前列腺素E1

前列腺素E1 前列腺素E1 对急性肺损伤肺组织核因子κB达的干预作用李利 方强 何非方 中华急诊医学杂志2006年4月第15卷第4期 【摘要】目的 建立急性肺损伤(ALI) 大鼠模型, 通过观察脂微球前列腺素E1 (1ipo-PGEl) 对肺组织核因子κB (NF-κB) 活化的调控作用和对血清中细胞因子表达的调控作用, 探讨PGE1对ALI的保护作用机制。方法 雄性SD健康大鼠45 只随机分成3 组,A 组: 生理盐水组;B 组:LPS 模型组;C 组:LPS+lipo -PGE1治疗组。各组分1、2、4h，3个时间点各5 只观察肺组织变化, 测定肺组织NF-κB 的表达及血清细胞因子TNF-α、IL-12、IL-10 浓度。结果 治疗组肺组织充血出血情况较模型组明显改善,NF -κB 表达显著降低,血清TNF-α、IL-12 浓度显著降低,IL -10 浓度明显增高。结论 前列腺素E1 通过下调NF-κB 的活性, 抑制炎症因子的表达从而减轻急性肺损伤。 【关键词】急性肺损伤; 前列腺素E1; 核因子-κB; 细胞因子 细胞核因子κB (nuclearfactorkappaB,NF -κB)是一种具有转录激活功能的蛋白质, 广泛存在于多种类型的细胞中, 可在炎症部位高度表达[1] , 在免疫和炎症反应中起着关键作用。近年来国内外大量研究均提示NF-κB 的激活在急性肺损伤(ALI) / 急性呼吸窘迫综合征(ARDS) 中起着关键性的作用,而前列腺素E1 ( ProstaglandinE1,PGE1 ) 具有调节炎症介质和抗炎因子的作用, 保护ALI/ARDS 患者。但PGE1是否可通过调控NF-κB 信号转导这一途径以抑制炎症介质的基因转录及其蛋白表达, 目前尚无研究报道。本研究应用脂多糖(LPS) 诱导大鼠ALI 模型, 预防性应用PGE1, 通过观察PGE1对肺组织NF-κB 活化的调控作用和对血清中细胞因子表达的调控作用, 来探讨PGE1对ALI 的保护作用机制。 1 材料和方法 1(1 主要试剂 脂多糖(LPS) 购自美国Sigma 公司,lipo -PGE1由北京泰德制药有限公司提供; 核蛋白提取试剂购自美国Pierce 公司, 兔抗大鼠NF-κBP 65多克隆抗体, 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG来源于美国SantaCruz 公司,IL -10,IL -12,TNF -α ELISA试剂盒购自北京艾森博奥科技发展有限公司。 1.2 实验动物及分组将45 只健康雄性SD 大鼠(200g 左右) 随机分成3 组,A 组( n =15 ) : 正常对照组,B 组( n=15 ) :LPS 模型组,C 组( n =15 ) :LPS+lipo -PGE1治疗组。以硫喷妥纳30mg/kg 腹腔注射轻麻大鼠后,A 、B 组尾静脉注射生理盐水0.5ml,C组将lipo-PGE1按10μg/kg 溶于0.5ml 生理盐水尾静脉注射,1h 后A 组腹腔注射生理盐水1ml,B 、 C 组将LPS 按6mg/kg 溶于1ml 生理盐水腹腔注射, 观察点为LPS 注射后1、2、4h (每一时间点各5 只) 。经胸骨正中行剖胸术, 观察肺部充血水肿情况, 心脏穿刺抽血2,3ml, 留血清于-80 ?保存备用。取出肺脏, 迅即置入液态氮灌中, 并于-80 ?保存备用。 1.3 核蛋白的提取及Western 印迹取肺组织约20mg, 液氮研磨后参照核蛋白提取试剂的操作步骤提取核蛋白, 参考相关文献进行Western印迹实验测定NF-κBP 65的表达[2] 。 1.4 细胞因子TNF-α、IL-10 、IL-12 的测定血清中的细胞因子用ELISA法测定。 1.5 统计学处理 统计资料采用SPSS10.0 统计软件包进行分析处理, 计量资料以( x ?s) 表示, 成组资料采用单因素方差分析, 进行方差齐性检验, 各组间相互比较采用q 检验, 以P <0 .05 为差异有显著性。 2 结果 2.1 肺组织肉眼观察 正常对照组肺组织呈粉红色, 无充血、水肿,LPS 模型组肺组织体积增大, 肺表面色泽暗红, 可见包膜下点状、片状出血, 切面疏松, 有黄色或淡红色液体溢出, 充血、水肿明显, 尤以4h 为甚;治疗组较LPS 模型组肺组织损伤明显减轻, 有轻度充血、水肿和散在包膜下出血。 2.2 肺组织核蛋白NF-κB 的表达LPS 模型肺组织NF-κB 的表达较正常对照组明显升高( P <0 .05) , 于2h 时点达到高峰; 治疗组较LPS 模型组的NF-κB 表达显著降低 ( P<0 .05) 。见表1 和图1。 2.3 炎症因子与抗炎因子浓度 结果显示LPS 模型组血清中TNF-α和IL-12 较正常对照组明显升高( P <0 .05) ,TNF - α于2h 达到高峰,IL -12 和IL-10 浓度于2h 后开始明显升高, 有统计学意义( P <0 .05) , 治疗组较LPS 模型组的IL-12,TNF -α浓度显著降低( P <0 .05) ,IL-10 浓度明显增高( P <0 .05) 。见表2, 表3,表4。 3 讨论 NF-κB 是杂合二聚体, 由两个亚单位组成。细胞中的NF-κB 与抑制蛋白INF-κB 结合在一起时不具有调节转录的能力, 当受到LPS 等胞外信号刺激时,I -κB 磷酸化降解,NF -κB 发生核易位, 与目的靶基因的启动子或增强子上特定的κB 系列特异结合, 从而促进相关基因的转录, 启动和调控一系列参与炎症反应的炎症因子基因表达, 介导ALI 等器官功能损害[3-5] 。TNF-α是NF-κB 介导表达的一种重要的促炎介质。LPS 注射后血清中TNF-α表达逐 渐增多,2h 达高峰, 与肺组织NF-κB 的表达呈正相关。因此, 可以推测LPS 通过NF-κB 途径, 放大机体炎症反应, 最后可能导致ALI 的发生, 表明NF-κB 的活化参与了ALI 的发病过程。 IL-12 具有多种生物活性, 可能是启动保护性免疫反应的关键性细胞因子[6] 。Mulligan等[7] 研究表明, 在ALI 模型中外源性的IL-12 抑制TNF-α的产生和中性粒细胞的激活, 阻止ALI 的发展, 但内源性的IL-12 却可以激活中性粒细胞, 促进肺部损伤。但最近的研究却认为IL-12 在缺血-再灌流引起的ALI 中扮演了重要的角色, 在炎症反应的早期和后期都是一个非常重要的前炎症因子[8-9] 。IL-10作为一种免疫抑制因子, 可以抑制多种细胞合成炎 症介质, 具有抗炎作用, 有明显缓解LPS 诱导的急性肺损伤的作用。在本研究中,LPS 模型组血清中IL-12 浓度于2h 时点后开始明显升高, 于4h 更加显著, 治疗组较LPS 模型组IL-12 浓度显著降低,也表明它可能在ALI 中扮演前炎症因子的角色, 但仍需要进一步的研究来解释这一现象。治疗组IL-10 浓度明显增高, 抑制了ALI 的发展, 推测PGE1可能具有上调IL-10 的作用。 前列腺素为花生四烯酸的衍生物, 具有广泛的生理及药理作用。前列腺素E1 (prostaglandinE1,PGE1) 是其中重要的一种。由于PGE1 具有抑制TXA2合成, 减少粒细胞及血小板在肺内聚集、改善肺微循环, 降低肺毛细血管通透性, 稳定溶酶体膜等诸多保护作用, 故可用于治疗急性肺损伤。本实验使用的lipo-PGE1是将PGE1封入脂肪球载体中制成的, 通过肺循环时不易失活, 且脂微球以其特殊的亲和力, 使PGE1聚集于病变部位, 具有靶向