补肾填精法调控辐射损伤ATMATR通路的研究（30600800）

补肾填精法调控辐射损伤ATMATR通路的研究（30600800） C03050106 申请代码: 受理部门: 收件日期: 受理编号: 解除保护 国家自然科学基金 资助类别:面上项目 亚类说明:青年科学基金项目 附注说明: 项目名称:补肾填精法调控辐射损伤ATMATR通路的研究 申 请 者: 电话: 依托单位: 通讯地址: 邮政编码: 单位电话: 电子邮件: 申报日期: 2005年1月22日 国家自然科学基金委员会 国家自然科学基金申请书 基本信息 摘要:维持人体DNA稳定具有重要意义。肾精作为人体重要的基本物质，在其中发挥了重要作用。而多种辐射正成为人类亚健康、疾病甚至癌变的始动或诱发因素，肿瘤放疗副反应可加重患者症状，干扰放疗进程;辐射损害的实质是重要射线靶DNA稳定的破坏。通过辐射研究肾精与DNA稳定的内在机制，具有重要学术和临床应用价值。本项目结合临床温病学理论，提出辐射损伤的基本病机为肾精亏损，从补肾填精立法论治。在前期研究发现该治法能够较好调控 -PCR、Western blot、p53基因及相关因子表达、促进DNA损伤修复的基础上，拟采用荧光RT 流式细胞术、EMSA法和免疫组化等，结合细胞周期和凋亡，探讨该治法对p53上游基因ATM与chk2、BRCA1、NBS1、RAD51、RPA、hTERT、c-Ab1、NF-κB构成的DNA修复调控网络的影响。从基因mRNA和蛋白质水平，揭示肾精维持DNA稳定和该治法抗辐射损伤的机制。 第 2 页 版本1.007.491 国家自然科学基金申请书 项目组主要成员(国家杰出青年科学基金不填此栏) 说明: 1. 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报，总人数自动生成。 2. 项目组主要成员不包括项目申请者。 第 3 页 版本1.007.491 国家自然科学基金申请书 经费申请表 (金额单位:万元) 科目 申请经费 备注(计算依据与说明) 24.1500 一.研究经费 11.3500 1.科研业务费 9.1000 ATM基因及相关指标费 (1)测试/计算/费 0.6500 水电等 (2)能源/动力费 0.7000 会议差旅费 (3)会议费/差旅费 发表论文4-5篇,资料打印,研究期中和期末文献查0.9000 (4)出版物/文献/信息传播费 新 (5)其它 10.8000 2.实验材料费 实验动物购买，mRNA和蛋白表达检测有关试剂，分10.8000 (1)原材料/试剂/药品购置费 子生物学易耗实验用品 (2)其它 0.0000 3.仪器设备费 (1)购置 (2)试制 4.实验室改装费 2.0 与协作单位费用 5.协作费 0.0000 二.国际合作与交流费 1.项目组成员出国合作交流 2.境外专家来华合作交流 三.劳务费 1.2000 学校科研管理 四.管理费 25.3500 合 计 国家其他资助经费 与本项目相关的 其他经费资助(含部门匹配) 其他经费来源 0.0000 其他经费来源合计 第 4 页 版本1.007.491 国家自然科学基金申请书 查看报告正文撰写提纲 报告正文 第 5 页 版本1.007.491 国家自然科学基金申请书 ,一,立项依据与研究内容: 1. 项目的立项依据 (1)现代研究表明，肾精作为人体重要的基本物质，在维持人体DNA的稳定中发挥了重要作用。辐射损伤的中心环节是对DNA这一人体射线靶的损伤。肾精与辐射后DNA的修复之间可能存在关联。 人体DNA的稳定对维持基因组的相对稳定，维护机体内环境的稳态具有重要意义，是人类和其它生命体所具有的基本特征之一,也是生命得以生存繁衍的基本能力。DNA稳定性的破坏是机体出现亚健康状态或疾病，甚至癌变的重要内在因素。 肾精是人体的重要根本物质，为“生之本”(《素问?金匮真言论》)，主人体的生长发育和生殖。现代有关衰老、生殖等的大量临床和实验研究证实了肾精在维持DNA结构[1][2]的稳定中发挥了重要作用，有人明确提出肾藏精是机体的调节中枢。 而多种环境理化因素中，辐射对人类的危害越来越受到重视。包括来自大自然的各种天然辐射，如紫外线、外层空间的X射线等，以及多种人为辐射源，如肿瘤放疗、核医学检测和核工业、部分电子产品产生的电磁波、微波、装饰材料的射线，等等。研究[3][4][5][6]表明，多种辐射成为人类亚健康、疾病甚至癌变的始动或诱发因素。约65%-75%[7]的临床肿瘤患者需接受放射治疗，放疗的副反应可加重患者症状，干扰放疗的进程。 辐射可导致人体免疫、血液、生殖及其他多系统损害，其根本原因是导致DNA这一重要射线靶的损伤，稳定破坏。若损伤轻，则机体启动修复机制，在一定情况下可自行修复，实现稳定的重建;若受损重，不能修复，或修复错误，导致癌变等远后效应产生[8]。 因而，探寻肾精与辐射后机体DNA修复的相关性，对从一个侧面揭示肾精的科学内涵，以及临床辐射损伤的防护，均具有重要意义。 (2) 临床和实验研究表明，补肾填精法能够促进辐射所致DNA损伤的修复，具有较好的抗辐射损伤作用。 ? 以往填精方药多融会于益气血和养阴法中。近年来，以补肾填精为主的治法在抗辐射研究中逐渐受到重视。 中医古籍中无辐射损伤防治理论和专门药物的记载，自20世纪60年代以来，国内和以日本为主的国外有关放射医学机构开展了一些研究工作。由于受西医思想影响，主以补血益气方药为主。以后，随着抗辐射和肿瘤放疗减毒增效中医药研究进展，填精、滋阴及清热等治法逐渐得到广泛应用。尤其是填精方药的研究逐渐受到重视[9][10][11][12][13][14]。填精药物既有女贞子、枸杞子、首乌、龟板、鳖甲、桑椹、熟地、山萸肉、菟丝子、黄精、刺五加等以及部分单味药的有效成分，如熟地、灵芝、枸杞等的多糖及有关提取物;又有一些含有补肾填精的复方，如自制方贞芪扶正颗粒、扶正增效方、滋肾活血方，古方六味地黄汤、知柏地黄汤等。 近年来，随着研究的发展，尤其是抗辐射成果大量运用于肿瘤放疗副反应的辅助治疗，以补肾填精为主防治辐射损伤取得较好的临床疗效。我们系列研究报道了补肾填精[15][16][17][18][19]为主的治法具有较好的抗辐射损伤作用;而临床肿瘤放疗辅助治疗中，补肾[20][21]填精法正逐渐成为重要法则之一。如兰氏在放化疗同时，辅以填精为主的补血汤(熟地黄、枸杞子、当归、黄精、女贞子、黄芪、鸡血藤、太子参、补骨脂等)治疗70例患[22]者，能明显升高外周血。童氏等以补肾填髓养阴组成的参芪杞胶合剂(熟地、枸杞子、 国家自然科学基金申请书 党参、黄芪、鸡血藤、阿胶等)观察200例放化疗患者,结果对升高白细胞具有较好作用。[23]张氏以填精补髓为主治疗放疗致白细胞减少105例，并设对照，结果取得良好效果。 ? 以临床为依据，从温病学论治急性辐射损伤，肾精亏损贯穿病变始终。前期从补肾填精立法进行抗辐射研究，显示该治法能够较好地调控p53基因及相关因子等表达，促进辐射损伤修复。 对于辐射损伤的病机，目前临床多认为射线为“火热毒邪”，易伤津液，可从外感[24][25][26]热病温病学角度论治。我们从临床角度认为，从温病学论治急性辐射损伤，应抓住射线此类热毒之邪具有致病重的重要特点，而非一般热邪，邪气极易直中脏腑，耗伤真阴，“生之本”肾精的亏损贯穿于病变始终，为病变之根本。肾精损伤，故不能生津化血，而为辐射所致津亏血虚之肇始，临床常表现口干舌燥、外周血下降等;肾精为元气之根，“精化为气”(《素问?阴阳应象大论》)，精亏不能化气，放射后常伴乏力等气虚之象;肾精亏虚，不能鼓邪外出，故初起可伴有热毒未尽之象而发热。若感邪深重，可出现不育，胎儿生长发育异常，脱发，耳聋，舌质干绛，甚至远期癌变等，则为肾精耗伤重之征象。 故而，结合辐射特点和临床肿瘤放疗治疗经验，从补肾填精立法，以张景岳左归饮为基础，组成补肾填精的代表方药——补肾填精方(熟地、枸杞、当归)进行研究。方中药物也是张氏填补真阴出现频率高的药物。 方中以熟地为君，为“精血形质中第一品纯厚之药”(《景岳全书?本草正》)，滋肾填精，养阴补血，“能补五脏之真阴，而又于多血之脏为最要得”(《景岳全书?本草正》);[27]临床证明熟地多糖能拮抗肿瘤放化疗毒副反应，升高外周血白细胞，增强免疫功能，促进贫血动物红细胞、血红蛋白的恢复，刺激多能造血干细胞(CFU-S)、红系造血祖细胞(CFU-E)和粒单祖细胞(CFU-GM)等的生长，能抗氧化，提高GSH?PX活性，降低过氧化[28]脂质(LPO)等。枸杞为臣，能增强熟地滋补肝肾之力，临床和实验证明枸杞及多糖能[29][30]提高放射后免疫和造血功能。当归为佐药，既能增强熟地滋阴养血之力，又能活血，有制约前药过于滋腻之用，当归多糖能保护放射损伤小鼠红细胞免疫和造血功能，其注[31][32][33]射液能减轻放射后小鼠卵巢颗粒细胞凋亡，提高辐射小鼠免疫功能。全方共奏补肾填精，滋养阴津之功。“补精以化气”“补精以生血”(《景岳全书?新方八阵》)，精足则气血旺，因而，本方还兼有化气生血之效。 [15][16][17][18][19]我们的前期研究显示，补肾填精方(即补肝肾益气血方)能改善一般情况(提高辐射动物30天存活率)、提高免疫(增加免疫器官重量)、清除自由基(升高GSH?PX、SOD活性，并能调控Camp)、改善造血(升高外周血像、促进骨髓有核细胞各细胞系恢复，降低骨髓有核细胞p53、capase-3蛋白表达，增强p21蛋白表达，促进造血微血管增生，使细胞周期发生阻滞)，且于辐射中后期效果最佳。结合临床和病机认识，辐射早期常可伴余邪未尽，故于辐射早期，我们于该方中增入黄芩(即补肾增效液)以清余邪，结果能诱导脾淋巴细胞p53基因表达,调控脾淋巴细胞p53蛋白和p21蛋白、caspase-3蛋白表达，降低其DNA裂解率，一定程度减轻生殖机能损害等。进一步从实验角度佐证了肾精亏损为主的辐射病机特点。 而左归饮加减广泛用于老年病、生殖、血液病以及脱发等临床防治，相关的实验报道表明该方能较好的保持DNA结构稳定、提高RNA转录活性、清除自由基、抑制骨髓微核、[34][35][36]防止染色体畸变、增强肝细胞SOD活性等。与我们从抗辐射损伤角度的一些研究不谋而合，也为本申请项目的研究提供了依据。 (3)ATM基因网络通路对促进辐射损伤后DNA的修复、维持DNA稳定发挥中心 国家自然科学基金申请书 调节作用。 其编码位于胞核的ATM蛋白激ATM基因为p53上游基因，广泛表达于人体多种组织, 酶，对射线高度敏感。也与肿瘤等的发生密切相关，并在肿瘤放疗中研究较多。目前最[37][38][39][40][41]新研究表明，辐射后，ATM被射线激活，启动DNA修复程序，通过激活下游系列基因和相关因子，控制细胞周期，促进DNA修复，是受照后DNA损伤反应的中枢调控因子。若修复失败，甚至修复错误，则极易诱发癌变。 ATM除可直接磷酸化下游p53蛋白，参与G1期调控，使其调控下游p21及有关效应蛋白表达，进行修复外，还有以下主要网络通路: ?调控重要因子chk2: ATM受射线激活后，启动ATM-chk2通路，参与G2/S期调控。同时，在chk2作用下，ATM磷酸化p53末端的Ser20残基位点，诱导P53被Mdm2释放，从而发挥细胞阻滞作用。 调控主要为磷酸化chk1和chk2，激活G2/M期关卡。 ATM参与G2/M期 chk2还可激活下游重要因子BRCA1，间接参与调控。 ?调控重要因子BRCA1: BRCA1受ATM和chk2激活后，直接或间接激活下游基因P21、P27、Gadd45等转录，可引起G1/S或G2/M期细胞阻滞。 BRCA1参与DNA损伤修复则主要受ATM或chk2磷酸化激活，与DNA损伤修复相关蛋白相互作用参与修复。当损伤严重而无法修复时，BACAl还可诱导细胞凋亡。 ?调控NBS1、RAD51和RPA: ATM可直接磷酸化Mdm2和NBS1，参与S期调控。 ATM激活调整RAD51参与损伤修复。 RPA是高度保守的单链DNA结合蛋白，在DNA复制、重组、修复中具有必不可少的重要作用。而ATM通过磷酸化RPA，参与其DNA损伤应答通路调节。 ?维持端粒稳定: 端粒是真核细胞内染色体末端的重复DNA序列，其长短和稳定性决定细胞的寿命，其中，端粒酶催化亚单位(hTERT)在维持染色体稳定中发挥了重要作用。而ATM与保持端粒长度有关。若ATM突变，可导致端粒的不稳定性，包括端粒连接、端粒染色质结构变化，影响端粒聚集等。而ATM蛋白下游底物c-Ab1同时能负调节端粒酶。 ?调节转录因子NF-κB: NF-κB为DNA损伤应答因子，ATM可调节IκB，从而激活NF-κB，参与DNA损伤的NF-κB修复通路调节，在细胞保护和DNA链断裂修复中发挥效应。 ?调控ROS: ROS能调节细胞的增殖分化和凋亡，并和多种细胞因子和调控基因互相影响，如NF-κB。SOD和GSH等可拮抗其对细胞的损伤。辐射可诱导ROS，而ATM蛋白在传递ROS所[3]致DNA大分子损伤中处于中心位置。 (4) 通过补肾填精法对辐射损伤后p53上游DNA调控中枢ATM基因信号网络干预，有利于从分子水平揭示肾精维持DNA稳定的本质和该治法抗辐射损伤的分子机制。 目前对肾精与DNA稳定的研究，以张氏为代表从抗衰老角度研究了补肾填精(仍以左归饮为代表)对老年肾虚鼠端粒长度、RNA转录、DNA TOPO?活性、DNA双链结构等影[34][35][36]响。而我们的研究则是从基因调控探索补肾填精与维持DNA稳定的关系，将DNA稳定与相关基因组稳定结合起来，通过寻找补肾填精干预下，在维持DNA稳定中相关基因调控网络的变化，能从更深层面揭示肾精的科学体质。并为下一步运用基因芯片技术， 国家自然科学基金申请书 通过差异表达分析，找出与修复关联的基因，并与ATM调控网络进行比照，从基因组层 稳定的本质研究奠定基础。 面揭示肾精维持DNA 而且，从中医治法角度，通过药物干预，探索肾精本质的方法，似为一条更符合中医特色的实证研究途径。较之单纯以动物模型为对象进行研究，更具有中医特色，更符合中医临床实际。虽然古代没有辐射概念，然精亏并非皆房劳使然，正如吴鞠通所说，“不藏精非专主房劳说，一切人事之能动摇其精者皆是。”(《温病条辨?原病篇》)，包括辐射在内的环境致病因素值得重视。 2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。 (1)研究内容 1、研究补肾填精法对辐射损伤ATM基因调控网络的影响: ? 观察对辐射损伤所致ATM基因转录和蛋白表达的影响; ? 观察对辐射损伤ATM基因构成的信号调控网络的影响: 重要因子chk2、BRCA1基因和蛋白表达情况; 相关因子NBS1、RAD51、RPA、hTERT与c-Ab1、NF-κB与IκB蛋白表达情况。 由于前期研究中已完成ATM基因p53通路和ROS通路的研究，故本研究基本不再涉及。 2、观察对细胞周期和细胞凋亡的影响:与上述研究结果结合，才能综合分析细胞阻滞和修复调控情况。 (2)研究目标 通过补肾填精法调控辐射所致ATM基因及相关因子表达的研究，明确药物的主要作 相互影响的因素，从分子水平揭示肾精维持机体DNA稳定的用点和作用环节及环节间 机制和补肾填精法法抗辐射损伤的机理。 (3)拟解决的关键问题 ? 补肾填精法与辐射损伤ATM基因及相关因子表达关系的确立:构成的调控网络关系的确立,是研究拟解决的最关键问题。 ? 辐射条件的控制:在通行辐射造模方法基础上,课题组反复摸索，已基本掌握了通过能(射线种类，即传能线密度)、量(射线剂量)、率(照射量率)、时(检测时间)等对辐射条件进行控制，达到实验设计的要求。并制作了专门的照射盒。 3、拟采取的研究及可行性分析。 (1)研究方法: 60? 辐射方法:运用我们前期研究方法，将动物放于我们特制的分格盒内,以C0γ射线一次性对小鼠全身照射，按照课题组已建立的造模方法，控制吸收剂量及量率。以对辐射敏感的外周血像(主为白细胞，尤其是淋巴细胞)下降判断造模成功。 ? 药物制备:补肾填精方由熟地、枸杞、当归组成，按照国家药监局新颁布的《药品注册管理办法》和《中药新药研究的技术要求》有关新药的工艺、质量标准及稳定性的技术要求，制成研究用补肾填精浸膏(1g/ml)，由我校中药药剂教研室提供。 国家自然科学基金申请书 研究时，药物组除设补肾填精组外，为便于比较佐证肾精的重要作用，根の丰床放疗副反应中医常用治则，设益气养血、甘寒养阴组对照，分别选取具有抗辐射作用的古 肿瘤放疗、化疗毒副反应的中医治则概述.方当归补血汤和沙参麦冬汤(高尔鑫,雷磊. 安徽中医学院学报,1994,13(1):61-64)。对照药物的制备同补肾填精组。 ? 实验动物:以健康6-8周龄、体重18-22g Balb/c小鼠为研究对象。该类动物遗传背景稳定，个体差异较小，便于受照后比较研究。为目前较常用的辐射研究动物。 ? 观察指标的检测方法: 脾脏和骨髓为辐射敏感组织，为辐射所致免疫和造血两大主要损害系统的主要代表组织之一，故取脾脏和骨髓，按具体方法的要求制作成待测样品后进行测试。 1)ATM基因表达的检测: [1]ATMmRNA检测:参考汤氏方法，加以改进，采用检测RNA灵敏度较高的荧光定量RT-PCR方法，取组织后，按有关程序提取RNA，针对ATM主要功能区PI3K进行引物设计，逆转录并PCR(RT-PCR)，最后对电泳结果照相，进行最后产物分析。 [2]ATM蛋白表达检测:运用流式细胞术结合Western blot进行检测。 2)chk2和BRCA1表达检测: [2][3]参考Zhou氏方法，采用Western blot法和原位杂交检测基因和蛋白定量表达。 3)NBS1、RAD51、RPA、hTERT和c-Ab1蛋白表达:采用目前这类指标较为通行的检测方法，hTERT用Western blot法，其余蛋白用免疫组化，并结合图象分析。 4)NF-κB和抑制物，κB家族蛋白的检测:采用免疫电泳迁移率改变分析法(EMSA)[4]和Western blot法。主要为NF-κB,65和，κB,等成员的检测。 5)细胞周期和细胞凋亡的检测:运用流式细胞术进行检测,并进行定量分析。 外周血常规检测运用全自动血球计数仪。 附检测方法主要参考文献: 60[1] 汤屹，刘文励，周剑锋，等.HL-60和SiHA细胞株ATM表达量与Co照射后细胞周期阻滞之间的关系.癌症,2003,22(7):700-704 [2] Zhou JF,Liu WL,Sun L,etal.Multiple defects of cell cycle checkpoints in U937-ASPI3K,an U937 cell mutant stably expressing anti-sense ATM gene cDMA.J Tongji Medical University,2000,20:273-276 [3] 温进坤,韩梅.《医学分子生物学理论与研究技术》,北京:科学出版社,2002,72-130，270-272，204-240 [4] 王群英，陈村龙，王继德，等.双歧杆菌对溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜内细胞因子表达和,,κ,激活的影响.中华微生物学和免疫学杂志,2004,24(1):40-43 (2)技术路线: ? 动物分组: 随机选取健康6-8周龄、体重18-22g Balb/c小鼠，雌雄各半(由我校实验动物中心提供)。 动物随机分为5组:正常对照组，病理模型组，补肾填精组，益气养阴组，甘寒生津组，每组小鼠24只。 ? 给药方法: 采取灌胃给药方式。补肾填精和益气养阴、甘寒生津组按有关成人日用量与小鼠的体重体表面积比折算为等效剂量分别给予相应药物(见陈奇主编《中药药理实验方法》，人民卫生出版社，1994，P206)。正常对照组和病理模型组给予等容积生理盐水。 给药时间根の丰床辐射防护和肿瘤放疗实际情况和前期研究情况，结合本研究目 国家自然科学基金申请书 的，采取预防和治疗相结合的方式:每日1次，辐照前连续给药10天，照射后再给药3天。 ?造模、取材和指标检测: 60除正常对照组外，其余各组于给药10天后行C0γ射线一次性全身照射造模。 综合文献报道和我们前期研究，照后5天取材。取材过早，可兼夹余邪，非单纯虚证，取材过晚，则动物自身修复启动，影响药物干预后的研究。 基因和蛋白表达等检测取脾脏和股骨(冲骨髓)。血象检测取外周血。 ?主要检测路线图 正常对照 病理模型 补肾填精 益气养血 甘寒养阴 ATM基因 重要网络通路 NF-κB chk2BRCA1 NBS1 RAD51 RPA hTERT c-Ab1 IκB 细胞周期 细胞凋亡 (3)实验手段: 主要利用我校我院病理学等国家局科研三级实验室和合作单位四川大学人类疾病生物治疗教育部重点实验室，运用荧光定量PCR扩增仪(ABI公司)、彩色病理图象分析仪、蛋白质电泳装置、酶标仪、Bio Rad垂直电泳仪、凝胶成像系统、EPICS ELITE ESP 流式细胞仪(Coulter公司)等，及协作单位Co源机等进行研究。 (4)关键技术: 关键是先进的分子生物学技术的运用，进行基因和蛋白表达及磷酸化、细胞周期和细胞凋亡的检测，包括涉及核酸、蛋白质提取、引物设计等的荧光RT-PCR技术，Western blot法，流式细胞术，免疫电泳迁移率改变分析法，原位杂交和免疫组化，以及辐照技 国家自然科学基金申请书 术等，涉及放射医学、分子生物学、免疫学、病理学等范畴。 (5)可行性分析: ? 在前期的研究中，我们已经证实补肾填精法能够调控辐射所致p53及其相关下游因子p21和caspase3表达，促进受损DNA修复，延长细胞周期，调控细胞凋亡，并能清除自由基，提高免疫力，改善造血细胞和造血微环境，等等。并在国内《中医杂志》等核心期刊予以发表，有较高的影响因子和可信度。为本项目进一步从更深层面研究奠定了坚实的基础。 ? 补肾填精法于临床肿瘤放疗辅助治疗，取得了较好效果，为本研究奠定了基础。 ? 本研究选用的方法如RT-PCR、Western blot、流式细胞术，免疫电泳迁移率改变分析法、免疫组化等，都是当今细胞生物学和分子生物学中具有很高成熟性的技术，运用到本课题中从总体上是恰当的。只需在细节方面作一定调整，就能较好地运用于本课题。 ? 有本校及合作单位相关实验室提供本研究所需的实验条件，所需实验试剂能够从国内外有关试剂公司购买。 ? 课题组分工合理，有从事中医药、辐射防护、分子生物学、病理学等多学科研究人员，有较强的科研能力，能够熟练运用研究所需的实验技术。 因此，本课题无论是理论基础、实验方法、实验条件和材料等都是可行的。 4、本项目的特色与创新之处 (1)研究指标新:首次结合辐射损伤目前研究较为成熟的修复调控网络ATM基因及其下游相关重要调控因子，从基因mRNA和蛋白质表达水平研究中药抗辐射损伤机理; (2)立法具有新颖性:结合前期研究，从外感热病温病学角度认识辐射的病理，中心环节为肾精损伤，提出补肾填精为主的治疗方法; (3)研究思路富有中医特色:从中医治法着手，探讨肾精维持机体DNA稳定的本质。 5、年度研究计划及预期研究结果。 (1)年度研究计划 2006年1月,2006年6月:实验前准备，购置药盒，预试等; 2006年7月,2006年12月:ATM基因和蛋白表达的研究; 2007年1月,2007年6月:chk2 和BRCA1基因和蛋白表达的研究; 2007年7月,2007年12月:NBS1、RAD51、RPA、hTERT与c-Ab1蛋白表达的研究; 2008年1月,2008年6月:NF-κB和抑制物，κB家族蛋白的研究;细胞周期和细胞凋亡的研究。 2008年7月,2008年12月:综合分析数据，得出科学结论，撰写论文，结题。 ,2,预期研究结果 揭示肾精维持DNA稳定和补肾填精法抗辐射损伤的分子机制。学术上达到国内领先 国家自然科学基金申请书 水平。通过本课题的研究发表SCI或EI源文献1篇，核心期刊源文献3,4篇，参加有 -3次。拟培养研究生2名。 关国内外重要学术活动2 (二)研究基础与工作条件 1、工作基础 (1)研究课题基础: 本课题组长期从事中医药与辐射、肿瘤放疗的研究，积累了该方面较为丰富的研究经验。相关研究项目6项—— “中药益气血补肝肾对辐射损伤保护的研究”(四川省科技厅基金,2000-2002); “补肾养血解毒法调控辐射鼠淋巴细胞p53基因的研究”(四川省教育厅基金，2002-2004); “癌放、化疗增效减毒药物RFJ的开发研究”(四川省科技厅基金，2000-2003); “RFJ治疗放化疗白细胞减少症临床研究”(四川省中医管理局基金，2002-2004); “鸡血藤造血调控的物质基础及机制研究”(四川省科技厅基金，2003-2005); “八珍汤升白作用的现代分子生物学机制研究”(四川省中医管理局基金，1999-2001)。 其中，与本项目密切相关的2项研究为本申请项目奠定了坚实的基础: “中药益气血补肝肾对辐射损伤保护的研究”(四川省科技厅基金，2000-2002); “补肾养血解毒法调控辐射鼠淋巴细胞p53基因的研究”(四川省教育厅基金，2002-2004)。 (2)已取得的研究成果摘要: (3)相关论文: 已发表的相关论文8篇: 待发表的相关论文2篇: 2、工作条件 3、申请人简历