碱性磷酸酶ELISA方法

碱性磷酸酶ELISA方法 实验原理： 1. 在ELISA测定中，碱性磷酸酶的色原底物是对硝基苯磷酸盐(p-nitropheny-phosate，pNPP)。pNPP在碱性磷酸酶的作用下生成对硝基酚(pNP)，其在入＝405 nm处有最大吸收。 2. 由于较高浓度的无机磷可竞争性地抑制碱性磷酸酶的活性，所以用TBS体系，不能用含磷酸根丰富的PBS体系，否则会造成本底偏高。 3. 由于碱性条件下pNP的光吸收增强，并可使碱性磷酸酶失活，因而可使用氢氧化钠作为终止剂。 试剂： ELISA溶液体系： 1XTBS                       1L体系 H2O                          定容至1000ml Tris-HCl                                  6.06g            50mM          盐酸调 PH 7.5 NaCl                                      8.76g            150mM        包被液： 0.1M NaHCO3 (pH9.6)。过滤除菌，4℃贮存。 显色液： 1. 0.1M glycine pH 10.4 + 1mM MgCl2 + 1mM ZnCl2 配方：7.51g glycine + 203 mg MgCl2 + 136 mg ZnCl2 + 980 ml H2O，用浓NaOH溶液调至pH10.4，补水定容到1L。 2. 1 M diethanolamine（二乙醇胺）pH 9.8+ 0.5mM MgCl2 配方：97 ml of diethanolamine +100 mg MgCl2 + 800 ml H2O，用浓HCl溶液调至pH9.8，补水定容到1L。 显色液中pNPP终浓度为1mg/ml。 终止液： 配方：3M NaOH。 实验步骤： 1. 包被：用包被液稀释靶分子，4℃过夜或者37℃ 1h。TBS洗3次。 2. 封闭：2%M-TBS  37℃ 1h。TBS洗3次。 3. 结合：将表达菌用TBS重悬，超声后加入到孔中，37℃ 1h。0.5%TBST洗3次。 4. 显色：将显色液加入到孔中，3M NaOH终止（100ul显色液+25ul终止液） 实验结论： 两种显色液显色时间有区别，显色液1显色较慢，适合表达量较高或结合活性高的样本，同时实验平行性较好；显色液2显色较快，灵敏度较高。 Troubleshooting If the background is too high: 1. Use a blocking step prior to the application of the primary antibody. Normal Serum (5% v/v) from the same species as the host of the second antibody generally produces the best results. 2. Additional blocking agents for an ELISA are: a. 0.05% TWEENÒ 20 in 50mM TBS, pH 8.0. b. 1% BSA containing 0.05% TWEEN 20 in 50mM TBS, pH 8.0. c. 3% nonfat-dried milk in 0.01 M TBS. Do not use milk as a blocking agent when using avidin-biotin systems. 3. Use 0.05% TWEEN 20 in all washing and antibody diluent buffers. 4. Run control wells without the primary antibody to check for non-specific reactivity of the secondary antibody/alkaline phosphatase conjugate. 5. Adjust the titer of the primary antibody and/or the alkaline phosphatase conjugate to determine the optimal working dilutions. If no color develops or color is too faint: 1. Adjust the concentration of the primary antibody. 2. Adjust the concentration of the secondary antibody/alkaline phosphatase conjugate. 3. Determine if the enzyme conjugate is active by mixing a small sample of substrate and conjugate together in a test tube. 4. Increase the substrate incubation time or temperature. 5. Adjust the concentration of the coating antigen. 6. Consider using an amplification system such as avidin-biotin