亮氨酸脑啡肽对栉孔扇贝血细胞吞噬作用的影响

亮氨酸脑啡肽对栉孔扇贝血细胞吞噬作用的影响 亮氨酸脑啡肽对栉孔扇贝血细胞吞噬作用 的影响 第46卷第2期 2007年3月 湖北农业科学 HubeiAgriculturalSciences Vo1.46No.2 Mar..2007 文章编号:0439—8114(2007)02-0281—02 亮氨酸脑啡肽对栉孔扇贝血细胞吞噬作用的影响 刘东武,孙虎山 (1.山东理工大学分析测试中心,山东淄博255049;2.烟台师范学院生命科学学院,山东烟台264025) 摘要:向栉孔扇贝(Chlamysfarreri)血淋巴中加入不同浓度的亮氨酸脑啡肽(1eucine—enkephalin,L— ENK).研究其对栉孔扇贝血细胞吞噬杆菌作用的影响.结果表明,血细胞的吞噬能力随L-ENK浓度的 升高而增强,L-ENK能增强栉孔扇贝血细胞的吞噬能力,可作为一种较好的免疫刺激剂. 关键词:亮氨酸脑啡肽:栉孔扇贝:血细胞;吞噬作用 中图分类号:$944.4文献标识码:A EffectsofLeucine—enkephalinonthePhagocytosisAbilityofChlamysfa’S Haemocytes LIUDong—WU1,SUNHu-sha# (1.AnalysisandTestingCenter,ShandongUniversityofTechnology,Zibo255049,Shandong,China; 2,CollegeofLifeScience,LudongUniversity,Yantai,264025,Shandong,China) Abstract:Thephagocytosisabilitiesofhaemocyteswereinvestigatedafter1,5,50IxgmLLeu—enkephaline(L-ENK)were addedintothehaemolymphofChlamysfarreri.ThephagocytosisabilityofChlamysfarreri’haemocyteswasenhancedwith increasingconcentrationoftheL-ENK.Bybindingwithopioidreceptors,L—ENKparticipatedintheregulationand improvementoftheimmuneprocessesofChlamysfarreri. Keys:leucine—enkephalin;Chlamysfarreri;haemocyte;phagocytosis 双壳贝类不能产生特异性的抗体,吞噬作用在 其防御机制中起着重要作用,吞噬作用可引起呼吸 突发.进一步产生具有杀菌作用的氧自由基等活性 氧(包括超氧阴离子,羟自由基,单线态氧,过氧化 氢等),是贝类血细胞杀死被吞噬的病原菌等异物 的主要机制之--[I.内源性阿片神经肽是一类重要 的免疫调节因子,贝类的神经组织和血淋巴中均有 脑啡肽分子的存在_2_5].有关亮氨酸脑啡肽(1eucine— enkephalin.L-ENK)对栉孔扇贝(Chlamysfar’reri)血 细胞吞噬作用的影响,国内外尚未报道.本试验采 用荧光显微镜技术研究了L—ENK对栉对扇贝血细 胞吞噬杆菌作用的影响,从而为研究贝类的免疫机 理提供科学依据. 1材料与方法 1.1材料 栉孔扇贝购于烟台农贸市场,体长为45,55 mm红色杆菌为本实验室从海水中分离所得,试验 所用L—ENK为Sigma公司产品,其他试剂均为国产 分析纯. 1.2方法 用5号针头和5mL注射器从栉孔扇贝闭壳肌 血窦中取血.杆菌经无菌的过滤海水洗下,镜检计 数.并用无菌海水调至浓度为1.20x10个?mL,.分 别取浓度为100g?mL的L—ENK0.40L,20L 和200L加入3个离心管,再分别取混合血样200 L依次加入上述3个离心管中,然后加入不等量 的NaC1(2%),使试验组总体积均为400L,使L— ENK在血样中的浓度分别为1g?mL,,5txg?mL 和50txg?mL,;取混合血样200L,加入NaC1 (2%)200L,作为对照.10min后向各管中分别加 入10L杆菌液,室温下作用30min.涂片,空气干 燥,95%1~4J酒精固定10min,空气干燥,0.1%醋酸酸 化30S,0.01%吖啶橙(AO)染色10min,0.07mol?L 收稿日期:2006—09—28 基金项目:国家”973”项目(G1999012005) 作者简介:刘东武(1974一),男,山东单县人,助教,主要从事动物生理研究,(电话)0533—2786781(电子信箱)liudongwu@sdut.edu.cn. 282湖北农业科学2007年 KH2PO洗3次,每次1min,CaC12分化30S,然后滴 一 滴0.07mol?L,KH2PO,加盖玻片,荧光显微镜下 观察,计数吞噬杆菌的血细胞数,计算吞噬率. 2结果与讨论 在荧光显微镜下,血细胞的细胞核为黄色,细 胞质为浅绿色,杆菌为红色.杆菌附于血细胞的表 面,具吞噬能力的血细胞即伸出伪足将杆菌包围, 形成吞噬泡进人血细胞内部(图2).血细胞吞噬杆 菌的结果见图1.L—ENK浓度为0…1550tzg?mL 时,血细胞的吞噬率分别为26.9%,30.1%,31.1%和 37.0%.试验组血细胞的吞噬率均高于对照组,并且 血细胞的吞噬率随L—ENK浓度的升高而提高. (xl000,血细胞,吞噬杆菌) 图1栉孔扇贝血细胞吞噬杆菌过程 40 35 30 25 彗2015 l0 5 由于双壳贝类缺乏免疫球蛋白,在贝类机体的 免疫防御反应过程中.血细胞起着重要作用;血细 胞可通过吞噬,包囊,形成细胞结等细胞免疫反应 来清除和杀灭病原体ll】.血细胞吞噬能力的强弱是 贝类机体免疫防御能力的重要指标.当血细胞遇到 细菌,酵母菌等小颗粒的异物时,血细胞伸出伪足 吞噬这些小颗粒异物.异物被吞人细胞后与溶酶体 融合,最终被各种水解酶消化分解.异物进人贝类 体内被清除的过程包括识别,附贴,吞噬和降解等 几个步骤[63.Singh等人的研究结果表明.M—ENK和 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子协同作用.可使鼠腹 膜和脾巨噬细胞的吞噬活性增强[71.本实验结果也 表明,血细胞的吞噬能力随L—ENK浓度的升高而 提高;吗啡和p一内啡肽通过与受体结合可调节 四膜虫的吞噬活性l819],L—ENK通过与受体结合调节 蚯蚓阿米巴样细胞的吞噬和聚集活性?.因此.L— ENK对栉孔扇贝血细胞吞噬能力的影响可能也是 通过与血细胞表面的受体结合而起作用的. 参考文献: [1]周永灿,潘金培.贝类细胞和体液的防御机制研究进展lJ1.水 产.1997.27(4):449. [2]TOOCK,MURPHYPR,CROLLRP.Westernblottingof formaldehyde—fixedneuropetidesassmallas400dahonson gelatin—coatednitrocellulosepape~J】.AnalBiochem,1994,219 (2):341-348. [3]LEUNGMK,BOERHH,VANMINNENJ,eta1.Evidence foranenkephalinergicsysteminthenervoussystemofthe pondsnail,Lymnaeastagnalis[J].BrainRes,1990,531(1—2): 66—71. [4]STEFANOGB,LEUNGMK.Purificationofopioidpeptides frommolluscanganglialJ1.CellMolNeurobiol,1982,2(4): 347-352. [5]STEFANOGB,SALZET—RAVEILLONB,SALZETM. MytilusedulishemolymphcontainprodynorphinlJ】.Immunol Lett,1998,63(1):33-39. [6]MOORECA.CytochemicalaspectsofMercenariamercenaria hemocytes[J].BiolBull,1972,152:105-119. [7]SINGHPP,SINGHS.Protectionofmicefrommalariaafter CO-administrationofrecombinantmousegranulocyte— macrophagecolony——stimulatingfactorandmethionine—— 536. enkephalin[J].EurCytokineNetw,2001,l2(3):528— [8]CHIESAR,SILVAWI,RENAUDFL.Pharmacological characterizationofanopioidreceptorintheciliateTetrahy— mena[J】.JEukaryotMicrobiol,1993,40(6):800—804. [9]SAIAMANA,ROMANM,RENAUDFL,eta1.Effectof chronicopioidtreatmentonphagocytosisinTetrahymenalJ】. Neuropeptides,1990,l6(3):115—120. [10]RENZELLI—CAINR,KALOUSTIANKV.Evidenceforthe involvementofopioidpeptidesinphagocytosis,conformation, granulationandaggregationofimmunocompetentLumbricus terrestrisamoebocytes[J].CompBiochemPhysiolCPharmacol ToxicolEndocrinol,1995,111(2):205—211. (责任编辑万景辉)