“一测多评”法用于栀子金花丸多成分含量测定的可行性研究.doc

“一测多评”法用于栀子金花丸多成分含量测定的可行性研究.doc “一测多评”法用于栀子金花丸多成分含量测定的可 行性研究 [收稿日期] 2014-02-21 [基金项目] 国家药品标准提高暨2015年版药典科研项目;中医药行业科技专业项目(200707009)，国家“重大新药创制”科技重大专项(2012ZX09103201-009);国家科技支撑计划项目(2011BAI03B01);国家重点基础研究发展计划(973)项目(2012CB724001);国家自然科学基金项目(81274079) [通信作者] *冯伟红，副研究员，研究方向为中药质量，E-mail:weihong_bj@126.com;*王智民，研究员，研究方向为中药化学与质量控制，E-mail:zhmw123@263.net [作者简介] 赵倩，硕士研究生，E-mail:zhaoqian_ny@163.com [摘要] 目的:利用一个对照品同步测定栀子金花丸中10种成分的含量，探讨“一测多评”技术在中成药不同类型化合物质量中应用的可行性。方法: 以栀子金花丸为研究对象，采用高效液相色谱法，以大黄素为内参物，在254 nm检测波长下，建立小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚与大黄素间的相对校正因子。采用外标法测定栀子金花丸中大黄素的含量，通过待测成分间的相对校正因子计算栀子金花丸中其他9种成分的含量;并将“一测多评”法的计算值与外标法实测值用相对误差进行评价，以验证“一测 多评”法的技术可行性和方法适用性。结果:2种计算结果没有显著性差异，相对误差<5%。结论:“一测多评”的质量评价模式可用于栀子金花丸中3种不同类型化合物的多指标同步质量评价。 [关键词] “一测多评”法; 相对校正因子; 生物碱; 黄酮; 游离蒽醌; 栀子金花丸; 质量评价 中成药的质量长期以来多以单一指标进行控制，难以真正体现中药的多效性和整体性。中药多靶点的作用特点要求对其进行多成分质量控制[1]，因此多成分同步测定的质量控制模式应运而生，但商品化对照品的供不应求和多指标控制高昂的检测费用限制了该模式在实际生产、科研和监管领域的应用[2]。“一测多评”中药质量评价模式为解决该矛盾提供了新思路。该模式提出后在单味中药材[3-11]和中药复方制剂[12-14]的质量控制研究中得到了广泛应用，但均以同一类型化合物的质量控制研究居多。本研究以栀子金花丸中的黄连生物碱、黄芩黄酮和大黄游离蒽醌3种不同结构类型的10个化学成分为研究对象，探讨“一测多评”技术在中成药多组分质量控制中应用的技术可行性和方法适用性。 栀子金花丸始载于《宣明论方》[15]，由栀子、黄芩、大黄、黄连、黄柏、金银花、知母、天花粉8味中药组成，栀子金花丸具有清热泻火、凉血解毒的功效，用于肺胃热盛、口舌生疮、牙龈肿痛、目赤眩晕、咽喉肿痛等[16]。目前的文献报道中对栀子金花丸的质量控制研究主要是借助常规HPLC进行同类型化合物的含量测定[17-21]，2010年版《中国药典》中也仅以栀子苷为检测指标，难以真正体现和保证栀子金花丸的内在质量。依据栀子金花丸的功效、适应症及各单味药所含成分已知的药理作用 推测，黄连生物碱、黄芩黄酮和大黄游离蒽醌应为其主要药效成分，因此对小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚等10个成分进行质量控制可有效地保证该药的质量和药效。 1 材料 Shimadzu LC20A 高效液相色谱仪，包括LC-20AT溶液传输单元，SIL-20A 自动进样器，SPD-M20A 二极管阵列检测器，LC Solution色谱工作站(日本岛津公司);Waters Alliance 高效液相色谱仪，包括2695 溶剂管理系统，2996二极管阵列检测器，Empower2 色谱工作站(美国WATERS公司)。 Syncronis C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，Welchrom C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，SpursilTM C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，Accurasil C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)。 对照品盐酸小檗碱(批号110713-200911，质量分数以86.8%计)、黄芩苷(批号110715-201016，质量分数以94.0%计)、黄芩素(批号111595-200905)、芦荟大黄素(批号110795-201007)、大黄素(批号110756-200110)、大黄酚(110796-200716)、大黄酸(批号110757-200206)和大黄素甲醚(批号110758-201013)均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用;汉黄芩苷(批号H-019-110325)，汉黄芩素(批号H-029-111222)购自瑞芬思生物科技有限公司，HPLC级，纯度?98%。甲醇、乙腈为HPLC级，美国Fisher公司;水为哇哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。 药品栀子金花丸为来源于各地药品零售商店的商品，见1。 2 方法与结果 2.1 多成分同步测定方法的建立与方法学考察 2.1.1 色谱条件 Syncronis C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相甲醇(A)-乙腈(B)-0.2%磷酸溶液(C)，梯度洗脱，0,60 min， 40%,4% A，0%,60% B;60,90 min，4%,10% A，60%,85% B;流速1 mL?min-1，柱温30 ?，检测波长254 nm。色谱图见图1。 2.1.2 供试品溶液的制备 取栀子金花丸粉末(过40目筛)约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，取出放至室温，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。 A.供试品;B.混合对照品;C.阴性供试品(缺黄连、黄芩、大黄、黄柏);1.小檗碱;2.黄芩苷;3. 汉黄芩苷;4.黄芩素;5.芦荟大黄素;6.汉黄芩素;7.大黄酸;8.大黄素;9.大黄酚;10.大黄素甲醚。 图1 栀子金花丸HPLC图谱 Fig.1 Chromatograms of chemical reference substances and sample 2.1.3 对照品溶液的制备 取对照品盐酸小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL分别含上述对照品0.054 7，0.041 0，0.054 0，0.219 0，0.005 68，0.073 0，0.005 30，0.006 40，0.017 1，0.005 20 mg的混 合对照品溶液，备用。 2.1.4 方法学考察 2.1.4.1 线性关系考察 分别精密吸取2.1.3项下的混合对照品溶液1，5，10，15，20，25，30，35 μL注入高效液相色谱仪，测定小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的峰面积。以测得的响应信号和被测物的进样质量用最小二乘法进行线性回归，得到各成分的回归方程以及线性范围，见表2。结果表明，待测成分在如下范围内成良好的线性关系。 2.1.4.2 精密度试验 取2.1.2项下同一份栀子金花丸供试品溶液，于同一日内连续进样6次，进样量10 μL，测定小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的峰面积，计算RSD。结果各待测成分峰面积的RSD分别为1.6%，0.11%，0.10%，0.059%，0.63%，0.11%，0.24%，0.15%，0.18%，1.4%，结果表明仪器的精密度良好。 2.1.4.3 稳定性试验 取栀子金花丸(北京同仁堂制药有限公司，批号2083009)粉末约0.2 g，精密称定，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，分别于供试品溶液制备后0，2，4，6，8，10，12，24 h进样，测定供试品溶液中小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的峰面积，计算RSD。结果上述各待测成分峰面积的RSD分别为1.7%，0.11%，0.10%，0.058%，0.53%，0.13%，0.34%，0.19%，0.17%，2.7%，结果表明24 h 内供试品溶液的稳定性良好。 2.1.4.4 重复性试验 取同一批号的栀子金花丸(北京同仁堂制药有限公司，批号2083009)粉末(过40目筛) 约0.2 g，精密称定，进样，按2.1.2 项下方法平行制备6 份供试品溶液，分别测定小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的峰面积，计算含量及RSD。结果测得上述各待测成分的质量分数分别为3.72，6.17，2.40，17.0，0.300，4.88，0.712，0.616，1.27，0.365 mg?g-1，RSD分别为0.79%，1.1%，1.0%，0.61%，0.78%，0.59%，0.86%，0.61%，0.42%，1.4%，结果表明该方法的重复性良好。 2.1.4.5 加样回收试验 取已知含量的栀子金花丸(北京同仁堂制药有限公司，批号2083009)粉末约0.1 g(黄芩素的加样回收试验取栀子金花丸粉末约0.01 g)，精密称定，分别按样品含量-对照品大约1?1加入一定量的对照品溶液，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，测定并计算小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的的加样回收率以及RSD。结果上述各待测成分的平均加样回收率分别为100.7%，103.3%，99.89%，103.1%，103.4%，103.4%，102.1%，99.15%，97.66%，100.2%，RSD分别为1.3%，1.0%，1.3%，1.4%，0.69%，0.81%，1.5%，0.50%，0.69%，1.5%，结果表明该方法的准确度良好。 2.2 相对校正因子的确定 2.2.1 相对校正因子的计算 按2.1.4.1项下试验方法和所得各成分回归方程，以大黄素为内参物，根据相对校正因子计算公式f k/s=ak / as(a为各成分回归方程的斜率， s为内参物，k为其他待测组分)，分别计算小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚与内参物大黄素的相对校正因子，见表3。 2.2.2 相对校正因子的重复性试验 按2.1.3 项下方法，平行制备5份混合对照品溶液，分别进样不同体积，以被测物的峰面积和进样质量用最小二乘法进行线性回归，得到各待测成分的回归方程，根据2.2.1项下的公式计算相对校正因子。5次平行试验所得小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚与大黄素间相对校正因的平均值分别为1.01，0.427，0.541，0.887，1.39，0.793，1.22，1.48，1.01;RSD分别为1.7%，2.5%，2.9%，4.3%，4.1%，2.8%，3.8%，3.1%，3.1%，表明相对校正因子的重复性良好。 2.2.3 相对校正因子的耐用性考察 2.2.3.1 不同仪器对相对校正因子的影响 采用Syncronis C18色谱柱分别测定了2台Shimadzu LC20A高效液相色谱仪和1台Waters Alliance 高效液相色谱仪下各待测成分间的相对校正因子。结果表明，小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚与内参物大黄素间相对校正因子的重现性良好，RSD在0.83%,4.8%。 2.2.3.2 不同色谱柱对相对校正因子的影响 采用Shimadzu LC20A高效液相色谱系统，分别测定了Syncronis C18，Welchrom C18，Spursil TM C18，Accurasil C18 4种不同填料色谱柱下各待测成分间的相对校正因子。结果表明，小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、 大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚与内参物大黄素间相对校正因子的重现性良好，RSD在0.47%,3.1%。 2.2.3.3 不同流速对相对校正因子的影响 采用Shimadzu LC20A高效液相色谱系统和SpursilTM C18色谱柱，分别测定了不同流速(0.95，1.0，1.05 mL?min-1)下各待测成分间的相对校正因子。结果表明，小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、大黄 酸、大黄酚和大黄素甲醚与内参物大黄素间相对校正因子的重现性良好，RSD在0.069%,1.6%。 2.2.3.4 不同柱温对相对校正因子的影响 采用Shimadzu LC20A 高效液相色谱系统和SpursilTM C18色谱柱，分别测定了不同柱温(29，30，31 ?) 下各待测成分间的相对校正因子。结果表明，小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚与内参物大黄素间相对校正因子的重现性良好，RSD在0.53%,1.2%。 2.3 待测组分色谱峰的定位 2.3.1 保留时间差和相对保留值定位法 取2.1.3项下的混合对照品溶液，在Shimadzu LC20A高效液相色谱系统上，分别采用Syncronis C18，Welchrom C18，SpursilTM C18，Accurasil C18 4种不同填料色谱柱，测定并计算了待测成分小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚与内参物大黄素间的相对保留值和保留时间差。结果显示不同色谱柱下各待测成分间的保留时间差的波动较小，RSD<5%;小檗碱、黄芩苷的相对保留值波动较大，RSD分别为14%，7.4%。结果表明，相对保留值法不适用于栀子金花丸中待测成分“一测多评”方法的定位，保留时间差法较适宜，见表4，5。 2.3.2 线性回归法定位 据文献报道，由色谱热力学理论可知:在相同的分析条件下，即使采用不同的液相色谱系统或不同的色谱柱，组分的保留时间存在简单的线性关系[22]。实验中，在Shimadzu LC20A高效液相色谱仪，SpursilTM，Welchrom，Syncronis 3个C18填料色谱柱;Waters Alliance 高效液相色谱仪，SpursilTM，Welchrom，Accurasil 3个C18填料色谱柱上，分别取2.1.3项下的混合对照品溶液及2.1.2项下的供试品溶液进样，测定10个待测成分色谱峰的保留时间，并考察线性回归法的定位效果，见表6。定位方法:以含n(n ? 2)个待测成分的混合对照品溶液分别在2根色谱柱上实测得到的保留时间为横坐标和纵坐标进行线性回归，得到待测成分保留时间的回归方程。将所有待测成分对照品在1根C18色谱柱(参照色谱柱)上的实测保留时间代入回归方程，计算得到各待测成分在另一色谱柱上的理论保留时间，即计算值。将计算值与实测值进行比较，并以相对误差评价定位效果。 2.3.3 定位方法的比较 分别将3种定位方法所得结果以绝对误差进行评价，见表7。结果表明，保留时间差法和线性回归定位法的定位效果优于相对保留值法。 2.4 QAMS 法与外标法测定结果的比较 首先，采用外标法(external standard method，ESM)对栀子金花丸中10 种待测成分进行多成分同步含量测定，再用QAMS法建立的待测成分间的相对校正因子对其含量进行计算，并将2 种方法所得结果进行比较，以验证QAMS 法用于栀子金花丸中不同类型化合物含量测定的可靠性， 见表8。2种方法的测定结果无明显差异，相对误差<5%，提示建立的相对校正因子具有较好的可信度，QAMS计算结果可靠。 3 讨论 3.1 检测波长的选择 本实验采用二极管阵列检测器，在190,400 nm波长下分别对供试品溶液和混合对照品溶液中的待测成分进行了全波长扫描。结果小檗碱、4个黄芩黄酮类成分在254 nm波长附近有明显吸收，内参物大黄素及其他4个大黄蒽醌类成分在254 nm波长处为特征吸收;在此波长下，供试品溶液中各待测成分色谱峰分离度良好，且峰纯度检查符合含量测定要求，因此选择254 nm 作为检测波长。 3.2 供试品溶液制备方法 根据待测成分的性质，本实验分别对提取溶媒(甲醇、50%甲醇、乙醇)、溶媒用量(20，25，50 mL)、提取方法(超声、回流、冷浸)与提取时间(20，30，40 min)进行了单因素考察，确定了以25 mL甲醇，超声提取30 min的提取方法。 3.3 内参物的选择 黄芩苷、小檗碱、大黄素的化学性质比较稳定，对照品来源有保证，且廉价易得，这3种成分作为内参物均能体现QAMS 法简便、易操作、低成本的特点。但在进行相对校正因子的耐用性考察时发现:以小檗碱或黄芩苷为内参物时，某些成分的相对校正因子波动较大，以大黄素为内参物时，各成分间的相对校正因子较稳定。故选择大黄素为内参物。 3.4 相对校正因子的计算 本实验分别采用斜率法和多点校正法对待测成分间的相对校正因子进行了计算，所得结果基本一致。采用多点校正法计算时，在线性范围两端的校正点会使该单点校正的结果产生较大偏移，从而影响相对校正因子的确定;采用斜率法计算，在相关系数大于0.999，且斜率/截距>100的情况下测得的相对校正因子较准确，重复性好，因此采用斜率法计算。 3.5 色谱峰的定位 待测成分色谱峰的准确定位是“一测多评”法成功应用的首要环节。本实验选取了SpursilTM，Welchrom，Syncronis，Luna，TopsilTM，Diamonsil(?)，Accurasil，XtimateTM，Kromasil 等9种C18填料色谱柱分别考察保留时间差法、相对保留值法及线性回归法对待测成分色谱峰的定位效果。结果发现，其中某些色谱柱填料对栀子金花丸供试品中个别待测成分的分离效果较差，因此在进行栀子金花丸中小檗碱、黄芩黄酮和大黄蒽醌3种不同类型化合物QAMS质量评价时，推荐使用如下4种C18填料色谱柱，分别为Spursil TM，Welchrom，Syncronis，Accurasil。 在采用线性回归法定位待测成分色谱峰时，由于10个待测成分为3种不同类型化合物，因此在选择校正点(n?2)时，其中之一必须为内参物，在实际应用时，可根据现有对照品的情况灵活应用，由于内参物大黄素为蒽醌类成分，另外1或2个校正点可选择另2类化合物中的代表性成分小檗碱或黄芩苷进行相应的二点校正或三点校正。本实验发现，校正点的增加并未使定位结果的准确性得到相应提高，采用大黄素和小檗碱进行二点校正，定位效果较好。 线性回归法定位待测色谱峰成功应用的前提是，在不同系统或色谱柱 下所有待测成分保留时间回归曲线的相关性良好，即r>0.999。在采用该法进行待测成分定位的同时，若结合待测成分的紫外吸收光谱和栀子金花丸的标准图谱会使定位准确度得以大幅提高。 本研究对QAMS在中成药含不同母核结构的化合物之间是否可行进行了探讨，实验结果证明方法可行。QAMS在未来中药质量评价中作为适宜于中药特点的多指标质量评价模式会得到越来越广泛的应用。 [参考文献] [1] 冯伟红，杨菲，王智民，等. 一测多评法与外标法测定双黄连制剂中黄酮类成分含量的比较分析[J]. 中国药学杂志，2012，47(20):1665. 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