蛙血清去蛋白提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[精品资料]

蛙血清去蛋白提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[精品资料] 蛙血清去蛋白提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用-精品资料 本文档格式为WORD,感谢你的阅读。 [摘要] 目的 探讨蛙血清去蛋白提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。 将SD雄性大鼠72只，随机分为6组:假手术组、模型组、奥德金组(20 mg/kg)和蛙血清去蛋白提取物高(90 mg/kg)、中(30 mg/kg)、低(10 mg/kg)剂量组。采用线栓法栓塞大鼠大脑中动脉建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，从术前7 d开始，每天1次，造模当天于手术前1 h给药，再灌注后1 h给药1次。分别用化学比色法测定脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量;酶联免疫吸附法(ELISA)法测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)含量;原子吸收分光光度法测定Ca2+含量;干湿重法测定脑组织含水量。 结果 模型组大鼠脑组织SOD、GSH-Px含量明显降低，MDA、TNF-α、IL-1β、Ca2+含量和含水量明显升高(P < 0.01);蛙血清去蛋白提取物能降低脑组织MDA、TNF-α、IL-1β、Ca2+含量和含水量，升高SOD、GSH-Px含量(P < 0.05)。 结论 蛙血清去蛋白提取物防治脑缺血再灌注损伤的机制与提高抗氧化能力、抑制炎症起始因子、阻滞Ca2+超载有关。 [关键词] 蛙血清去蛋白提取物;脑缺血再灌注;炎症因子;抗氧化 [] R96 [] A [] 1673-7210(2013)06(a)-0019-04 本研究选择两栖类的青蛙的血液作为研究对象，是由于蛙在冬眠时血液流动虽然很缓慢甚至停滞，但不会发生凝固和 栓塞现象，同时血液中的白细胞和葡萄糖含量更高[1-2]，而在秋冬寒冷季节脑梗死的发病率更是明显升高，因此开展的蛙血液对脑梗死的研究有着重大的现实意义。而现阶段，国内外对于蛙血液的研究仅限于对其血液成分的分析测定，其药理药效学方面尚无研究报道。因此，本研究通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，探讨蛙血清去蛋白提取物对脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制，为进一步深入进行临床的研究开发和应用提供理论和实验依据。 1 仪器与试药 1.1 仪器 离心机(上海安亭科学仪器厂);pH计(美国Thermo Electron公司);RE-52AAB型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);RF-530荧光检测器(日本津岛);AA-800原子吸收分光光度计(美国Perkin Elmer公司);Muhiskan MK3型酶标仪(芬兰Thermo Labsystem公司);UV-2100紫外分光光度计(上海尤尼科公司)。 1.2 药品与试剂 奥德金(小牛血清去蛋白注射液，锦州奥鸿药业有限公司);丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)试剂盒和考马斯亮蓝试剂盒(南京建成生物研究所);肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。 1.3 实验动物 SD大鼠，雄性，体重220,250 g，由广东医学院实验动物中心提供，生产许可证号:SCXK(粤)2008-0008，使用许可证号:SYXK(粤)2008-0007。动物饲养条件:自由取食，饮用自来水，环境温度18,22?，相对湿度40%,70%，自然照明。 2 方法 2.1 蛙血清去蛋白提取物的制备 取新鲜蛙血分离得到血清，加95%乙醇除去蛋白，减压除去乙醇，粗滤，加入适量胃蛋白酶和木瓜蛋白酶在特定的pH下酶解12,24 h，超滤，得到蛙血清去蛋白提取物。每1 mL含有固形物约50 mg。 2.2 动物分组及给药方式 将72只SD大鼠随机分为6组:假手术组、模型组、奥德金组(20 mg/kg)，蛙血清去蛋白提取物高剂量(90 mg/kg)组、中剂量(30 mg/kg)组和低剂量(10 mg/kg)组。每组12只，雌雄各半。腹腔注射给药，假手术组和模型组给予等量生理盐水。从术前7天开始，每天1次，造模当天于手术前1 h给药，再灌注后1 h给药1次。假手术组大鼠无死亡，模型组、高剂量组和中剂量组造模后24 h内死亡1只，奥德金组和低剂量组死亡2只。因此，各组大鼠实际入组数目为假手术组(12只)、模型组(11只)、奥德金组(10只)、蛙血清去蛋白提取物高剂量组(11只)、蛙血清去蛋白提取物中剂量组(11只)、蛙血清去蛋白提取物低剂量组(10只)。 2.3 大鼠脑缺血再灌注模型制备[3] 将大鼠麻醉固定，做颈部正中切口，分离右侧颈总动脉及颈内外动脉，结扎右侧颈总动脉及颈外动脉根部，用动脉夹夹闭颈内动脉远心端，由颈总动脉近分叉处剪一小口，插入头端光滑鱼线(直径0.23 mm)，插入长度(18?0.5)mm，实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血，结扎并固定线栓，逐层缝合肌肉和皮肤。2 h回抽线栓，实现大脑中动脉再灌注，造模完成。假手术组仅分离血管不插线栓，其余各组均按上述手术步骤进行。大鼠清醒后立即观察其行为障碍程度，以Longa等[4]的5分法为评分标准:0分为无神经缺损症状;1分为提尾时瘫侧前肢内收，不能全伸直;2分为向瘫侧作转圈运动;3分 为行走时向瘫侧倾倒;4分为不能自发行走，意识丧失。分值越高，脑损伤程度越严重。 2.4 脑组织SOD、MDA、GSH-Px、TNF-α、IL-1β含量测定 于再灌注后24 h将各组大鼠处死，断头取脑，取左侧大脑半球前半部，冲洗除去残血，吸干后立即精确称重。在冰浴上按1?9加入4?生理盐水，高速细胞粉碎机匀浆(14 000 r/min，30 s)，4000 r/min离心10 min，取上清液分装置于-20?冰箱保存备用。采用化学比色法按试剂盒测定SOD、MDA和GSH-Px含量。采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)按试剂盒说明书测定TNF-α和IL-1β含量。 2.5 脑组织含水量和Ca2+含量测定 取右侧大脑半球，称湿重后置于90?烤箱中烤至恒重，称干重，计算脑组织含水量:脑组织含水量=(烘干前重量-烘干后重量)/烘干前重量×100%。将烤干脑组织碾碎，精确称重，加入高氯酸(优级纯)6 mL和硝酸(优级纯)1 mL，12 min后，加热消化，蒸干成盐状，去离子水定容，火焰原子吸收法进行脑组织Ca2+含量测定。 2.6 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行处理分析。所有实验数据用均数?标准差(x?s)示。神经功能缺损评分用Wilcoxon法秩和检验，多组间比较用单因素方差分析，两两比较方差齐时用LSD检验，方差不齐时用Dunnett's T3检验。以P < 0.05表示差异有统计学意义。 3 结果 3.1 各组大鼠脑缺血再灌注损伤神经行为评分比较 脑缺血2 h再灌注24 h后大鼠神经功能缺损主要表现为左前肢屈曲，肌张力降低，侧推阻力降低，活动减少，向左侧追尾转圈，伴或不伴有右侧Horner征。假手术组没有神经功能缺损。与模型组相比，蛙血清去蛋白提取物高、中剂量组 神经损伤程度明显改善，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表1。 表1 各组大鼠脑缺血再灌注损伤神经行为评分(分，x?s) 注:与模型组比较，*P < 0.05，**P < 0.01;“-”表示无数据 3.2 各组大鼠脑组织SOD、MDA和GSH-Px含量的比较 模型组大鼠脑组织SOD和GSH-Px含量明显降低，MDA含量明显升高，假手术组与其比较差异有统计学意义(P < 0.01)。蛙血清去蛋白提取物高、中剂量能升高脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织的SOD、GSH-Px含量和降低MDA含量，且存在一定的量效关系，与模型组比较差异有统计学意义(P < 0.05)。见表2。 3.3 各组大鼠脑组织TNF-α和IL-1β含量的比较 模型组大鼠脑组织TNF-α和IL-1β含量明显升高，假手术组与其比较差异有高度统计学意义(P < 0.01)。蛙血清去蛋白提取物高、中剂量能降低脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织的TNF-α和IL-1β含量，且存在一定的量效关系，与模型组比较差异有统计学意义(P < 0.05)。见表3。 3.4 各组大鼠脑组织含水量和Ca2+含量的比较 模型组大鼠脑组织含水量和Ca2+含量明显增加，假手术组与其比较差异有高度统计学意义(P < 0.01)。蛙血清去蛋白提取物高、中剂量能显著降低模型组大鼠脑组织含水量和Ca2+含量，且存在一定的量效关系，与模型组比较差异有统计学意义(P < 0.05)。见表4。 4 讨论 脑缺血再灌注损伤是一个十分复杂的病理生理过程，包括许多环节和层次，如细胞内钙超载、氧化应激、炎性反应等，这些损伤机制在细胞的坏死和凋亡的发生机制中扮演了十分重要的角色[5]。 氧化应激是脑缺血再灌注后组织损伤的主要原因之一，特别是氧自由基学说在其中占有重要地位[6]。脑缺血再灌注后自由基的连锁级联反应触发，大量的氧自由基产生释放，攻击膜蛋白质，核酸及生物膜上的不饱和脂肪酸，参与脂质过氧化过程，产生脂质过氧化物，造成细胞损伤。MDA是脂质过氧化产物，可直接反映细胞受自由基攻击的严重程度。而SOD、GSH-Px是两种能有效清除体内单线态氧、超氧阴离子、羟自由基等多种自由基的抗氧化酶，其含量的高低反映了机体清除氧自由基的能力[7]。 在脑缺血再灌注损伤的炎性反应方面，损伤区的内皮细胞、神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞及血管周围炎症细胞被激活，释放TNF-α和IL-1β而触发炎性反应，随后释放趋化因子白细胞介素-6和白细胞介素-8，这些细胞因子与其他炎性代谢产物共同促使白细胞释放大量蛋白水解酶、氧自由基和其他效应分子，这是造成脑损伤的重要病理机制之一，所以，TNF-α和IL-1β作为炎性反应的起始因子，在脑缺血再灌注损伤中具有重要作用[8]，检测其含量对衡量脑缺血再灌注损伤有着重要意义。 缺血组织恢复血供后使细胞内Ca2+含量显著增高，并引起细胞损伤的现象称为钙超载[9]。脑缺血再灌注后细胞内Ca2+超载参与了细胞凋亡的诱导，是缺血性神经元凋亡的最后共同通路[10]。细胞内Ca2+的异常积聚激活了一系列细胞内事件，如激活钙依赖性酶类的酶促反应、自由基的形成、线粒体膜降解及功能紊乱、细胞色素C和凋亡诱导因子的释放等，最终导致细胞不可逆性凋亡。因此，测定用药后脑组织细胞内Ca2+的含量，对阐明药物保护脑细胞的作用机制非常重要。 脑水肿是脑缺血再灌注损伤的基本病理变化，是由于脑内微血管结构发生改变，毛细血管通透性增加，脑实质内过多液体的异常积聚，可导致神经细胞出现不可逆损害，是脑梗后非常严重的并发症之一[11]，脑含水量的测定是反映脑组织损伤的一个重要指标[12]。 本研究结果表明，蛙血清去蛋白提取物能明显减轻脑水肿，升高SOD和GSH-Px含量(P < 0.05)，降低脑组织 MDA、TNF-α、IL-1β和Ca2+含量(P < 0.05)，中剂量组的保护作用与奥德金组相似，高剂量组的保护作用更胜奥德金组，说明一定范围内存在着量效关系，应用高剂量的蛙血清去蛋白提取物能更好的保护脑缺血再灌注损伤。其机制是通过提高抗氧化能力、抑制炎症起始因子、阻滞Ca2+超载等多种途径抑制细胞凋亡，实现对脑缺血再灌注损伤的保护作用。 蛙血清去蛋白提取物是一种成分较复杂的混合物，有研究表明，动物血清去蛋白提取物的活性药理成分是磷酸肌醇寡糖和小分子激活肽[13]，且磷酸肌醇寡糖的浓度与动物血清去蛋白提取物活性成正相关关系[14-16]，因此，笔者推测蛙血清去蛋白提取物主要有效成分是其中所含有的小分子多肽类物质，但其具体活性成分仍有待进一步检测。 [参考文献] [1] 周贤君，代应贵，王开功，等.不同季节牛蛙血细胞变化的研究[J].贵州农业科学，2010，38(7):129-131. 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