口腔癌引流区淋巴结反应性增生与转移关系的研究道

口腔癌引流区淋巴结反应性增生与转移关系的研究道 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别中以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文是本人在四川大学读书期问在导师指导下取得的，论文成果归四川大学所有，特此声明。 由 学位论文版权使用授权书 指 枞渺墨 本学位论文作者完全了解四川大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权四川大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 跏菇汇编学位论文。学位论文作者签名:,勿簪签字日期:,矿厂,年叶月,(,日 签字日期?巧年，,,月,(, ,,学位论文作者毕业后去向工作单位: 联系方式:通讯地址: 邮政编码: 四川大学华西口腔医学院博士学位论文 英文缩略词表 缩略词 英文全称 中文名称,,, ,？,,,,,, ;,,, ;,,;,,,,, 鳞状细胞癌,, ,,,;,,,, ,,,,,,,,,,, 反应性增生,, ,,;,,,,,,,,,,,, 微转移,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, 白细胞分化抗原,,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,;,,,,,,, 尿激酶型纤溶酶原激活剂,,,—, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,;,,, , 转化生长因子,,,,,,; ,,,;,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,;,,, , 血管内皮生长因子 ,,,一, ,,,,,,, ;,,,—,,,,,,, ,,;,,,,， 基质细胞衍生因子一， 四川大学华西口腔医学院博士学位论文 口腔癌引流区淋巴结反应性增生 与转移关系的研究 博士研究生:刘华 导 师:李龙江教授 中文摘要 口腔癌是口腔颌面部最常见的肿瘤疾病，淋巴道转移是其主要播散途径，它的出现是口腔癌复发和预后不良的重要病理学标志。尽管有许多研究都在探讨与转移相关的问题，但是口腔癌转移的机理仍未明了。肿瘤转移早期的分子、病理变化是其转移过程的一个关键环节。了解肿瘤细胞与即将侵入的靶器官间的相互作用无疑是理解肿瘤转移早期过程的重要方面。 ,临床上，许多患者颈清术后病检发现淋巴结的反应性增生而未见癌转移。这种增生与肿瘤转移之间是否有着某种联系,正是本研究试图探索的问题。 目的:明确口腔癌引流区淋巴结反应性增生与肿瘤转移之间的联系。方法:标本取自,,,,年,月至,,月四川大学华西口腔医学院住院治疗的,,例口腔鳞癌患者，仔细收集所有患者术后的颈部淋巴结标本共,,,枚，并根据,,,,年美国耳鼻咽喉头颈外科基金学会标准进行分区:首先通过病理检测将淋巴结分为正常、反应性增生和转移三组，然后通过免疫组化的方法检测微转移，进而，采用免疫组织化学方法检测 , 四川大学华西口腔医学院博士学位论文与转移相关的细胞粘附分子(,,,,)、蛋白水解酶类(,,,)、免疫逃逸相关因子(,,,一,,)、血管,淋巴管生成因子(,,,,;)、趋化因子(,,,,,,和,,,,,)，结果使用,,,,,,(,进行统计学。结果:,,,,,,枚淋巴结病理检查为转移，,,枚反应性增生，,,,枚正常;正常粘膜上皮、鳞状细胞癌与转移淋巴结呈角蛋白强阳性，反应性增生与正常淋巴结的微转移检出率分别为,,,,,、,,,,,,;正常粘膜,,,,的表达明显强于鳞 癌与转移淋巴结，而转移淋巴结的表达明显强于病理检测阴性者，反应性增生的淋巴结总体,,,,表达强于正常淋巴结;正常粘膜对,,,、,,,一母,及,,,,;均为阴性或弱阳性反应，而鳞癌及转移淋巴结呈强阳性，三者在转移淋巴结的表达程度明显强于其它组淋巴结，反应性增生的淋巴结总体阳性表达强于正常淋巴结:正常口腔粘膜基本无,,,,,着色，而鳞状细胞癌呈明显的阳性反应，转移淋巴结,,,,,,的阳性表达水平远远高于未发生转移者:反应性增生的淋巴结总体阳性表达强于正常淋巴结。结论:?癌引流区反应性增生的淋巴结较正常淋巴结更易出现微转移;?反应性增生淋巴结,,,,、,,,、,,, , ,和,,,,;的表达水平介于转移淋巴结与正常淋巴结之间。?口腔鳞癌原发灶强表达趋化因子，而淋巴结表达与之相应的配体，尤其是转移淋巴结和反应性增生淋巴结强表达，表明,,,,,,一,,,,,生物学轴直接参与了口腔癌淋巴结转移。 综上述，本实验揭示出,,腔癌引流区淋巴结反应性增生是转移的前期表现，为继续深入研究口腔癌淋巴道转移的机制奠定了基础，并为临床上口腔癌早期颈部处理提供了治疗方式选择的客观指标和理论依据。 关键词:口腔癌;’淋巴结:反应性增生:转移 四川大学华西口腔医学院博士学位论文 ,,, ,,,,,,;,,,, ,, ,,, ,,,;,,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,,, ,,,, ;,,;,, ,,,,,,,,,, ,,;,,,,, ,,,,,,,:,,, ,,, ,,,,, :,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,;, ,,,, ;,,;,, ,, ,,, ,,,, ;,,,,, ,,,,,, ,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,,;,,, ,,,,,,，,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,,,; 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,, ,,, ,, ,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,, , 四川大学华西口腔医学院博士学位论文,,,,,,,,,; ,,, ,,,,,, ,,,,, ,,,,(,,,, ,,;, ,,,, ,,,, ,,, ,仃,,,,,,,,,,,,,, ,,, ;,,,,,,,,，,,,,, ,,,,, ,,,,, ,,,,;,,,,, ,,, ,,,,,,,,,; ,,,,, ,,,,, ,,,,, ,,,,,,, ,,, ;,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,一,,,,, ,,,,,,,;,, ,,,, ,,,,,;,,,,, ,,, ,,,,,,,,; ,,,,,,,,,, ,,,,,,;,,;,, ,,,,;,,,( ,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,，,,, ,,,,,,;, ,,,,,,,, ,,,, ,,, ,, ,, ,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,, ;,,;,, ,,,,,,,, ,,?澹?,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,(,,, ,,,,,,;, ,,,,,,, , ,,,,, ,,, ;,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,, ,, ,,,, ;,,;,,，,,, ,,,,,,, , ,,,,;,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,;,, ,,,,,,,,,, ,,, ;,,,,,,, ,,,,,,,,,,; ,,, ,, ,,,,,,,,, ,, ,,,;,,,,;,, ,,,, ,,,,,, ;,,;,, ,, ,,, ,,,,, ,,,,, ,, ;,,,,;,,( ,,,,,,,,:,,,, ;,,;,,;,,,,, ,,,,;,,,;,,,, ,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,, , 四川大学华西口腔医学院博士学位论文 刖 罱 口腔癌是口腔颌面部最常见的肿瘤疾病，淋巴道转移是其主要播散途径，它的出现是口腔癌复发和预后不良的重要病理学标志。大约,,,的口腔癌患者通过临床检查及手术发现有区域性淋巴结转移。据报道，伴有颈淋巴结转移的头颈肿瘤患者,年生存率明显下降，仅有大约,,,。肿瘤细胞由原发部位到发生转移扩散造成了癌症的高死亡率。事实上，,,,的癌症死因都是转移。 转移是癌细胞与宿主微环境相互作用的结果。口腔癌颈淋巴结的转移过程与大多数恶性肿瘤相似，包括:癌细胞间粘附能力下降，从原发瘤脱落:脱落的癌细胞与细胞外基质通过特异受体识别结合并相互粘附，释放多种水解酶类，使肿瘤细胞粘附的细胞外基质降解;癌细胞侵入淋巴系统循环管道，进入淋巴结;少部分的肿瘤细胞通过免疫逃避或免疫抑制机制而存活下来，在内皮细胞或基底膜滞留并粘着、增殖、形成转移灶:继续向远处淋巴结播散。 影响口腔癌转移的相关因素有年龄、部位、,分期、局部组织侵袭情况(如血管、淋巴管)、病理分级、 遗传因素(,,,突变、,;,—,,缺失)等。转移与细胞的粘附、迁移、着床、增殖等有关，然而，,,腔癌转移的机理仍末明了。肿瘤转移的早期分子、病理变化是其转移过程的一个关键环节。了解肿瘤与即将侵入的靶器官间的相互作用无疑是理解肿瘤转移早期过程的重要方面。 当淋巴结受到各种抗原刺激后， 可引起淋巴结内的部分或全部细胞成分增生、结构改变及淋巴结肿大。 这被称为淋巴结反应性增生。淋巴结的反应性增生常见于炎症及肿瘤， 有研究表明，癌引流区淋巴结反应 四川大学华西口腔医学院博士学位论文性增生与炎症引起的单纯性反应性增生的淋巴结在结构上存在差异…。 临床上，许多患者颈清术后常规病检发现淋巴结的反应性增生而未见癌转移。如果炎症不能完全解释口腔癌颈部淋巴结的反应性增生，那么这种增生与肿瘤转移之间是否有着某种联系,这就是本研究试图探索的问题。 随着肿瘤微转移研究的深入开展，以往许多常规病检阴性的淋巴结被证实有癌转移。微转移是指非血液系统恶性肿瘤在发展过程中播散并存活，在血循环、淋巴系统、骨髓及各组织器官中的癌细胞尚未形成明显癌肿，用常规临床病理学方法不能检测出来的病灶。许多研究表明，癌的微转移与患者预后密切相关。许多癌肿在手术后的微转移正是癌复发及转移的潜在原因。 转移过程包含了一个复杂的、存在于变异细胞的粘连、存活、蛋白水解、迁移、淋巴血管生成、免疫逃避及定植靶器官过程的相互作用。与口腔癌颈淋巴结转移相关的主要细胞因子包括:细胞粘附分子、蛋白水解酶类、免疫逃逸相关因子、血管,淋巴管生成因子、趋化因子。从理论上讲，原发灶癌细胞的各种代谢产物会通过血道或淋巴道扩散至周身，而势必会引起转移定植器官的病理结构变化。因此，我们拟从以下几个方面对口腔癌原发灶与颈淋巴转移之间的分子关系进行研究: ,(检测口腔癌微转移存在状况。 ,(检测口腔癌原发灶及转移灶的转移相关因子，以认识两者之间的关系。 ,(根据实验结果。科学分析，明确癌引流区淋巴结反应性增生与肿瘤转移之间的联系。 四川大学华西口腔医学院博士学位论文 实验一:口腔癌引流区淋巴结微转移的测定 转移是恶性肿瘤的一个重要生物学特征，也是影响肿瘤患者治愈率及生存率的主要因素。以往术后常规病理检查常常通过少数几张,,染色切片来诊断淋巴结有无转移，难免存在片面性和主观性，不可避免地造成漏诊。如某些，期癌症患者出现原发肿瘤切除术后颈部复发，究其原因可能并非淋巴结中不存在癌转移，而是其中的转移灶太小，组织学方法未能检测到，或是转移灶存在于未被选材的淋巴结组织中。自,,,,年首次在外周血中发现癌细胞以来，肿瘤微转移逐步引起人们重视。所谓微转移是指用常规病理学方法不能检出的非血液系统恶性肿瘤的转移。它对恶性肿瘤的诊断、分期、复发和预后的判断具有极其明显的指导意义，是制定综合治疗的重要依据。在不同的组织这一概念又有具体意义，如淋巴结微转移指常规组织学单水平淋巴结切片未能检出的转移;在血液中，常规方法不能检测出瘤细胞，故任何能检出的血循环中的瘤细胞均属微转移;骨髓的微转移则指在骨髓抽吸和活检标本中检出了瘤细胞，而患者无任何临床和放射影像学上远处或骨髓转移的证据者:肝、肺等组织器官中的微转移指常规检查方法如,,，,,，，单抗放射显影技术不能发现的微小肿瘤细胞灶。 微转移的肿瘤细胞常以单个或微小细胞团的形式存在。发生微转移的瘤细胞大多数在形态和功能上与原发瘤无明显差异，少数具有一定异质性。如转移的结肠癌细胞。其,,,,,,、,,,,、,,,、,,,的表达较原发灶明显增强，肿瘤本身的细胞骨架蛋白和粘附因子等也发生一定的变化。这些相关 基因及蛋白表达的变化对肿瘤微转移检测提供了一定的标志和帮助。 四川大学华西口腔医学院博士学位论文 口腔癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，尤以鳞状细胞癌为最多见，占,,,以上。口腔鳞癌的颈淋巴结转移是决定其预后最主要的因素之一，准确判断淋巴结有无转移，对了解病情、估计预后和辅助治疗有重要作用。 淋巴结反应性增生是指淋巴结受到各种抗原刺激后，引起的淋巴结内的部分或全部细胞成分增生、结构改变及淋巴结肿大。从理论上分析，癌细胞的各种代谢产物随着淋巴循环进入淋巴结，可造成该区域淋巴结的组织结构变化，表现出反应性增生。因此，最早出现转移的淋巴结很可能位于反应性增生淋巴结所在区域内。本研究将检测口腔鳞癌颈清术后淋巴结的微转移情况，并试图从结果中总结出反应性增生与微转移之间的关联。 材料及方法 ,(病例资料 收集,,,,年,月至,,,,年,,月间四川大学华西口腔医学院住院治疗的口腔鳞癌患者,,例，男性,例，女性,例:年龄,,,,,岁;病变部位包括颊、舌、口底、下牙龈及翼颌韧带区。 纳入标准:术前未经任何抗癌治疗的原发口腔癌患者;术前检查不伴有全身其它部位恶性肿瘤者:无自身免疫性疾病者。 所有患者均行根治性手术治疗，术后病理示鳞癌分化，级,例，鳞癌分化，，级,例，鳞癌分化，，，级,例。仔细收集所有患者的颈部淋巴结标本共,,,枚，根据,,,,年美国耳鼻咽喉头颈外科基金学会颈部淋巴结分区，，区,,枚，，，区,,枚，?，区,,枚，?区,,枚，,区,,枚。 ,(实验试剂 , 四川大学华西口腔医学院博士学位论文 鼠抗人,,，,,,,单克隆抗体(编号:,,一,,,,)、过氧化物酶标记的链霉素卵白素(,,)染色试剂盒(编号:,,一,,,,)及浓缩型,,,显色试剂盒(编号:,,，一,,,,)，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 ,(实验方法 (,)(组织处理及常规病理检查 ?新鲜外科切除淋巴结经,,多聚甲醛固定,,,天后，,(,，, ,,,(,,,,浸泡,分; ?组织脱水:,,,酒精,小时，,,,酒精,小时，,,,酒精， ,小时(,,,酒精，，过夜，纯酒精， ,小时，纯酒精,,,小时; ?组织透明:二甲苯，、，，各,,分:浸蜡,,—,,。,,小时; ?石蜡包埋; ?石蜡切片, ,,:每一标本连续切,,张，供病理检查及免疫组化检测用。 ?常规病理检查，将所有淋巴结分为转移、反应性增生和正常三类，本试验将转移组淋巴结排除。 (,)(免疫组织化学,,法检测非转移淋巴结内,,，,,,,角蛋白的表达。 ?石蜡切片常规脱蜡至水，,,, ,(,，, ,,,(,洗片,分钟: ?,,,,,:孵育,,分钟，室温避光，蒸馏水冲洗，,,,,浸泡,分钟: ?抗原修复:切片放入盛有抗原修复液(,(,,,枸橼酸盐缓冲液，,,,(,)的容器中，高压加热,分钟，自然冷却后，,,,洗片,分钟; ?封闭:正常山羊血清工作液封闭,,分钟，室温，不洗，倾去多余液体: ?直接滴加，抗(鼠抗人,,，,,,,单克隆抗体,:,,)，,”,过夜，,,,冲洗,分钟×,次; ?滴加，，抗(生物素化羊抗鼠，,,),,。,孵育,,分，,,,冲洗,分 四川大学华西口腔医学院博士学位论文钟×,次; ?链酶卵白素,,,, ,,?孵育,,分钟，,,,冲洗,分钟×,次: ?,,,显色，镜下观察进行，适时终止，自来水充分冲洗; ?苏木素复染,分钟，脱水透明，树胶封片。 ?,,,代替一抗作为阴性对照，正常口腔粘膜、鳞状细胞癌与转移淋巴结作为阳性对照。 (,)(统计学处理 微转移检测结果采用,,检验。 结果 ,(反应性增生检测结果 ,,,,,,枚淋巴结病理检查为转移，,,,,, ,,枚呈阴性，其中,,枚反应性增生(图卜,,卜,)，,,,枚正常。 表卜,淋巴结病理检测结果(单位:枚) ,,,,, ,一, ,,,,,,,,,;,, ,,,,;,,,, ,, ,,,,, ,,,,, ,(微转移检测结果 正常粘膜上皮、鳞状细胞癌与转移淋巴结呈角蛋白强阳性，染色部位位于细胞浆中，呈棕黄色。正常淋巴结中不含有上皮组织，只有当上皮组织进入淋巴结中才会有阳性反应。故发现有棕黄色染色即可判断为微转移。(图,—,,卜,,)。 ,,,枚病理检查正常淋巴结中,,枚发现微转移，,,枚反应性增生的淋巴结中有,,枚检测到微转移。比较两者的微转移检出率，具有统 四川大学华西口腔医学院博士学位论文计学意义。 表卜,微转移检测结果(单位:枚) ,,,,, ,—, ,,,,;,,,, ,, ,,;,,,,,,,,,,,, (四格表的,,检验,,,(,,,) 表卜,不同分区微转移检测结果(单位:枚) ～～～～～～二～堡～～～～～～～～,, ,,;,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,, (行,列表的,,检验。，、，，、?，区与?、,区的阳性检出率比较,,,(,,,) 讨论 一、淋巴结反应性增生 各种物质如细菌、病毒、毒物、变性的组织成分及异物等，进入淋巴结后可引起淋巴结内不同部位和细胞成分发生病理学结构变化，使淋巴结肿大，称为淋巴结反应性增生【引。依据反应性增生的部位及病理特征归纳起来主要有以下几种【,】。 ,(滤泡增生刺激,细胞的抗原物质主要引起滤泡的增生，其主要特点为:?滤泡大小不等，主要分布在皮质区且数量较多。?滤泡边 四川大学华西口腔医学院博士学位论文缘有淋巴细胞套呈同心圆样围绕，故滤泡周界明显。?生发中心的细胞呈多形性，排列有极向性，有较多的可染小体、巨噬细胞及核分裂像查见。?滤泡之间为成熟的小淋巴细胞或炎性细胞浸润。 ,(髓索增生髓索扩大，有多量浆细胞浸润。常见卢梭小体形成及其它炎细胞混杂，其中偶见少量浆母细胞，但淋巴结结构仍保留。 ,(副皮质区反应性增生此种增生多由一些引起,细胞免疫反应为主的抗原物质引起。早期病变尚限于副皮质区，滤泡受压，进展时则副皮质区扩大而呈弥漫性浸润，致淋巴结结构模糊不清。可有,种不同的组织学特征:?小淋巴细胞及高内皮细胞细静脉增多:?免疫母细胞增多性副皮质区扩大，并伴各种炎细胞浸润;?副皮质区结节状增生:副皮质区可见有,,,,,,,,,,细胞、组织细胞和指突状网状细胞等三种细胞的增生。 ,。多见于炎症和恶性肿瘤引流区域的淋巴结，主要表现为包膜下窦和髓窦的扩大，其中充满有吞噬现象的组织细胞。 ,(联合性反应性增生:即一淋巴结内同时有滤泡增生和副皮质区及髓窦的浸润，此种增生常不破坏淋巴结结构，多为感染引起。 有研究发现炎症引起的淋巴结单纯反应性增生与瘸引流区淋巴结反应性增生在组织病理学上有显着差异，前者淋巴滤泡增生显着，生发中心活跃，髓索内纤维结缔组织增生，大量网状纤维生成，淋巴窦扩张较轻，窦内多为淋巴液，,淋?拖赴喽栽錾,笳吡馨吐伺菹喽越仙伲?行牟换钤荆凰杷髟隹怼?龆啵浼溆写罅浚粤馨拖赴徒隙嗟拿庖吣赶赴錾,馨婉祭?琶飨裕寄谟卸嗔烤奘上赴邢嘤Φ囊裕浴?潞途奘上赴錾鞯脑纭?小?砥诟谋洹本实验中，,,枚反应性增.