 予玎瑁嗵徊和划,在喂药满天和天时处死动物,采用免研究论文 疫组化的方法观察大鼠额叶、项叶及小脑神经元和神经胶质细胞和 觚蛋白的阳性表达,用改进的腿法检测相应部位凋亡细胞的形态 和数量。?脯,法显示高剂量长程用药组大鼠额叶可见大量棕黄色细胞, 余各组各脑区阳性细胞数量较少,说明长期使用治疗剂量的对成年大 鼠脑细胞凋亡没有影响,这同朱海霞瞄】等的研究一致。而长期使用高剂量 的可以引起大鼠额叶细胞凋亡明显增多,这可能与大鼠产生的行为异 常或认知功能减退有关。提示临床长期应用较大剂量引起的神经精神 症状可能与额叶受损有关。免疫组化法显示长期使用高剂量的可以引 起大鼠额叶觚表达明显增多,而.表达与生理盐水组相比没有明显 差别。余各组各脑区.、戤均少量表达,与生理盐水组相比没有明 显差别。推测长期应用较高剂量可能通过提戤的表达促进细胞凋亡 的发生。 戤是家族重要的成员之一,关于基因家族在细胞凋亡 过程中的作用机制目前研究已比较深入。有研究表明.基因家族在内 源性细胞凋亡的调控过程中具有重要作用湖。根据结构与功能不同,分为 三个亚组:?抗凋亡亚族,包括.、嗣、.、.、越、; ?含多区域的促凋亡亚族,包括觚、【、啜、;?仅含 同源区区区域的促凋亡亚族,包括【、、、洫、 等,它们分别可以表达相应的促凋亡或抑制凋亡蛋白。 基因家族表达蛋白自身或彼此之间有形成二聚体或多聚体的能 力,它们通过这种二聚体反应调节细胞死亡和存活信号的平衡状态,是决 定细胞存亡的关键嘲。目前研究比较明确的有表达蛋白有嗣、憾、 、戤。一【、一与.姐通过与促凋亡蛋白形成异源二聚体来 阻止细胞凋亡的发生;而默则通过形成同源二聚体而诱导凋亡发生。 当一蛋白表达增多时,觚二聚体分开,与形成比觚同源二 聚体更稳定的异源二聚体;而懒则优先与形成异源二聚体,使 觚能够形成同源二聚体而诱导细胞凋亡的发生。 研究发现,./戤比值的高低决定细胞在受到凋亡信号刺激后是 否发生凋亡,./双比例高,细胞存活率高,./敲比值低,凋亡 发生率高【捌。反之,觚/越高,凋亡发生率越高。本实验结果显 示长期使用高剂量组大鼠额叶戤蛋白明显增多,/.比值研究论文 ...明显高于生理盐水组...、正常剂量组...和 高剂量短程治疗组...,细胞凋亡增加也明显增多..,而 生理盐水组细胞凋亡数...、治疗剂量组细胞凋亡数 ...与高级量短程治疗组.. .之间没有明显差别。 与神经细胞凋亡: 年】等首次证实基因可以在也.缺乏时延长细胞寿命, 而对细胞的增殖没有影响。以后发现.蛋白的生理功能主要是抑制细 胞凋亡,延长细胞寿命,而不影响细胞周期和分化。.蛋白广泛分布 于核膜、内质网膜、线粒体外膜上,通过调节线粒体通透性转变孔伊 的开放,阻止细胞色素及其他促凋亡蛋白释放到线粒体膜外,从而抑 制?激活及细胞凋亡发生网。此外,.蛋白还可能通过以下途 径抑制细胞凋亡【】:?.蛋白通过直接或间接影响内质网内的 外流而抑制细胞凋亡;?在抑制细胞色素激活躐途径的同时也抑 制了与其相伴的氧化还原信号,减少了活性氧和自由基的产生,通过抗氧 化作用和抑制自由基产生来抑制细胞凋亡;?.蛋白可能参与核转运 过程,它可以改变和及勉细胞周期调节蛋白的核浆转运, 蛋白与细胞色素协同封闭进入核内,从而阻断诱导的凋 亡和生长停止;?蛋白通过和觚等促凋亡基因表达蛋白形成异源 二聚体,从而维持线粒体跨膜电位的稳定;?还可以与啦结合, 阻断细胞色素、印啦和.前体组成的“凋亡体力的形成, 从而阻止?引发一系列级联反应。 叛与神经细胞凋亡: 酝蛋白通常以非活性形式分布于胞浆或细胞骨架上,当细胞受到凋 亡信号刺激时,发生构象变化,从胞浆转位至细胞器膜结构上,并与膜上 的一蛋白形成异源二聚体,使抗凋亡蛋白丧失抑制细胞凋亡的作用, 引起细胞器功能丧失和多种促凋亡因子的释放,最终导致细胞凋亡【。同 时它也能形成同源二聚体,在线粒体膜上形成足以使细胞色素释放的 通道,细胞色素从线粒体进入胞浆后,使印啦与.分离,在皿? 的作用下,激活?畔酶原,??嬲.切割激活删.,后者和 其它的蚀弱懿家族成员通过分解各种蛋白而促进细胞凋亡【。戤是 畔活化的重要调节因子【,通过增加唧缴活性而导致细胞凋亡。研究论文 也有研究认为在细胞色素作用后,使线粒体功能发生障碍,电子 传递链不能传递给氧,活性氧增加,而活性氧的毒性作用促使细胞死亡。 既往研究发现癫痫大鼠应用后可引起颞叶.阳性表达细胞数 增多,本实验结果显示应用后.阳性表达细胞数没有明显的变化, 提示它可能通过抑制癫痫发作提高.表达从而发挥神经保护作用。本 实验发现长程高剂量应用后可引起大鼠额叶表达增高,它通过多 种途径活化.,最终引起细胞凋亡。而应用的各组大鼠均未出 现额叶和项叶细胞凋亡的明显增多和.、表达明显增高,提示 对项叶和小脑没有明显的影响。 额叶是高级智能中枢,与运动及高级精神活动有关,此外它还通过额 桥小脑束与小脑相连,推测临床出现的步态不稳、共济失调、兴奋、精神 错乱、注意力不集中等神经精神症状与长期高剂量应用后引起的额叶 细胞凋亡增多有关,而治疗剂量的一般不引起明显的损害。 结 论 治疗剂量的对大鼠额叶、顶叶、小脑神经元及神经胶质胞的凋亡无 明显影响。 长时间应用高剂量的使大鼠额叶蛋白表达明显增高,额叶神经 元和神经胶质细胞凋亡增加,提示可能通过增加的表达引起细 胞凋亡。 长时间应用高剂量的对大鼠顶叶、小脑神经元和神经胶质细胞的凋 亡无明显影响。 参考文献 王辰苯巴比妥的临床新用途.中国社区医生.,: , , ,血 .印 . . ,:? . , ,? , 叩研究论文 鹤嬲 :咀也 如 吼“雄惦:髓 ?砖 叽四. ,,: 、玎舱 . ? .小 ?也 日 础【. ? ,: 峨邪 .帑 ,锄盯.钿: ‘ : 印阴. ,钙, .撇 ,, 唧托 嘶 妇加姗 山嘧 明. ,,: 赵利红,崔利德,李陈莉.细胞凋亡的检测方法.河北医药,, : 袁永辉,吴人亮,王曦,等.原位细胞凋亡.胍法的改进及其应用.陕 西医学杂志,,:? 矫毓娟,刘江,许贤豪.中国神经免疫学和神经病学杂志 ,:? , . , 瑚印:托弱 鼬, 钺;瓣,砸 一闷日 阳?懈一’珂昏舶,? .屯圮,锄 星叽疵? ,,:璐 “础肿从.?勰他白 印 阴.卿:时似,,:? 印 础瞄舱 绷,锄 ,酊.如 虢 洫沏. 缸驰:缸 , 鲥 ,:出恤 您? ’? , ,回憾 .湖枷 肌而 鲫嘣? 印 【】.印斌印掣,,: ,鼬舢豫,贸 .伽哪瞅撒、, 呻 觚 琵坞铋:印面 协翰舡圮 .萨龇毗把 ?切 印.锄,: 研究论文 , .锄优伽咀臼 锄 勰 嗽 . 勰?豁删时脚抽黼凼脚印印 觚 ,:? 刘娟,高丽?童癫痫认知障碍研究进展.实用诊断与治疗杂志,, :. 毹 ?,耐 舱,瓯.蜀慨 啦 觚 . 砷砌, 铋如, 砌舯咖 也 套甄,:? , 砸觚,脚,佩 .加印印由铲觚妇.八 觑即船 圯 一 ,: 坞 ,.彻却姗梵 妇印锄 锄 朗【而臼翰加瑚 叠 蛐坞协幅, 饥咄;瑙锄百伽血? 时碍?.咖?,, : 就 ‘籼,【 , .觚 懿锄托纳? 丘 舭 鹋晒 耐 懿 蜘掀妇.池?,,: 吴晔,王丽.抗癫痫药对未成年大鼠空间变换学习记忆及脑内蛋白激 酶的影响.北京大学学报医学版,,:. 朱海霞,蔡方成,张晓萍.长程服用苯巴比妥、氯硝安定、丙戊酸和 托吡酯对未成熟脑发育影响的实验研究.中华儿科杂志,: 一 朱海霞,蔡方成,张晓萍.治疗血浓度下抗癫痫药对未成熟脑发育 影响的实验研究.中华神经科杂志,,:. 咄 册 .刮乏 刎嵫卿跹, 枷瞳? 跚陀鹳臼饿栅.毽铋骼. 硼埘,,.: . ? 危 巧,: 屹血:聆砒鹏 融阴.砒 %,:? 邵胜敏,王小同..基因家族在中枢神经系统中的作用.医学综述。研究论文 ,【: 也 哪 ‰.础哪 堍 坛妇田.螂 ,: 、 .一 咖鹋 . ,姗, 丽也 铡舰 . ,觚,缸 ?伊瞰髓 ,:? 融 ,融 .髓 , 叩田., : .也啪崛眦 咖沁概 胁 舭忡川. .,,:? 卿辰,丁健.一基因家族在调节细胞凋亡中的作用.国外医学分子生物学分 册,,: ,吼越.唧鹤印掣,鹏试锄 ? 蠲醪叨啪臼铷蛐岛, : 缸硼 甜. 舭 】一卵 邪争 枷: 锣伽叠 一印。咖 哪。璐.仞 ,,: 解, , .铋 啪?溺? ?耐印叩】崎 跚砌删弧 锄】 鲫舢,,:.