应用荧光定量PCR产前诊断21三体综合征

应用荧光定量PCR产前诊断21三体综合征 624 ?论着 应用荧光定量PCR产前诊断21三体综合征? 广西医科大学第一附属医院儿科(南宁530021)经承学谢湘芝张茜许代娣 【摘要】目的建立荧光定量PCR技术产前检测21三体综合征.方法采用PCR方法同时扩增位于21号染色体上的人 肝型磷酸果糖激酶基因(humanliver-typephosphof~etokinasegene,PFKL-CH2.)和位于1号染色体上的人肌型磷酸果糖激酶基因 (humanmuscle-typephesphofruetkinasegene,PFKM—CHI),使用SYBRGreenI荧光染料处理产物,琼脂糖电泳后在凝胶成像系统进 行分析,得出扩增产物的荧光强度对比值.用此方法检测2o例21三体综合征患儿和21例正常人外周血及l1例孕妇绒毛或脐 带血.结果26例21三体综合征患儿PFKL-CH2l/PFKM-CHI扩增产物的荧光强度对比值为1.598?0.178,而正常人PFKL-Cl~/ PFKM-CH.扩增产物的荧光强度对比值为1.000?0.050,两者间差别有显着意义.10例孕妇绒毛或脐带血细胞DNA的PFKL— C/PFKM—CH扩增产物的荧光强度对比值均在1.00?0.10之间(正常人?2SD),1例为1.58,与染色体核型分析结果相符 合.结论SYBRGreenI荧光定量PCR技术产前检测21三体综合征具有准确,快速,安全,实用等特点,有较高的临床使用价 值. 【关键词】荧光定量PER;21三体综合征;产前诊断 【中图分类号】M14.55 Prenataldiagnosisof21trisomysyndromebyfluorescence quantitativepolymerasechainreaction JINGCheng-xue,XIEXiang-zhi,ZHANGQial1,XUDai—di. DepartmentofPediatrics,theFirstAffiliatedHospitalofGuan~MedicalUniversity(Nan,ang530021) [AtmmetlObjectiveToestablishaprenata1.diagnosismethodoffluorescencequantitative.PCRtodete ct21trisomyn由帅e.Metlmd Atfirst,onepairofprimertosimultaneouslyambdifferentfragmentsoftwohighlyhomologousgenes0ft hellI咖liver-typep}既;pl fructokinaselocatedO11cll】m080fne21(PFKL-CH~1)andthehumanmuscular-typephosphofruetokinaselocatedOild?0In【玲0lne1(PFKM-CHI) .Then,stainingthePCRproductsofthesehomologousgeneswithSYBRGreenI,comparingthefluoresc enceintensityafthebandsafterelectro- r,ho~is,analy~,~thedata.Wehaveusedthisapproachtodetect20casesof21trlsomysyndrome,21norIrl ~individualsand1leases0friskfe. tus.ResultsThetluoreseeneeintensityidativeratiosofPFKL-CH21/PFKM—CHIin21tfisomy,II聊 eandnormolindividualw1.589? 0.178and1.00?0.O5O.mspectivdy.Thediffemneebetweenthetwogroupswashighlysignificant.Ther atiovalueofthe10riskfetusw 1.01?0.1,amongthem,Oltleis1.58.Ourresultswel’ecop.sistentwithexpectationsmadebythe嘲 ofkarotyr~an由豳.CandusiomSYBR GreenIfluorescencequantitativepD1)rIntchainreactionisapractical,safe,preciseandrapidprenataldi agnosisapproachtodetect21缸主s唧 syndI?ne. 【KeyWords]21trlsomysyndrome;SYBRGreenI;FluorescencequantitativePCR;Prenataldiagnosis 21三体综合征(又称先天愚型或Down’s综合征)是小儿 最常见的染色体病.活产婴儿发生率为1/600,1/800.患儿 智能低下,发育落后及多发畸形成为A,JD残疾的主要疾病之 一 .目前无有效治疗方法,目前防治该病的重点在于认真开 展产前诊断,使致畸的出生率大幅度下降,从而提高我国人口 素质.现在I临床上常用的方法是提取绒毛,羊水或脐带血的 胎儿细胞进行培养,染色体核型分析.然而此方法技术要求 高,操作步骤繁杂,所需时间长,不适于孕妇大规模筛查.近 年来,国内外学者在探索准确简便,快速的产前诊断21三体 综合征的新途径.我们采用荧光定量PCR技术快速产前诊 ?广西科学研究与技术开发项目(桂科攻0143062) l研究生2妇产科 断21三体综合征,取得满意的效果,现报告如下. l对象和方法 1.1检测对象(1)孕妇选择:11例孕妇来自我校一附院优 生与遗传病门诊,年龄26,40岁.年龄>35岁和孕妇血清标 记物筛查21三体综合征阳性5例,生育过21三体综合征患 儿者6例.(2)20例21三体综合征患者来自我校一附院门诊 及病房,男16例,女4例,年龄1,8岁,有典型的21三体综合 征I临床表现,经过外周血淋巴细胞培养染色体G带核型分析 确诊为21三体综合征,其中标准型18例,易位型2例.(3) 广西医学20O4年5月第26卷第5期 21例正常人来自本院的自愿者,染色体核型正常,46,XY6 例,46,).(15例. 1.2方法 1.2.1提取基因组DNA(1)提取外周血或脐带血白细胞 DNA:21三体综合征患儿组及正常对照组采用本实验室常规 的酚,氯仿方法提取外周血白细胞DNA.孕妇组于孕2428 周抽取脐带血,脐带血白细胞DNA制备与外周血白细胞DNA 制备方法相同.(2)提取绒毛标本DNA:孕妇组在孕5665 天采集绒毛,去除蜕膜,取绒毛枝30,50Vg,研磨绒毛后用蛋 白酶K消化,在56~C孵育3.5小时,加等体积饱和酚,离心, 取上清液加等体积24:1氯仿/异戎醇混匀,离心,最后用无水 乙醇沉淀DNA. 1.2.2引物设计参照Lee等…的设计,选择21号染色体人 肝型磷酸果糖激酶基因(Pr_XL-CH2,)外显子8与1号染色体 的人肌型磷酸果糖激酶基因(PFKM-CH1)外显子9的一对引 物. 正向弓I物:5’.AACA1?A1?A,I?A,I?C(mAGICn-3’ 反向弓I物:5’-ACCCAGACGCI1GAACCACCAG(I’D3’ 扩增片段长度分别为185bp和345bp. 625 1.2.3荧光定量PCR取基因组DNAlvJ,引物各5pmd加入 25常规PCR反应体系中,用美国MJ-PIE-200PCR仪进行 DNA扩增,热循环条件为:94.C预变性5min,94.C变性40s,63 .c退火lmin,72.C延伸5min,循环24次.扩增完成后,取P(R 产物4.5,加入SYBBGreenI(1:lOOO)荧光染料琼脂糖凝 胶,然后用美国BIO-RAD公司生产的凝胶成像系统进行检 测,得出扩增产物的荧光强度相对比值. 1.2.4绒毛,脐带血细胞染色体核型分析按本实验窒常规 检测. 1.2.5统计学处理应用SPSS软件包处理. 2结果 3.1PCR扩增后电泳,21三体综合征患儿,正常人及孕妇均 可见两条DNA产物带(图1) 2.2用凝胶成像系统检测21三体综合征患儿及PCR产物, 得出扩增产物荧光强度相对比值.其结果显示21三体综合 征患儿PFKL-CHz,/PFKM-CHl荧光强度比值约为1.6;而正常 人比值约为1(图2).经统计学处理,与正常人组对比有极显 着性差异(P<0.001),详见表1. M:DNA分子量标准图2正常人两条扩增带峰面积图 1:正常人;4—6:孕妇;2,3,7,8:21三l本综合征患者 图1SYBRGreenI定理PCR检测21三体综合 电泳图结果 表1PFKL-CH2,/PFKM-CH.扩增产物荧光强度相对比值分析 2.410例孕妇绒毛及脐带血细胞DNA的PCR扩增产物检测 PFKL-CH2I/PFKM-CHI荧光强度相对比值,均在1.00?0.10之 间(正常人?2SD).1例孕妇脐带血细胞DNA的PCR扩增 产物检测PF’KI~CHz,/PFKM-CH,荧光强度相对比值为1.58(图 3) 2.5孕妇组每例均同时进行绒毛或脐带血细胞培养,染色体 核型分析,其结果为46,XY6例,46,).(4例,47,).(,一15,+t (15q21q)1例.每例染色体核型分析结果均与荧光定量PCR 结果相符合.冬1321体综合征胎儿两条扩增带峰面积图 626 3讨论 3.1近年来,国外学者成功地使用定量PCR方法检测了21三 体综合征,此后并应用于产前诊断0】.定量PCR方法的原位 是根据PCR反应指数增长特征,将PCR与荧光自动扫描相结 合,寻找扩增产物与样本原始靶核苷酸之间量的关系,达到后 者进行定量的目的.21三体综合征患者21号染色体的基因剂 量较正常人多二分之一,应用定量PCR的方法是可以检测出 来的.本研究应用荧光定量PCR检测21三体综合征患者,其 PFKL-CH2,/H~d-CHI的扩增产物荧光强度相对比值均为 1.5894-0.178;而正常人比值为1.000?0.050,与期望值的1.5 和1相近,且荧光定量检测结果与染色体核型分析结果一致, 说明荧光定量PCR可以用于产前诊断21三体综合征. 3.2在定量过程中须借助于参照物作为已知含量的标准. 位于21号染色体的人肌型磷酸果糖激酶基因(P删.CH2,) 及位于1号染色体的人肌型磷酸果糖激酶基因(PHKM.CH,) 编码序列有68%同源,将这一对基因在同一试管内进行PCR 反应,这样内参照既可以作为扩增系统的阳性对照,又可以作 为未知量靶序列的定量比标准,克服了PcR扩增率不稳定的 缺陷,能避免各管问的差异,从而达到较理想的定量”J.本研 究显示循环数?28个时,可以出现平台效应,将循环数定在 24个较适宜. 3.3SYBRG舢I是一种荧光染料,无毒,无放射性污染,它 能与双链DNA结合,特异性地渗入DNA双链后发射荧光信 号,而不渗入链中的SYBRGreenI染料分子不会发射任何荧 光信号,保证了荧光信号强度与PCR产物的扩增同步,故可 检测低浓度DNA及低循环次数,低靶目标数目的DNA扩增 产物. 3.4荧光定量PcR不需要进行细胞培养和烦琐的技术操 作,从取材到结果分析,可在1天内完成,大大缩短了产前诊 断的时问,为临床及时处理争取到时机.本研究表明:荧光定 量PCR技术是一种快速,准确产前检查胎儿三体型和易位型 21三体综合征的方法,有较好的临床实用价值. 参考文献 lLeeHH,(】mrIgJG,LiraSP,eta1.moftrisomy21k’ffi~ogous geneqIlaIIdvePCR[J3.HamGenet,1997,99:364—367. 2VermaV,bhedmuddF,LeedhamP,eta1.RapidandIawna~lDNA diagaosisofDown’sHIle[J].Lancet,1998,352:9—12. 3ZinanermannB,HolzgreveW,WenzelF,eta1.Novdreal—timequantlta- fivePCRtesttrisomy21[J].ClinChem,.48(2):362—363. 4GretchD,CoreyL,Wil9?J,eta1.A?图ntofhepatitisCviresRNA polymerasechainreactiort:high—tite~viIl~ectmdateswithadvanced strageofdisease[J3.111eJ~mal0fInfectionDisease,1994,169:1209一 l225. 5KiltieAE,RyallAJ.s?RGreen1岫dpul~dfielda sensitiveandinexpensivewayof~mdtatingDNAdoable—strandh?ks inmamIl~81lcdlsEJ3.NucleicAcidsResearch,1997,25(14):2945— 2946. 兔胚胎软骨细胞移植修复关节软骨缺损的初步研究? 广西医科大学第一附院脊柱骨病科(南宁530021)陆敏安杨渊一肖增明李世德 【摘要】目的采用兔胚胎软骨细胞培养移植修复关节软骨缺损,并对其组织形态学进行观察. 方法在成兔股骨内侧 髁作关节软骨缺损模型,实验组采用生物蛋白胶与胚胎软骨细胞相混后,植入兔膝关节实验 性软骨缺损区,对照组不做任何处 理或单纯用生物蛋白胶移植修补,分别于术后4,8,12周观察关节软骨缺损修复的情况,并对 其进行组织学评分.结果实验 组在胚胎软骨细胞移植8,12周后,于缺损区内可形成透明软骨,组织评分及效果评定优于对 照组.结论胚胎软骨细胞移植 组所产生的修复组织接近正常软骨组织,明显优于对照组. 【关键词】关节软骨缺损修复;胚胎;软骨细胞;移植 【中图分类号】Q132.8 Preliminaryexperimentalstudyontherepairofdefectsinarticular cartilagewithhomograftsofculturedembryonicchondrocytesinrabbits LUMin-an,YANGYuan,SIAOZ~g-ming,et口z.Affzli~dHospitalof0,lMedical.(Nanniag530021) 【Al瑚d】 Ob~fiveTo0b8enrethetissueafterthedamagedarticularcanikofrabbitswererepairedwithculturedembr yonicdlon- dID~e8.MethodsThemodeLs0f~fectsinarticularca1ageweremadeartificiallyinfemurmedialmalleo ]us0fmaturerabbits.The船p一 mentalgrouplepaiI耐byu她 themixture0ffibrinse_.alantandembryonicchondrocytes,howeverthecontrolgrtm~Wel’eIe删only ?广西壮族自治区自然科学基金项目(桂科自ooo7o56),广西区卫生厅课(桂卫z2~3o42) *广西右江医学院附院骨科**广西骨伤医院