糖原合酶激酶3对蛋白磷酸酯酶2A催化亚基翻译及翻译后修饰水平的

糖原合酶激酶3对蛋白磷酸酯酶2A催化亚基翻译及翻译后修饰水平的 华中科技大学 博士学位论文糖原合酶激酶3对蛋白磷酸酯酶2A催化亚基翻译及翻译后修饰水 平的调节及机制研究 姓名:姚秀卿 申请学位级别:博士 专业:病理学与病理生理学 指导教师:王建枝 2011-05-25华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文糖原合酶激酶 3 对蛋白磷酸酯酶 2A 催化亚基 翻译及翻译后修饰水平的调节及机制研究 中 文 摘 要【背景】 (protein phosphatase-2A PP2A) 蛋白磷酸酯酶 2A 是一种具有多功能的酸磷酸酯，对蛋白质的丝氨酸/苏氨酸位点具有去磷酸作用。PP2A 由核心酶(结构亚基 A 和具催化活性的亚基 C 组成)和调节亚基 B 组成全酶。活性亚基翻译后可以进行磷酸化和甲基化修饰。PP2A 催化亚基(PP2AC)的羧基端 307 位点酪氨酸(Tyr)磷酸化/去磷酸化由蛋白酪氨酸激酶/酪氨酸磷酸酯酶调节，Tyr307 位点磷酸化后 PP2A 活性下降。PP2AC 羧基端 309 位点的亮氨酸(Leu309)的甲基化/去甲基化修饰由 PP2A特异性的甲基转移酶/甲酯酶调节，活性亚基的 Leu309 去甲基化后，PP2A 的活性下降。在阿尔茨海默病(Alzheimer disease AD)患者，PP2A 和糖原合酶激酶 3 glycogen (synthase kinase-3 GSK-3)分别是对微管相关蛋白 Tau 磷酸化修饰调节最为重要的蛋白磷酸酯酶和蛋白激酶，其活性调节失衡可造成 Tau 蛋白的异常过度磷酸化，从而导致 AD 样的病理改变。PP2A 活性在 AD 患者脑组织中明显下降，但其具体的分子机制仍不清楚。我们最近研究发现，GSK-3 可通过上调 PP2A 抑制因子-2(I2PP2A)的表达水平而抑制 PP2A 的活性。统计学资料显示，GSK-3 活性与 PP2A 活性呈负相关， GSK-3 与 I2PP2A 的相关性系数 R0.9158， I2PP2A 而与 相关系数为 R0.9166; PP2A 活性的相关系数为 R-0.7164。这些研究结果提示，GSK-3 可能还通过其它的途径调节 PP2A 的活性。【目的】 基于上述背景，本研究拟通过在整体和细胞水平调节 GSK-3 活性，检测 PP2AC 、Leu309 去甲基化水平(dmL309-PP2AC)以蛋白、Tyr307 磷酸化(pY307-PP2AC)及调节 PP2A 磷酸化和甲基化相关分子的变化，进一步阐明 GSK-3 调节 PP2A 活性的分子机制。【方法】 1华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 将选用小鼠神经瘤细胞株 N2a 和人胚肾细胞株 HEK293，给予磷脂酰肌醇 3-激酶抑制剂 wortmannin (WO，1μM 和 2μM，间接激活 GSK-3)或 GSK-3 的特异性拮抗剂 SB216763 SB， ( 5μM 和 7μM) WO 和 SB 联合给药; 或 或转染野生型 GSK-3β质粒、蛋白磷酸酯酶 1B(PTP1B)或蛋白酪氨酸激酶 Src RNA 干扰质粒、PP2A 甲酯酶(PME-1)或 PP2A 甲基转移酶(PPMT1) RNA 干扰质粒;或在整体水平，通过在 Sprague Dawley 大鼠脑立体定位注射 10 μl 的 100 μM WO 或 70 μM 的 SB 或100 μM WO 与 70 μM SB 联合给药;或 C57BL/6 小鼠海马脑立体定位注射 2μl 表达 还选用了 GSK-3β 基因敲除的杂合子小鼠GSK-3β/- mice野生型 GSK-3β 的慢病毒;为研究对象。采用免疫印迹方法(Western blotting)检测以上各样品中 PP2AC 、pY307-PP2AC 水平，dmL309-PP2AC 水平，PTP1B、Src、CREB、PME-1、PPMT1及 PP2A 调节亚基(PP2AB)的蛋白水平。免疫组织化学的方法检测了表达 GSK-3β慢病毒后小鼠海马 pY307-PP2AC、dmL309-PP2AC 和总 PP2AC 的变化。免疫共沉淀的方法检测了 PTP1B、Src、PME-1、PPMT1 与 GSK-3β 的相互作用。ELISA 方法检测总的蛋白酪氨酸磷酸酯酶的酶活性以及 PTP1B 和 Src 的酶活性。RT-PCR 方法检测了 PP2AC、PTP1B、PME-1 和 PPMT1 的 mRNA 水平。【结果】 当给予 PI3-K 抑制剂 WO 处理后，pS9-GSK-3β 水平下降;PP2AC 蛋白水平降低;pY307、Src 蛋 白水平增加、PTP1B 蛋白水平下降，PTP1B 的酶活性降低;dmL309、PME-1 蛋 白水平增加，而 PPMT1 蛋白水平下降;PP2AB 蛋白水平降低。而当给予GSK-3 的 特异性拮抗剂 SB 处理后，pS9-GSK-3β 水平上升;PP2AC 蛋白表达水平增加; Src pY307、 蛋白水平降低、PTP1B 蛋白水平增加，PTP1B 的酶活性增加;dmL309、 PME-1 蛋白水平降低，PPMT1 蛋白水平增加;PP2AB 蛋白水平升高。且 SB 能 逆转WO 诱导的上述各指标的变化。而 WO 或 SB 处理对 Src 的活性没有明显的 改变。过表达 GSK-3β 野生型质粒后，PP2AC 水平下降;pY307、Src 水平升高， PTP1B 蛋白水平下降;dmL309、PME-1 蛋白水平增加，PPMT1 蛋白水平下降。 GSK-3β/-小鼠海马样品中检测到 PP2AC 水平升高;pY307、Src 蛋白水平降低， PTP1B 蛋白水平升高;dmL309、PME-1 蛋白水平降低，PPMT1 蛋白水平升高。 下调 PTP1B 的表 2华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文达水平后能逆转 SB 诱导的 pY307 下降，而下调 Src 的表达后不能消除 WO 诱导的 下调 PME-1 的 表达后逆转了 WO 诱导的 dmL309 增加，pY307 的改变; 而下调 PPMT1的表达 少。GSK-3β 与 PTP1B、PME-1 存在相互作用并逆转了 SB 诱导的 dmL309 的减 能磷酸化 PTP1B、PME-1 的丝氨酸位点。给予 WO 处理后，可使 PP2AC、PTP1B、 PPMT1 的 mRNA 水平下降，PME-1 的 mRNA 水平增加;而给予 SB 处理， PP2AC、PTP1B、PPMT1 的 mRNA 增加，PME-1 的 mRNA 水平下降;同时， SB 能逆转 WO诱导引起的 PTP1B 、PPMT1 的 mRNA 水平下降和 PME-1 的 的蛋白表达水平;下调 mRNA 水平升高。另外，给予 SB 处理后，还增加 CREB CREB 蛋白表达水平后，可逆转 SB 诱导的 PP2AC 蛋白水平的增加。【结论】 影 响 PP2AC 的 mRNA GSK-3β 可通过分别调节 CREB 蛋白水平和 PTP1B 的活 性，和蛋白表达及其 Tyr307 磷酸化水平。通过调节 PME-1 和 PPME1 转录和蛋 白表达，GSK-3β 改变 PP2AC 的 Leu309 去甲基化水平。此外，GSK-3β 还可调 节 PP2AB 的蛋白表达水平。由于 GSK-3β 和 PP2A 在 AD 患者的 tau 蛋白磷酸 化中起关键作用，我们的研究结果提示，调节 GSK-3β 可达到同时控制 PP2A 的 含量和活性，对 AD 药物研发有重要价值。【关键词】阿尔茨海默病，tau 蛋白， 糖原合酶激酶 3，蛋白磷酸酯酶 2A，PTP1B，Src，PPMT，PME-1，磷酸化，甲基 化 3华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 Effects of Glycogen Synthase Kinase-3 on Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Translation and Post-translational Modifications and the Underlying Mechanisms AbstractBackground Protein phosphatase 2A PP2A is one of major brain serine/threonine proteinphosphatases. In vivo PP2A predominantly exist as heterotrimers containing ascaffolding subunit A a regulatory subunit B and a catalytic subunit C. The highlyconserved carboxy-terminal sequence of the C subunit PP2AC can undergopost-translational modifications including phosphorylation and carboxyl methylation.Phosphorylation level at tyrosine-307 pY307 was regulated by tyrosine kinases andprotein tyrosine phosphatase1B PTP1B phosphorylation transiently inactivates PP2A.Methylation of PP2AC at leucine-309 Leu309 was catalyzed by specific PP2Amethyltransferase PPMT1 and its demethylation was catalyzed by specific PP2Amethylesterase PME-1. Demethylation of PP2A at Leu309 inhibits PP2A.Phosphorylation and methylation of PP2AC affects PP2A substrate pecificity targetingand cellular functions. Among the kinases and phosphatases glycogen synthase kinase-3β GSK-3β andPP2A are respectively the most implicated. It has been recognized that the imbalancedregulation of protein phosphatases and protein kinases is the direct cause of tauhyperphosphorylation. In the Alzheimer’s disease AD brain decrease of PP2A activityhas been reported but the molecular mechanisms are unknown. Our studies have shownthat a negative correlation between GSK-3β and PP2A was observed. Activation ofGSK-3β inhibits PP2A with upregulation of an endogenous PP2A inhibitor namelyinhibitor-2 of PP2A I2PP2A. In the study we noticed that the correlation values betweenGSK-3β and I2PP2A R0.9158 and between GSK-3β and PP2A R-0.9166 were muchhigher than the correlation value between PP2A and I2PP2A R-0.7564 implying thatGSK-3β may affect PP2A through multiple pathways in addition to regulating I2PP2A. 4华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文Objective It was aimed to investigate the effects of GSK-3β on PP2AC expression andposttranslational modifications including phosphorylation at Tyr307 and demethylation atLeu309 dmL309 in vitro and in vivo and the underlying mechanisms.Methods The human embryonic kidney 293 HEK293 and neuroblastoma 2a N2a cells wereused for the study. The cells were treated with wortmannin WO an inhibitor of PI3-K1μM and 2μM SB216763 SB an inhibitor of GSK-3 5μM and 7μM WO 2μMassociated with SB 7μM or transfected with plasmids expressing HA-tagged wild typeGSK-3β wtGSK-3β or pSilencer plasmids silencing gene of PTP1B or tyrosine kinaseSrc or PME-1 or PPMT1. WO 100μM or SB 70μM in a total volume of 10 μl wasinjected into 3-month-old Sprague Dawley SD rats’ left lateral ventricle or 2 μllenti-wtGSK-3β or lenti-eGFP were injected into the 3-month-old C57BL/6J C57 mice’hippocampus. GSK-3β heterozygous knockout mice GSK-3β/- mice which on theC57BL/6J background are viable and express reduced levels of protein and enzymaticactivity were used. Then proteins including PP2AC pY307 dmL309 PTP1B Src PME-1PPMT1，PP2AB and cAMP response element binding protein CREB were detected bywestern blotting. And the protein levels of pY307 dmL309 and PP2AC in mice’hippocampus injected lenti-wtGSK-3β or lenti-eGFP were detected byimmunohistochemistry. The association of GSK-3β with PTP1B Src PME-1 and PPMT1were measured by co-immunoprecipitation. Activity of PTP1B and Src was analysed byELISA. The mRNA levels of PP2AC PTP1B PME-1 and PPMT1 were detected viaRT-PCR.Results WO treatment or transfection with wtGSK-3β plasmid decreased the levels of PP2ACand PP2AB and increased pY307 and dmL309 while SB treatment increased PP2AC andPP2AB and decreased pY307 and dmL309 levels. PP2AC increased and pY307 and 5华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文dmL309 level decreased in the hippocampus of GSK-3β/- mice compared with C57 miceand simultaneous inhibition of GSK-3 by SB prevented the WO-induced PP2A inactivation.We also found that the level of Src and PME-1 increased and level of PTP1B and PPMT1deceased in WO treated groups and the levels of these proteins changed contrarily in SBtreated groups. We found that GSK-3β can modulate both PTP1B and Src in protein levelsbut it only inhibits PTP1B activity with no effect on Src activity. Furthermore onlyknockdown of PTP1B but not Src by siRNA eliminates the effects of GSK-3β on PP2AGSK-3β can modulate both PME-1 and PPMT1 knockdown of PME-1 or PPMT1 bysiRNA eliminates the effects of GSK-3β on PP2A. GSK-3β phosphorylates PTP1B andPME-1 at serine residuals and activation of GSK-3β reduces the mRNA levels of PTP1Band PPMT1 and increases PME-1 mRNA level. Additionally we also observed that GSK-3negatively regulates the protein and mRNA levels of PP2AC and knockdown of CREBabolishes the increase of PP2AC induced by GSK-3 inhibition.Conclusion GSK-3β regulates the expression of PP2AC via CREB and it also regulates the Tyr-307phosphorylation by PTP1B and Leu309 demethylation via PME-1 and PPMT1respectively. Therefore GSK-3β may inhibit PP2A activity through decreasing thecatalytic subunit expression and increasing the phosphorylation and demethylation.GSK-3 also regulates the expression level of PP2AB. As GSK-3β and PP2A arerespectively the most implicated kinase and phosphatase in AD-like tauhyperphosphorylation our data suggest that targeting GSK-3β may simultaneouslycorrecting the abnormality of PP2A.Key Words Alzheimer’s disease tau glycogen synthase kinase-3 protein phosphatase 2A PTP1B Src PPMT PME-1 phosphorylation methylation 6缩写词 英文名 中文名GSK-3 glycogen synthase kinase-3 糖原合酶激酶3PP2A protein phosphatase 2A 蛋白磷酸酯酶2APP2AC protein phosphatase 2A catalytic subunit 蛋白磷酸酯酶2A活性亚基PP2AB protein phosphatase 2A regulatory subunit 蛋白磷酸酯酶2A调节亚基 PP2A catalytic subunit phosphorylatedpY307-PP2AC 磷酸化的蛋白磷酸酯酶2A at tyrosine-307 sitePTPs protein tyrosine phosphatases 蛋白酪氨酸磷酸酯酶PTP1B protein tyrosine phosphatase1B 蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B PP2A catalytic subunit demethylateddmL309-PP2AC 去甲基化的蛋白磷酸酯酶2A at leucine-309 sitePPMT1 protein phosphatase 2A methyltransferase 蛋白磷酸酯酶2A甲基转移酶PME-1 protein phosphatase 2A methylesterase 蛋白磷酸酯酶 2A 甲酯酶CREB cAMP response element binding protein cAMP反应元件结合蛋白WO wortmannin 渥曼青霉素 3-24-Dichlorophenyl-4-1-methyl-1H-ind 3-24- 二 氯 苯 基 -4-1- 甲 基SB ol-3-yl-1H-pyrrole-25-dione SB216763 -1H-吲哚-3-基-1H-吡咯-25- 二酮AD Alzheimer’s disease 阿尔茨海默病PHF paired helical filament 双螺旋细丝NFTs neurofibrillary tangles 神经原纤维缠结SP senile plaque 老年斑shRNA small hairpin RNAGSK-3β/- mice GSK-3β heterozygous knockout mice GSK-3β基因敲RNA 小发卡 除杂合子小鼠wtGSK-3β HA-tagged wild type GSK-3β 野生型糖原合酶激酶3βECL enhanced chemiluminescence 增强化学发光BSA bovine serum albumin 小牛血清白 蛋白PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride 苯甲磺酰氟SDS sodium dodecylsulphate 十 二烷基磺酸钠DMSO dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜TEMED tetramethylethylenediamine 四甲基乙二胺Tris trishydroxymethylaminomethane 十三 羟甲基氨基甲烷DOC sodium deoxycholate 脱氧胆酸钠BCA bicinchoninic acid 二喹 啉甲酸AP ammonium persulphate 过硫酸铵FBS fetal bovine serum 胎牛血清WB western blotting 免疫印迹 Rreverse transcription-polymerase chainRT-PCR 逆转录- 聚合酶链反应 reactionPCR polymerase chain reaction 聚合酶链反应Co-IP Co-immuoprecipitation 免疫共沉淀法 PP2A 蛋白磷酸酯酶2A抑制因子-2I2 inhibitor-2 of PP2A 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师的指导 下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已标明引用的外，本 论文不包含任何其他人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果 由本人承担。 学位论文作者签名:姚秀卿 日期:2011 年 5 月 10 日 学位论文版 权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即: 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密?，在______年解密后适用本授权数。 本论文属于 不保密?。 ? (请在以上方框内打“?”) 学位论文作者签名:姚秀卿 指导教师签名: 日期: 年 月 日 日期: 年 月 日华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文第一部分 糖原合酶激酶 3 通过.