[DOC] 兔肺静脉肌袖心肌细胞动作电位的特性

[DOC] 兔肺静脉肌袖心肌细胞动作电位的特性 兔肺静脉肌袖心肌细胞动作电位的特性 中国心脏起搏与心电生理杂志2oo6年第20卷第4期?349? 兔肺静脉肌袖心肌细胞动作电位的特性 丁怀玉杨新春刘秀兰鲍荣凤刘泰楗 [摘要]目的研究兔肺静脉肌袖心肌细胞(PVC)动作电位的特性,并与左房心肌细胞(LAC)进行比较.方法 采用全细胞膜片钳技术,进行电流钳制.用800pA×8ms的刺激脉冲连续刺激5次,刺激间隔为1s.引出并记录 动作电位.结果PVC动作电位的幅度与LAC的无显着性差异,但前者具有较长的平台期,因而,动作电位时程 (APD)较LAC的明显延长,并可以诱发出延迟后除极(DAD).另外,PVC与LAC的动作电位均具有刺激次数依赖 性,但前者更加明显.在APD延长的基础上,PVC可诱发出第二平台反应,表明其具有产生EAD的明显倾向.结 论触发活动可能在肺静脉肌袖致心律失常机制中起重要作用. [关键词]电生理学;兔;肺静脉肌袖心肌细胞;动作电位;触发性活动 中图分类号R331.38文献标识码A文章编号1007—2659(2006)04—0349—03 Characteristicsofactionpotentialinrabbitpulmonaryveincadiomyocytes.D INGHuai-yu,YANGXin—chun,LIU Xiu.1an,BAORong.feng,LIUTai—feng.1InstituteofCardiology,BeringC haoyangHospitalAffiliatedtotheCapitalUni— versityofMedicalSciences,Beijing100020,China;2StateLaboratoryofBiomembraneandMembraneTechnology,College ofLifeSciences,PekingUniversity,Bering100871,China Correspondingauthor:YANGXin-Chun [Abstract]0bjectiveToinvestigatethecharacteristicsofactionpotentialinrabbitpulmonaryveincadiomyocytes (PVC),andtocomparethemwiththoseinleftatrialcadiomyocytes(LAC).MethodsThewhole—cellpatchclamp withcurrentclampwasused.ResultsPVChadsimilaractionpotentialaltitude(APA)withLAC,buthadgreateraction potentialduration(APD)andgreaterplateauphasethanLAC.Inaddition,delayedafterdepolarization(DAD)couldbein- ducedinPVC,butcouldnotinLAC.ThereWasstimulatingtimes—dependen ceofprolongationofAPDinbothPVCand LAC,butthatintheformerWasmoresignificantthaninthelatter.OnthebasisofprolongedAPDinPVC,thesecond plateauresponsecouldbeinducedveryeasily,showingthereWasastrongtendencyofEADgenesisinPVC.Conclusion Thetriggeractivitymightplayanimportantroleinthearrhythmogenisinpulmonaryveinmusclesleeves.[ChineseJor. halofCardiacPacingandElectrophysiology,2006,20(4):349,351] [Keywords]Electrophysiology;Rabbit;Cardiomyocyteinpulmonaryvein musclesleeves;Actionpotential;Triggeractivity 近来的研究表明,肺静脉肌袖心肌细胞(PVC) 的电活动在心房颤动(简称房颤)的发生机制中起 重要作用?.然而目前对肺静脉肌袖的电生理学 研究主要集中在狗PVC的观察,而且已有的研究结 论并不一致J.考虑到家兔心房在某些方面,更 接近人的心房,本研究以兔心为对象,通过急性酶解 的方法获得兔单个PVC,采用全细胞膜片钳技术研 究PVC动作电位的特性并与左房心肌细胞(LAC) 进行比较. 作者单位:l首都医科大学附属北京朝阳医院心脏中心(北京 100020) 2北京大学生命科学学院生物膜与膜工程国家重点实验室 作者简介:丁怀玉(1979一),男(汉族),山东青岛人,硕士研究生,主 要研究方向为心律失常. 通讯作者:杨新春 1材料与方法 1.1单个心肌细胞的分离健康成年新西兰白兔,购自北 京大学医学部动物实验中心,体重2—3kg,雌雄不拘,耳缘 静脉注射肝素(500IU/kg)抗凝,并用乌拉坦(750mg/kg)静 脉麻醉,迅速开胸,取心脏及肺组织,将分离的心脏在37? 恒温和持续通氧条件下行Langendorff逆行灌流,先用无钙台 氏液灌流6—8min,再用酶液灌流8min.心脏灌流滴速为 7ml/min,灌流压为70cmH:O.至心脏柔软膨大后,分离并 剪取肺静脉自心房入口至远端血管组织,左房组织,剪碎并 放入上述酶液中.37?条件下温孵,搅拌,每隔5min取细 胞悬液置于显微镜下观察,在细胞数量与质量均较佳时收集 细胞悬液,放入KB液中4?下保存备用. 1.2膜片钳制全细胞动作电位的记录按Hamill等方 法进行膜片钳制全细胞记录.将细胞悬液滴于倒置显微镜 工作台上的灌流槽中,静置10rain后,以细胞外灌流液持续 灌流.灌流速度为1—1.5ml/min.所有实验均在室温(24 ? 350?兔肺静脉肌袖心肌细胞动作电位的特性 , 27?)下进行.选择边缘整齐,表面无颗粒,横纹清晰,无 收缩的细胞,利用三维式液压微操纵器移动电极,使之贴近 细胞.电极尖端与细胞接触后,通过负压吸引形成高阻抗封 接(R?1Gn),然后加大负压吸破细胞膜,使电极内液与细 胞内液相通,形成全细胞模式.进行快,慢电容补偿和串联 补偿,以减少瞬时充放电电流和钳位误差.电极内液与细胞 内液平衡3,5min后,用800pA×8ms的刺激脉冲连续刺 激5次,刺激间隔为1S.引出并记录动作电位.脉冲信号由 Pulse+Pulsefit8.31软件控制,经EPC-9放大器(HekaElec— tronicCo.德国)放大后通过Ag.Agcl电极丝和充填电极内液 的玻璃微电极导入细胞,产生的电流信号经EPC.9放大器转 换并存储于计算机硬盘中,供测量及分析用. 硬质玻璃毛坯(直径为1.6mm),经微电极拉制仪(PB一 7型,日本)两步拉制法拉制成尖端直径为1—2m的电极, 充灌电极内液,入水阻抗为2.5—5.5Mn. 1.3溶液与试剂正常台氏液(mmol/L):NaC1136.9, NaHCO311.9,KC15.4,MgC120.53,CaC121.8,Nail2PO4 0.33,HEPES5.0,Glucose10.0,用NaOH将pH调至7.354- 0.05.无钙台氏液:正常台氏液中去除CaC1,.含酶液:无钙 台氏液50ml,胶原酶I35mg,牛磺酸120mg,10mmol/L CaC12200l.KB液(mmol/L):KOH70,谷氨酸50,KC140, ABC 牛磺酸20,KH2PO420,MgC125.0,Glucose10.0,EGTA0.5, pH用KOH调至7.354-0.05.电极内液(mmol/L):KC1 140,Na2ATP2,MgCl21,EGTA10,HEPES5,用KOH将pH 调至7.2.主要试剂:胶原酶(TypeI),羟乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES),乙二醇双四乙酸(EGTA),Na:ATP等均购自Sig— maCo.公司,牛磺酸购自中国医药(集团)上海化学试剂公 司. 1.4统计学处理以单个细胞为统计单位,用SPSS11.5软 件对数据进行统计学分析.计量资料以均数4-标准差表示, 组间比较采用两均数比较的t检验.以P<0.05为差异有 显着性. 2结果 2.1PVC和LAC动作电位LAC的动作电位多呈 三角形,复极较快,只有较短的平台期或无平台期 (图1A).而PVC的动作电位时程(APD)较长,具 有较长的平台期,并且在不同PVC中,平台期的长 短不一(图1B,C,D).PVC的APD较LAC的长(n =10,P均<0.01),而动作电位幅度(APA)两者相 似(n=10,P>0.05),见表1. D 50.0mVl 1?ms 图1家兔LAC和PVC的动作电位A:LAC的动作电位;B,C,D代表不同的PVC的动作电位 表1PVC和LAC的APD及APA的比较(4-S,n=10)A 2.2延迟后除极(DAD)部分PVC(约占3/10), 在连续给予间隔为1S的多次刺激后,可以记录到 DAD现象(图2),而在LAC没有记录到. 图2从家兔PVC上记录的DAD 0mVl 1OOms 2.3PVC和LAC动作电位的刺激次数依赖性在 PVC,当间隔1S以相同的强度连续刺激5次,随刺 激的进行,APD逐渐延长,平台的高度逐渐增加,其 变化远远超过LAC的反应(图3). 2.4PVC的第二平台反应兔LAC在动作电位期 间,当施予另一个刺激时,在一定电位范围内,呈现 ,,5.omvl1?1335 图3以1Hz连续刺激时动作电位逐渐延长A:LACB:PVC 有效不应期,相对不应期.但是,在PVC的动作电 位期间,给予额外刺激时,除了相对不应期外,几乎 没有有效不应期,而代之以第二平台反应,即在平 台上出现去极化发放(图4). 3讨论 在实验中,细胞从分离到记录动作电位经历了 长达数小时的静置过程,细胞膜许多离子通道的生 理状态发生了变化,第一个刺激所记录的动作电位 不能真实地反映细胞的生理特性,研究其特性意义 不大.因此,为了尽可能模拟细胞的生理状态(即 处于不断的兴奋或激动中),本实验在记录动作电 中国心脏起搏与心电生理杂志2006年第2O卷第4期?351? 500mVI 10(3ms 图4兔PVC动作电位的相对不应期和第二平台反应A第 二个刺激落在动作电位恢复以后;B第二个刺激落在动 作电位的相对不应期(1)和落在平台上(2)而出现第二 平台反应 位时,对细胞连续刺激5次,并以第5个刺激所记录 的动作电位为准,进行观察比较.研究发现,不同 PVC的平台期长短不一,可能与其来源于肺静脉的 不同部位有关. 在心律失常的发生中,折返是最常见的机制. 它的异常冲动的产生,是源于传导的异常.这当然 与膜及离子通道,特别是间隙连接的活动异常有密 切的关系.然而,直接由于离子通道活动异常而发 生的心律失常,则以触发活动最为明显,其机制也较 为清楚. EAD是在一个动作电位尚未完全复极时,即在 动作电位的平台期,又出现了新的去极化波.由于 EAD波可以传播,因而可以产生快速心律失常. EAD的诱发因素多种多样,性质不一,如牵张,缺 氧,低温,藜芦碱以及高浓度儿茶酚胺等,均可诱发 EAD.目前,EAD的离子机制已较清楚.凡能延长 APD的因素,即外向电流的抑制及(或)内向电流的 增强均可导致EAD的发生.本实验发现PVC的动 作电位具有较长的平台期,APD较LAC的明显延 长,特别是它们具有第二平台反应,这就显示出强烈 的EAD发生倾向_5.另外,在本实验中,还发现 PVC的动作电位具有明显的刺激次数依赖性,也就 是说随着刺激的增加,APD在原本就较长的基础上 更加延长.在某些特殊的条件下,如体内神经,体液 调节功能发生改变时,就可以诱发EAD,进而可以 引起快速性心律失常的发生.这与既往的研究结果 一 致]. DAD是在动作电位完全复极以后出现的去极 化波.DAD的发生是频率依赖性的,即,频率越快, DAD越易发生.当刺激频率较低时,DAD只表现为 局部电位,而不能传播.而在刺激频率到达一定水 平时,局部电位增高,形成可传播的动作电位,从而 导致心律失常的发生.本实验发现PVC随间隔1S 的刺激的进行,可以诱发出DAD,因此可以推论 DAD在肺静脉肌袖致心律失常机制中起重要作用. 王唏等l8研究发现,兔PVC的I.在某些情况 (如加入异丙肾上腺素)下,可以明显减弱,进而使 得复极减慢,APD延长,钙离子通过L型钙通道内 流增加,同时肌浆网钙释放增多,细胞内钙离子增高 呈时相性波动,促进钠.钙交换,形成内向电流,发生 膜电位震荡,从而可以产生EAD或DAD.这在一 定程度上为本实验研究的结论提供了离子流方面的 基础.另有人对兔上腔静脉肌袖心肌细胞的研究也 得到了类似的结论J. 随着房颤消融研究的深入,有学者提出,房颤可 能存在双重机制,即发生和维持机制,局灶异位兴奋 参与房颤的发生,而多发子波折返参与房颤的维持. 结合本实验研究得出以下推论,在体内神经,体液调 节功能发生改变或某些病理情况下,PVC可以产生 触发活动,形成快速的去极化波,这种异位冲动的发 放可能对房颤的发生与维持起重要作用. 参考文献 1HaissaguerreM,JaisP,ShahDC,eta1.Rightandleftatrialradio— frequencycathetertherapyofparoxysmalatrialfibrillation[J].JCar- diovascElectrophysiol,1996,7:1132 2EhrlichJR,Tae-JoonCha,ZhangLM,eta1.Cellularelectrophysiol— ogyofcainepulmonaryveincardiomyocytes:Actionpotentialandion— iccurrentproperties[J].JPhysiol,2003,551:801 3KhanR,Identifyingandunderstandingtheroleofpulmonaryveinac- tivityinatrialfibrillation[J].CardiovascRes,2004,64:387 4HamillOP,MartyA,NeherE,eta1.Improvedpatchclamptech- niquesforhighresolutioncurrentrecordingfromcellsandcellfree membranepatches[J].PflugersArch,1981,391:85 5LiuTF.Earlyafterdepolarizationinmyoeardiumanditsclinicalim- plicatin[J].MethFinExpClinPharmacol,1992,14:157 6ChenYJ,ChenSA,ChenYC,eta1.ArrhythmogenicactivityofCar- diacmuscleinpulmonaryveinsofthedog:Implicationforthegenesis ofatrialfibrillation[J].CardiovascRes,2000,48:265 7ChenSA,HsiehMH,TaiCT,eta1.Initiationofatrialfibrillationby ectopicbeatsoriginatingfromthepulmonaryveins:Electrophysiologi- calcharacteristics,pharmacologicalresponses,andeffectsofradiofre- quencyablation[J].Circulation,1999,100:1879 8王唏,黄从新,王腾,等.肺静脉肌袖心肌细胞短暂外向钾电流特 性研究[J].中国心脏起搏与心电生理杂志,2002,16(2):116 9谢双伦,黄从新,江洪,等.兔上腔静脉肌袖心肌细胞动作电位及 L型钙电流特征[J].中国心脏起搏与心电生理杂志,2005,19 (5):388 (2005—09—12收稿) (李晓清编辑)