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米非司酮对孕7-9周人胎盘绒毛的影响

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米非司酮对孕7-9周人胎盘绒毛的影响米非司酮对孕7-9周人胎盘绒毛的影响 暨南大学博士学位论文米非司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响 工作单位: 电话: 通讯地址:广州市荔湾区 邮编:510130 目录 中文摘 要……………………………………………………………………………1 英文摘 要……………………………………………………………………………5 前 言…………………………………………………………………………………12 1 米非司酮在早孕药物流产的应用………………………………………… 12 2 前列腺素的合成及表达…………………………………………...
米非司酮对孕7-9周人胎盘绒毛的影响
米非司酮对孕7-9周人胎盘绒毛的影响 暨南大学博士学位米非司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响 工作单位: 电话: 通讯地址:广州市荔湾区 邮编:510130 目录 中文摘 要……………………………………………………………………………1 英文摘 要……………………………………………………………………………5 前 言…………………………………………………………………………………12 1 米非司酮在早孕药物流产的应用………………………………………… 12 2 前列腺素的合成及表达……………………………………………………14 3 氧化/抗氧化平衡状态的评价指标…………………………………………15 4 孕早期胎盘绒毛氧化应激状态及血红素氧合酶-1(HO-1)的抗氧化应激作 用……………………………………………………………………………17 5 胎盘绒毛间质微血管与血管内皮生长因子………………………………206 研究米非司酮对孕 7-9 周人胎盘绒毛影响的目的及意义………………22 7 本课题的主要创新之处……………………………………………………24 参考文献………………………………………………………………………26 第一部分 米非司酮对孕 7-9 周人胎盘绒毛前列腺素合成及表达的影 响……………………………………………………………………………………34 1. 材料与方法………………………………………………………………34 2. 结果 ………………………………………………………………………403. 讨论………………………………………………………………………42参考文献………………………………………………………………………45附图及其简要说明……………………………………………………………47 第二部分 米非司酮对孕 7-9 周人胎盘绒毛氧化/抗氧化平衡的影 响……………………………………………………………………………………52 1. 材料与方法……………………………………………………………… 52 2. 结果………………………………………………………………………57 3. 讨论……………………………………………………………………… 58 暨南大学博士学位论文米非司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响 参考文献………………………………………………………………………60 第三部分 米非司酮对孕 7-9 周人胎盘绒毛 HO-1 表达的影响………………62 1. 材料与方法………………………………………………………………622. 结果………………………………………………………………………703.讨论…………………………………………………………………………72参考文 献……………………………………………………………………74附图及其简要说明…………………………………………………………76 第四部分 米非司酮对孕 7-9 周人胎盘绒毛间质微血管及血管内皮生长因子的 影 响…………………………………………………………………………………79 1. 材料与方法………………………………………………………………802. 结果………………………………………………………………………823. 讨论………………………………………………………………………85参考文献……………………………………………………………………88附图及其简要说明……………………………………………………………90 全文结 论……………………………………………………………………………96 英文缩略词 表………………………………………………………………………98 在读期间发表的文章及参与的课题…………………………………………101 致谢………………………………………………………………………………102暨南大学博士学位论文米非司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响 暨南大学博士学位论文米非司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响 米非司酮对孕 7-9 周人胎盘绒毛的影响暨南大学第一临床医学院妇产科 博士研究生唐薇导师王自能 教授摘要 目的: 1. 对比观察米非司酮对孕 7-9 周人胎盘绒毛中前列腺素合成及表达、氧化/抗 氧化状态和间质微血管形态及数量的影响,从前列腺素合成调控、氧化应激 和胎盘绒毛间质微血管变化三方面探讨米非司酮终止早孕的可能机制。 2. 进一步完善米非司酮在药物流产中作用机理的认识,为临床上合理扩大米非 司酮终孕应用范围提供理论基础和实验参考依据,同时为其在其它领域的应 用提供理论依据。 方法: 1. 应用免疫组织化学(SP)法检测 COX-2 、COX-1、NF-κB 在米非司酮药流组 与人流对照组(孕7-9周各12例)胎盘绒毛滋养细胞中表达量的差异;应用 酶联免疫吸附定量(ELISA)法检测PGF 在上述两组胎盘绒毛中含量的差异, 2α 了解米非司酮对人早孕7-9周胎盘绒毛前列腺素合成及表达的影响。 2. 应用化学比色法检测MDA、T-AOC、CuZn-SOD和MDA/T-AOC比值在上述两组胎 盘绒毛中含量的差异,了解米非司酮对人早孕7-9周胎盘绒毛氧化/抗氧化平 衡状态的影响。 1暨南大学博士学位论文米非司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响 3. 应用免疫组化法定位 HO-1 在上述两组胎盘绒毛中的表达部位及检测其 在滋 养细胞中表达量的差异;蛋白质印迹(Western blot)法检测HO-1在上述 两组胎盘绒毛中蛋白表达量的差异;逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR) 法检测HO-1mRNA在上述两组胎盘绒毛中RNA转录量的差异,通过HO-1将前 列腺素合成调控、氧化应激和胎盘绒毛间质微血管变化三方面相互作用联系 起来探讨米非司酮终止早孕的可能机制。 4. 应用免疫组化法检测VEGF在上述两组胎盘绒毛滋养细胞中表达量的差 异;间 接免疫荧光组织化学方法及激光共聚焦成像技术,观察分析上述两组胎盘绒 毛间质中 CD34 荧光标记的微血管形态及数量的差异,准确直观地了解米非 司酮对孕7-9周人胎盘绒毛间质微血管形成的影响。 结果: 1. COX-2主要强表达于绒毛表面的合体滋养细胞胞浆中,细胞滋养细胞胞浆 弱表 达,米非司酮药流组阳性表达较人流对照组强(P0.01)。NF-κB主要强表达 于绒毛表面的合体滋养细胞胞浆中,细胞滋养细胞胞浆表达稍弱,米非司酮 药流组阳性表达较人流对照组强(P0.01)。COX-1 强表达于米非司酮药流组 与人流对照组胎盘绒毛合体及细胞滋养细胞胞浆中,两组表达无明显差别(P =0.064,P0.05)。米非司酮药流组胎盘绒毛中PGF 的表达较人流对照组明显 2α 增多(P0.01)。 2. 米非司酮药流组胎盘绒毛中MDA含量较人流对照组明显增多(P0.01)。 米非司酮药流组胎盘绒毛中T-AOC含量较人流对照组明显减少(P0.01)。 米非司酮药流组胎盘绒毛中CuZn-SOD含量较人流对照组明显减少(P0.01)。 米非司酮药流组胎盘绒毛中MDA/T-AOC比值较人流对照组明显增大(P0.01)。 3. HO-1 主要强表达于绒毛的滋养细胞胞核及胞浆中,部分血管内皮细胞和间质 细胞胞核、胞浆也有表达。米非司酮药流组滋养细胞胞核、胞浆阳性表达较 对照组强(P0.01)。Western blot法检测HO-1在上述两组胎盘绒毛中蛋白 表达量,米非司酮药流组较对照组增多(P0.01)。RT-PCR 法检测 HO-1mRNA 在上述两组胎盘绒毛中RNA转录量,米非司酮药流组较对照组增多(P0.01)。 4. 米非司酮药流组与人流对照组均可见血管内皮细胞在 FITC-CD34 标记下呈清 2暨南大学博士学位论文米非司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响 晰明亮的绿色荧光,人流对照组毛细血管的形态规则,管腔清晰,管径大小 正常。米非司酮药流组毛细血管的数目增多,形态不规则,管腔不同程度扭 曲扩张。米非司酮药流组微血管长度密度Lv较人流组增高P=0.043, P< 0.05。米非司酮药流组微血管体积密度Vv 较人流组增高P=0.031, P< 0.05。VEGF表达于上述两组胎盘绒毛滋养细胞、血管内皮细胞胞浆中,米非 司酮药流组滋养细胞阳性表达较人流对照组减弱(P0.01)。 结论: 1.米非司酮激活 NF-κB,使 COX-2 表达增多,继而使 PGs(尤其 PGF )合成增 2α 多, PGF 引起血管收缩,蜕膜组织变性坏死继而直接或间接影响绒毛组织的 2α 血液供应,刺激产生更多ROS,进一步加重氧化损伤,同时激活子宫平滑肌收缩 及扩张宫颈,导致正常妊娠无法维持而终孕。 2.人早孕 7-9 周胎盘绒毛中存在氧化应激现象。米非司酮可使 MDA 含量增加, T-AOC和CuZn-SOD含量减少,MDA/T-AOC比值增大,加重氧化/抗氧化失衡, 促进ROS产生和NF-κB激活,使PGs(尤其PGF )合成及表达增多,血管收 2α 缩使血管内皮细胞和线粒体功能受损,又进一步促进ROS的产生,加重氧化/ 抗氧化失衡。 3.米非司酮促进ROS产生,ROS通过激活HO-1基因启动区的NF-kB上调HO-1mRNA 转录和蛋白合成。HO-1发挥其抗氧化应激、扩血管改善胎盘循环和胎儿生长 发育、细胞保护、抗炎、抑制血小板凝集、抑制凋亡等作用来对抗米非司酮 的作用。PGF 与HO-1相互竞争,究竟是使氧化/抗氧化在新的水平上保持平 2α 衡,妊娠得以维持,还是PGs昀终引起血管收缩,血管内皮细胞损伤,进一步 促进ROS的产生,导致氧化/抗氧化完全失衡,这种竞争的结果就决定了妊娠 的结局。 4.在顿服米非司酮 150mg 后 24-48h 而未加用米索前列醇的情况下,人早孕 7-9 周胎盘绒毛出现了PGs合成及表达增多、氧化/抗氧化失衡状态,但同时也出 现HO-1mRNA转录和蛋白合成增加来对抗米非司酮上述作用,胎盘绒毛微血管 出现数目增多,管腔不同程度扭曲扩张,可能反映此时胎盘绒毛处于一种代 偿状态而非耗竭现象。此时需加服前列腺素抑制HO-1的代偿作用或适当延长 3暨南大学博士学位论文米非司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响 米非司酮作用时间和剂量,以加重氧化/抗氧化失衡状态,刺激产生更多ROS, 进一步加重氧化损伤,激活子宫平滑肌收缩及扩张宫颈,以达到预期的药物 流产效果。 关键词:米非司酮,胎盘绒毛,氧化应激,间质微血管 ,前列腺素, 血红素 氧合酶-1 4暨南大学博士学位论文米非司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响 Effect of Mifepristone on Human 7-9 Gestational Weeks Placental VilliMajor: ObstetricsGynecology Name: Wei Tang Supervisor: Professor //.il.Zineng Wang Abstract Objectives:1. To investigate the synthesis and regulation of prostaglandins, oxidative stress and microvascular changes in the mesenchyma of human placental villi in order to explain the possible mechanism of mifepristone used for medical abortion. To observe the effect of mifepristone on the synthesis and expression of PGF , the balance of 2α oxidation/antioxidation, the configuration and number of the mesenchyma micrangium in human placental villi during 7-9 week’s pregnancy 2. To improve the knowledge of action mechanism of mifepristone and rationally expand the use of mifepristone in abortion, offer theoretical basis and lab reference for its application even in other fields Methods:5暨南大学博士学位论文米非司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响 1. To study the effect of mifepristone on synthesis and expression of PGF in human placental villi during early pregnancy7-9 weeks 2α The patients were divided into mifepristone group n12 and induced abortion groupn12 randomly. Immunohistochemistry streptavidin-peroxidase, S-P was used to detect the expression ofCOX-2, COX-1 and NF-κB in human placental villous trophoblast between mifepristone group and induced abortion group. The expression level of PGF was determined by enzyme linked 2α immunosorbent assay ELISA 2. To investigate the effect of mifepristone on oxidation/antioxidation balance of human placental villi during early pregnancy 7-9 weeks Colorimetry was used to detect the level of MDA, T-AOC, CuZn-SOD and MDA/T-AOC in above mentioned groups3. Immunohistochemistrystreptavidin-peroxidase, S-P was used to locate and detect the expression level of HO-1 in trophoblast of two groups. The protein expression level of HO-1 was determined by Western blot; Reverse transcription-polymerase chain reaction RT-PCR was applied to measure the mRNA level of HO-1 in two groups; Thus we can investigate the possible mechanism of mifepristone by analyzing interactions among PGF synthesis and 2α regulation, oxidation stress and mesenchyma microvacular changes of human placental villi through HO-16暨南大学博士学位论文米非 司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响 4. To study how mifepristone affect mesenchyma micrangium ofhuman placental villi during early pregnancy 7-9weeksImmunofluorescence histochemistry and Laser Scanning Confocal Fluorescence Microimaging System were used to detect configuration and number of vascular fluorescence labeled by CD34 in two groups Results:1. COX-2 was strongly expressed mainly in cytoplasm of syncytrotrophoblast on the surface of villi, weakly expressed in cytoplasm of cytotrophoblast, and the expression in mifepristone group was significantly higher than that in artificial induced group (P0.01). NF- κB was strongly expressed mainly in cytoplasm of syncytrotrophoblast,weakly expressed in cytoplasm of cytotrophoblast, and the expression in mifepristone group was significantly higher than that in induced abortion group(P0.01). COX-1 was strongly expressed in the cytoplasm of syncytrotrophoblast and cytrotrophoblast in both mifepristone group and induced abortion group. No statistically significant difference was found between two ( P= 0.064,P0.05). The expression of PGF in villi in groups 2α mifepristone group was significantly higher than that in induced abortion group(P0.01)2. The villus level of MDA in mifepristone group was significantly 7暨南大学博士学位论文米非司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响 higher than that in induced abortion group(P0.01). The villus level of T-AOC in mifepristone group was significantly lower than that in induced abortion group(P0.01). The villus level of CuZn-SOD in mifepristone group was significantly lower than that in induced abortion group(P0.01). The villus level of MDA/T-AOC in mifepristone group was significantly higher than that in induced abortion group(P0.01)3. HO-1 was expressed mainly in cytoplasm and neucleus of trophoblast, partly in cytoplasm and neucleus of vascular endothelial cells and mesenchyma cells. The expression of HO-1 in trophoblast in mifepristone group was significantly higher than that in induced abortion group(P0.01). Using Western blot, the protein level of HO-1 was significantly higher in mifepristone group than that in induced abortion group(P0.01). When detected by RT-PCR, the mRNA level of HO-1 was significantly higher in mifepristone group than that in induced abortion group(P0.01) 4. Clear and bright green fluorescence was found in the vascular endothelial cells labeled by FITC-CD34 in both groups. In induced abortion group, the capillary configuration was regular. The lumen was distinct and normal in size. While in mifepristone group, the number of mesenchyma micrangium increased. The configuration was irregular. The lumen was twisted and dilated in various degrees8 暨南大学博士学位论文米非司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响 The microvascular length density Lv was significantly higher in mifepristone group than that in induced abortion group(P=0.043, P <0.05The microvascular volume density Vv was significantly higher in mifepristone group than that in induced abortion group(P= 0.031, P< 0.05). VEGF was expressed in the cytoplasm of trophoblast and vascular endothelial cell in above mentioned groups, and the expression in mifepristone group was significantly lower than that in induced abortion group(P0.01) Conclution:1. NF- κB is activated by mifepristone,the expression of COX-2, and more PGs(esp. PGF )are synthesized, which consequently induces2α vessel contraction , degeneration and necrosis of decidua tissue and the villus blood supply is affected directly or indirectly. The inhibition of HO-1 produces more ROS by antioxidation stress which further aggrevates the oxidative damage and leads to uterine smooth muscle contraction, thus interrupts and hampers pregnancy2. There is oxidative stress in human villi during early pregnancy 7-9weeks. Mifepristone can further destroy the balance of oxidation/antioxidation, produce ROS and activate NF- κB , synthesize and express more PGsesp. PGF , then vessel 2α contraction leads to the potential loss of vascular endothelial cells 9暨南大学博士学位论文米非司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响 and mitochondrial, which produces more ROS, and oxidation/antioxidation balance is further destroyed3. Mifepristone promotes to produce ROS, which can increase HO-1mRNA transcription and protein synthesis throughactivational NF- κB in promoter region of HO-1 gene. To resist the effect of mifepristone, HO-1 decreases oxidative stress, dilates vessel to improve blood supply in placenta and infant growth and development, protects cell, inhibits inflammation, aggregation of platelet and apoptosis. The result of competition between PGF and 2α HO-1 decides whether prgnancy continues. If the balance of oxidation/antioxidation is maintained in a new degree, the pregnancy will continue. On the contrary, the vessel contracts, the endothelial cells are damaged, ROS is produced, the oxidation/antioxidation balance is completely destroyed 4. 24-48h after taking mifepristone 150mg without adding misoprostol, the synthesis and expression level of PGs are increased and the balance of oxidation/antioxidaiton is destroyed in human placental villi during early pregnancy7-9weeks. HO-1 mRNA and protein synthesis are also increased to resist the effects of mifepristone mentioned above. The number of capillary in villi is increased. The lumen is twisted and dilated in various degreesProbably it is a compensatory rather than an exhausting phenomenon. Then PG is 10暨南大学博士学位论文米非司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响 needed to inhibit the compensatory effect of HO-1. Therefore, the usage time and dosage of mifepristone should be extended or increased in order to complete the medical abortion Key Words:mifepristone,placental villi , oxidative stress,mesenchymamicrangium ,Prostaglandins, hemeoxygenase-1 11暨南大学博士学位论文米非司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响前 言 1.米非司酮在早孕药物流产的应用 [1] 1985年Bygdeman和Swahn 首次证明,米非司酮(mifepristone,RU486) 配伍小剂量前列腺素制剂可使早孕(停经?49 天)完全流产率达 90%以上, 从 而使米非司酮作为一种抗早孕药物在临床上推广应用。由于米非司酮确能减 少人 工流产的危险,终止非期望妊娠,在适合的人群中有高度的可接受性,并有潜 在 的更广阔的临床新用途,因此由法国 Rossel-Uclaf 公司研制生产的米非司 酮于 [2] 1988 年 10 月正式在中国注册临床应用 。如今,我国是国际上唯一形成规模生 产米非司酮的国家,也是临床应用米非司酮昀多的国家。 米非司酮化学名:11β-4-N,N-二甲氨基苯基-17β-羟基-17α-1-丙炔 基-雌甾-4,9-二烯-3-酮(分子结构见图0-1)。 [3] 图 0-1 米非司酮的分子结构图 12暨南大学博士学位论文米非司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响 米非司酮在分子水平与内源性孕酮竞争结合受体,从而产生较强的抗孕酮 作用,可直接作用于绒毛、蜕膜、胎盘、子宫肌层、宫颈,引起胚胎及其支持组 织在代谢和形态结构发生一系列影响,并具有抑制雌激素依赖性组织增生和抗氧 [4] 化作用 。米非司酮抗早孕的机制是多方面、多水平的,非单一机制所能解释: ?使妊娠的蜕膜及绒毛细胞变性坏死。?抑制滋养细胞增殖,诱导和促进其凋亡 [5] ,阻断 G、G 期滋养细胞向 S 期的转化,从而抑制细胞增殖,且对绒毛的作用大 0 1 [6] 于对蜕膜的作用 。?增加早孕绒毛和蜕膜的纤溶活性,抑制基质金属蛋白酶 [7] (matrix metalloproteinase,MMPs),促进细胞外基质的水解 。?通过对抗 孕酮作用而兴奋子宫平滑肌,使子宫平滑肌细胞间形成间隙连接(gap junctions),加强细胞间的偶联和同步,引发节律性子宫平滑肌收缩,并且对前列 腺素敏感性增高;同时可抑制前列腺素脱氢酶prostaglandin dehydrogenase , [8] PGDH的活性,使前列腺素降解受到抑制,内源性前列腺素尤其PGF 明显升高 。 2α ?作用于下丘脑和垂体水平,抑制促性腺激素释放激素 (gonadotropin-releasing hormone ,GnRH),促使黄体生成素luteinizing[9] hormone, LH 、 卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)下降 。 ?作用于宫颈,使胶原纤维合成减弱,分解增强,使之成熟软化扩张,以利于胚 [10] 胎及子宫蜕膜排出 。?也可直接作用于滋养细胞,抑制人绒毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotrophin,hCG)分泌,并遏制 hCG 对妊娠黄体的支持 [11] 作用, 黄体溶解,从而使依赖黄体发育的胚囊坏死而发生流产 。?通过降低 早孕绒毛和/或蜕膜组织中胰岛素样生长因子insulin-like growth factor, IGFs、白血病抑制因子leukemia inhibitory factor ,LIF 和表皮生长因子 [12-15] epidermal growth factor ,EGF的表达,干扰早期胚胎的生长发育 。?引 起Th /Th 型细胞因子平衡偏移,使Th 型细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-3、IL-8、 1 2 1 IL-12、IL-17、GM-CSF、LT、TNF-α和β等)上调、Th 型细胞因子(IL-4、IL-5、 2 IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、TGF-β)下调, Th 型细胞因子介导的细胞免疫增 1 强,活化巨噬细胞,发生强烈的迟发型超敏反应,促进细胞毒作用,引起炎症和 [16] 组织损伤,导致正常妊娠无法维持而终孕 。13暨南大学博士学位论文米非司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响 2.前列腺素的合成及表达 1930年美国两位妇产科医生Kurzrok和Lieb首先发现新鲜的男性精液可引 [17] 起女性子宫强烈收缩和松弛反应。1957 年 Bergstrom 和 Sjovall 从精液中分 离出一种叫前列腺素(prostaglandin,PG)的结晶,随后又分离出一系列的PGs 化合物。PGs是一族含有20个碳原子的不饱和脂肪酸,由一个五碳环和二条侧链 组成,基本结构是前列腺烷酸。根据其五碳环及双侧链的结构不同及功能基团取 代部位的不同,分三类、九型。天然 PGs 广泛存在于人体组织中,除红细胞外,各 组织细胞均能合成,但不同组织合成 PGs 的质与量有较大差异。PGs 在体内的主 要代谢途径是C 上的羟基氧化成酮基而失去活性,此反应是在PGDH催化下进行, 15 [18] 肺和肾为主要代谢场所,经过一次肺循环,约有 90%的 PGE 和 PGF 降解 。 PGs 2 2α [19] 在女性生殖方面主要对输卵管运动、卵巢功能及子宫舒、缩功能有直接影响 , 其中PGE /PGF 比例平衡对胚泡植入及胚胎存活十分重要。米非司酮可使妊娠90 2 2 [20] 天的母羊 PGF 升高,PGE/PGF 比值减少 。PGs 具有调节血管反应和细胞增殖 2 2 2 分化的功能,是种植过程的重要分子信号之一。研究认为PGE 和PGI 是主要参与 2 2 [21] 了种植和蜕膜化过程的 PGs 。1972 年 Kurzrok 首先用人工合成的前列腺素 15 -甲基PGF 甲酯和15-PGF 于阴道给药抗早孕成功开创前列腺素类似物抗早孕 2 2α 先河。米索前列醇是人工合成的PGE类似物,因价格便宜、室温下性质稳定 等优 点,广泛用于药物流产。对孕?9周药物流产三种给药途径比较,舌下含服和阴 [22,23] 道给药比口服更有效,副作用更少 ;而舌下含服起效昀快,但副作用略高于 [24] 阴道给药 。 环加氧酶(cyclooxygenase,COX),又称前列腺素H合成酶prostaglandin H synthase,PGHS、环氧化酶、环氧合酶等,具有环氧合酶和过氧化物合成酶的 双重功能。细胞膜的磷脂在磷脂酶的作用下水解出花生四烯酸arachidonic acid ,AA,AA经过COX的作用转变为前列腺素前体?PGG 或PGH, 从而形成各 2 2 [25] 种形式的 PGs,发挥多种生物学作用 。迄今已发现了由两种不同基因编码的 3 种 COX,即 COX-1、COX-2 和 COX-3。COX-1 为结构型酶,活性较稳定, 不受诱导 物和抑制物的影响而保持恒量,促进生理性 PGs 的合成,参与维持机体正常的生 理功能及保持内环境稳定。COX-2为诱导型酶,在正常生理情况下,除少数组织有 少量表达外,大多数组织中均不表达。但当细胞受到各种刺激时可迅速合成, 参 14暨南大学博士学位论文米非司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响 与细胞增殖、分化,并与炎症、疼痛、肿瘤、心血管等疾病的发生发展密切相关。 氧化应激、各种炎症细胞因子、脂多糖lipopolysaccharide ,LPS、IL-1、TNF、 EGF、血小板激活因子等均可以诱导 COX-2 的表达。而抗炎症细胞因子 IL-4、 IL-10、IL-13、IFN-γ等可抑制 LPS、TNF 等对 COX-2 的诱导。生殖系统的部分 正常组织中可以检测到COX-2mRNA和蛋白,例如子宫内膜上皮和输卵管的分泌上 [26] 皮 。COX 基因的适时表达保证了许多重要生殖过程,例如排卵、黄体退化、胚 [27,28] 胎着床和分娩等的顺利进行 。人类COX-2的增量调节更紧密地与足月及早产 的分娩发动相关联,有效的COX-2抑制剂在减弱由人类炎症引起的早产中可能有 非常重要的作用。 3. 氧化/抗氧化平衡状态的评价指标 真核生物在代谢过程中需要氧, 仅 1%~7%的氧经单电子还原成 Oˉ并进一 2 步生成 OH?和 HO ,这种处于自由状态的氧称为反应氧族或活性氧reactive 2 2- oxygen species, ROS,包括氧自由基O 和OH?和非氧自由基单线氧和HO。 2 2 2 ROS 化学性质极为活泼,易失去电子氧化或获得电子还原,参与体内的电子 转移、杀菌和物质代谢。ROS在生长因子调节的生理反应中扮演信号分子的角色, 它可能通过对关键信号蛋白疏基基团的修饰,可逆性调节蛋白激酶、磷酸化酶和 [29] 转录因子的活性 。在生理状态下,细胞内存在着抗氧化物质,可以及时清除ROS, 使ROS的生成和降解处于平衡状态,当氧化/抗氧化平衡时对机体并无有害影响。 丙二醛maleic dialdehyde ,MDA是细胞膜磷脂中的多不饱和脂肪酸 polyunsaturated fatty acid,PUFA受到活性氧攻击后发生脂质过氧化反应的 昀终产物。其水平高低可直接反映体内的脂质 过氧化情况,也可间接反映体内 ROS引起细胞损伤的程度。自由基是只能独立存在的含有一个或一个以上不配对 电子的任何原子或原子团,由于其作用在机体内存在时间短,因此一般对自由基 检测均采用 MDA 作为检测指标。MDA 有很强的生物活性和较稳定的化学性,可带 着原自由基的损伤潜能性从其生成部位,例如内质网扩散到线粒体、核糖体、核 和其他细胞成分,与组织内蛋白质的游离氨基作用,引起蛋白质分子内和分子间 交联,并与核酸DNA、RNA及碱基、生物胺和磷脂等含有氨基的物质交联,破坏组 [30] 织细胞的结构和功能 。测定原理为过氧化脂质降解产物中的 MDA 可与硫代巴 15暨南大学博士学位论文米非司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响 比妥酸缩合,形成红色产物,在532nm处有昀大吸收峰。 总抗氧化能力total antioxidation capability ,T-AOC是机体清除自由 基、分解过氧化物等能力的重要指标,它与机体健康程度存在着密切联系。此抗 氧化防御体系有低分子自由基清除剂和酶性自由基清除剂两部分,例如超氧化物 歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase ,CAT)、谷胱 甘肽glutathione ,GSH、过氧化物酶peroxydase ,GPx、抗坏血酸(vitamin C ,V )、V 、还原型辅酶?(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide C E [31] phosphate ,NADPH)、转铁蛋白、β-胡萝卜素等 。这个体系的防护氧化作用 主要通过三条途径:l消除自由基和 ROS 以免引发脂质过氧化;2分解过氧化 物,阻断过氧化链;3除去起催化作用的金属离子。防御体系各成分之间相互 起到了协同作用、代偿作用与依赖作用。测定原理为机体内的抗氧化物质,能使 2+ 3+ Fe 还原成Fe ,后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物,通过比色可测出其抗 氧化能力的高低。对T-AOC的测定克服了单一的抗氧化指标难以全面反映组织抗 氧化能力的不足,有利于更全面评价机体抗氧化系统的综合作用。 对氧化应激的评估应包括 ROS 和 T-AOC 氧化/抗氧化两方面,因此引入 MDA/T-AOC比值,将两者结合起来能更充分定量评估氧化应激状态。 SOD 是黄嘌呤氧化酶产生的超氧化物的清除剂,是体内催化歧化反应的一种 抗氧化保护酶,对机体的氧化和抗氧化平衡起着重要的作用,此酶能清除超氧阴 - [32] 离子自由基O ,保护细胞免受损伤 。自 1969 年 McCord 发现以来,国内外许 2 多学者对其进行了广泛而深入的研究。SOD不仅与生物体内的抗氧化、解毒作用 有关,而且也与机体的衰老、肿瘤及免疫疾病有关。在产科,已发现SOD与正常及 病理妊娠密切相关。SOD根据所含金属辅基的不同,可分为3类:第1类含铜和锌, 称铜锌超氧化物歧化酶CuZn-SOD, 第 2 类含锰, 称锰超氧化物歧化酶 [33] Mn-SOD, 第 3 类含铁,称铁超氧化物歧化酶Fe-SOD 。 哺乳类动物细胞中 - 只含前两类SOD,其作用在于清除HO 和OH?的前身O ,从而保护细胞不受毒性 2 2 2 氧自由基的伤害。在体内和体外,CuZn-SOD发生糖基化反应,通过形成Amaadori 复合物失去它的活性。CuZn-SOD 的两个赖氨酸(lysine)残基lys-122和 lys-128 是基本的糖基化位点,位于分子的表面。这些位点同时位于活性基团,是酶活性 的重要成分。Mn-SOD 表达于线粒体基质,其调节方式很复杂,IL-1、IL-6、TNF、 16暨南大学博士学位论文米非司酮对孕 7-9周人胎盘绒毛的影响 LPS等刺激其表达。这种酶可能在炎症反应中参与损伤的防御机制。Fe-SOD是细 胞外SOD,高度糖基化,对硫酸肝素有很大的亲和力,其肝素结合区域的错义突 [34] 变明显增加这种酶的血清水平。它清除血浆中的超氧化物。Qanungo等 的实验 结果显示,在整个孕期随孕周的进展 SOD、CAT 和 GSH-PX 逐渐升高。研究发现 SOD与胚胎发育、妊娠黄体的维持及子宫内膜蜕膜变关系密切。测定原理为通过 - 黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生 O ,后者氧化羟胺形成亚硝酸盐,在显色 2 剂的作用下呈现紫红色,用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含
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