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大鼠局灶性脑缺血模型制备及取脑方法实验研究_32270

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大鼠局灶性脑缺血模型制备及取脑方法实验研究_32270大鼠局灶性脑缺血模型制备及取脑方法实验研究_32270 大鼠局灶性脑缺血模型制备及取脑方法实验研究 [标签:来源] 【摘要】 目的:研究Wistar大鼠大脑中动脉脑缺血动物模型的规范制备方法和不同灌注方 法灌注取脑的对照研究,总结关键环节和注意事项。方法:结扎颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA), 不结扎翼腭动脉,用适当粗细的鱼线从CCA盲插入颈内动脉(ICA)直到阻断大脑中动脉,拔出 再灌注;规定时间4%多聚甲醛缓冲液心脏灌注取脑。结果:造模成功率高,造模动物临床表 现典型;非灌注固定取脑,脑组织结构保留差;短期灌注...
大鼠局灶性脑缺血模型制备及取脑方法实验研究_32270
大鼠局灶性脑缺血模型制备及取脑方法实验研究_32270 大鼠局灶性脑缺血模型制备及取脑方法实验研究 [标签:来源] 【摘要】 目的:研究Wistar大鼠大脑中动脉脑缺血动物模型的制备方法和不同灌注方 法灌注取脑的对照研究,总结关键环节和注意事项。方法:结扎颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA), 不结扎翼腭动脉,用适当粗细的鱼线从CCA盲插入颈内动脉(ICA)直到阻断大脑中动脉,拔出 再灌注;规定时间4%多聚甲醛缓冲液心脏灌注取脑。结果:造模成功率高,造模动物临床表 现典型;非灌注固定取脑,脑组织结构保留差;短期灌注固定取脑较好保留皮层和海马结构, 但深部白质及核团结构保留差;长期灌注固定保留结构都好,但耗时长,固定液用量大,进行 脑深部白质及核团结构研究效果好。结论:本模型制备方法易操作,注意事项详细,可信度 高;研究皮层和海马缺血再灌注损伤选择短期灌注固定取脑尚可满足需要,如需研究深部白质 及核团结构尚需长期灌注固定取脑。 【关键词】 缺血再灌注损伤;动物模型;脑 Abstract Objective: To explore a modified surgical approach to produce rat ischemia-reperfusion injury model and to study the perfusing fixative solution method of drawing the material, moreover, to summarize key points and critical items for attentions. Methods: After exposure and ligation of the common carotid artery (CCA) and the external carotid artery (ECA),the pterygopalatine artery were opened,the nylon string with its tip disposed was inserted into the internal carotid artery (ICA) from the common carotid artery.At defined time the rat was perfused with 4 % PFA buffer solution from heart , and then the rat brain was taken. Results: The rats developed typical symptoms and pathological manifestations after the surgery. Not perfusing fixative solution from the heart, the histological anatomy shape failed to remain well; short term perfusion of fixative solution kept better example cortex and hippocampus, but the white matter and the gray matter of the hidden poorly remained; long term perfusion could well keep them but took much time and used lots of solution, so a better effect could be achieved from the study on gray matter of the hiden. Conclusion: This method is reliable and easy to operate, with rich critical items for attention. The method of drawing rat brain by short term perfusing fixative solution can be used to study the cortex and hippocampus' ischemical reperfusion injury. To study the gray matter of the hidden, it is necessary and acceptable to take long term perfusing. Key words Ischemical reperfusion injury; Animal model; Brain 目前国内外采用的大鼠大脑中动脉脑缺血动物模型的制备方法有很多,最常用的便是线栓法。线栓法是Keizumi等[1]首先于1986年采用的不开颅经颈总动脉插入尼龙线导致大脑中动脉闭塞获得成功,随后在1989年,Longa对这种方法加以改进后广泛用于实验性脑缺血研究[2],但目前有许多实验室报告有较大的差异,而且实验中的取材方法对实验结果影响报道甚少。我们在实验中采用了Longa改进线栓法,结合实验过程和多次的大鼠解剖观察,分析模型制作过程的关键环节和注意事项,并对影响制备此模型的影响因素进行了探讨和归纳,以指导实验的化操作过程,并结合大鼠解剖学知识和死体解剖观察,研究标准化的心脏灌注固定操作方法。 1 材料与方法 1.1 实验动物 成年清洁级Wistar大鼠36只,雄性,鼠龄8月龄,营养良好,体重(280?20) g,由内蒙古大学实验动物中心提供(许可证号:SCXK(蒙)2002-0001)。利用随机数字表将大鼠分为单纯梗死组12只、梗死后2 h再灌注组12只、对照组12只(假手术组)。 1.2 线栓的制作 取直径0.26 mm日本产钓鱼线,打磨掉其头部的棱角,蘸熔化硬蜡(熔点在60 ?以上),在需要长度(距头端20 mm)处标记,将此线浸泡消毒,临用前用无菌生理盐水浸泡,再将头端浸于无菌37 ?肝素盐水中备用。 1.3 动物麻醉及消毒 乙醚诱导麻醉后腹腔注射10 %水合氯醛0.3 mL/100 g复合麻醉,背部皮下注射阿托品抑制粘液腺分泌。手术器械消毒备用,动物手术部位去毛并无菌处理,手术过程严格无菌操作。 1.4 手术步骤 (1)颈前正中切口,分离右侧颈总动脉(CCA)及颈外动脉(ECA)并暴露CCA分叉及颈内动脉(ICA)起始端,ECA以1号手术缝合尼龙线结扎;(2)距分叉1.5 cm处结扎CCA;(3)ICA下穿“线夹”(即穿线两头交叉不打结,用两把止血钳牵拉)暂时夹闭ICA以防止血液逆流出血;(4)在CCA结扎线与分叉之间备线打单结,避免碰到颈动脉窦,在CCA备线近心侧剪一小口穿入线栓,待线栓头端至ICA起始端被“线夹”挡住不能进入,此时打紧CCA备线单结,松开“线夹”,继续穿线栓入ICA(图1)[2];(5)线栓穿入方向为向头端偏内侧,这样可避免穿入翼颚动脉(如误入翼颚动脉处理见后),至线栓标记到分叉处时感穿线栓有阻力即插线栓成功;(6)进一步打紧CCA备线结扎紧线栓,以防不慎将其拔出或进一步插入导致不良后果,线栓在CCA外露约1.0 cm即可;(7)再灌注组于术后2小时再次麻醉打开切口,直视下抽出线栓约1 cm。假手术组只结扎CCA不导入线栓。 术中注意事项:(1)操作轻柔避免损伤过多组织,严格无菌操作。(2)清楚地分离血管和神经,避免损伤和结扎神经。(3)误入翼颚动脉时的判断:不能顺利插入线栓至标记,转动线栓有阻力,线栓尾端向内偏;处理及注意事项:退出线栓头端至ICA入口时重新插入;总插线过程时间不宜过长,以防动脉血栓形成。插线不宜用力过猛,防止穿破血管造成蛛网膜下腔出血。 1.5 术后评分 术后2 h动物麻醉苏醒后进行评分,参考经典的Zea Longa法(5级4分 法)[3]。0分:无神经功能缺损症状;1分:轻微神经功能缺损,不能完全伸展对侧前爪;2分:中度局灶性神经功能缺损,向对侧转圈;3分:重度局灶性神经功能缺损,向对侧倾倒;4分:不能自发行走,意识水平下降。2,4分为模型成功并入组继续后续试验;严重意识障碍者和少于2分者弃去并重新补入成功模型制备动物,继续后续试验。 1.6 观察终点及取脑 于插线栓进入大脑中动脉为计时起点,24 h时取脑。取脑采用两种不同的方法。 1.6.1 麻醉后断头冰浴取脑法 大鼠腹腔注射10 %水合氯醛0.4 mL/100 g深麻醉,用大鼠断头器迅速断头并将其置预先准备的冰盘内降低温度,尽快减少脑的热缺血时间,在冰浴中快速开颅,结合大鼠颅骨的结构(图2)[4],剪掉颅骨表面的皮肤和肌肉组织,用咬骨钳咬开枕骨大孔及枕骨,暴露出脑干和小脑以及两块顶骨的后缘,用钳夹每侧顶骨后缘向两侧搬开顶骨,暴露两侧大脑半球,然后用咬骨钳咬掉两侧颞骨及部分额骨大部分,露出脑组织。用眼科剪将脑干小脑侧颅神经剪断并剪开硬脑膜,轻轻撬起脑干再剪断颅底三叉神经和视神经将整个脑与颅底结构分离,最后剥离嗅脑并取出完整脑,置入4%多聚甲醛缓冲液继续固定。 冰浴取脑注意事项:速度要快;操作轻柔,取脑过程尽量保护脑组织不被挤压和切刺伤;剪开硬脑膜要彻底,避免硬脑膜牵拉损伤脑组织,如果硬脑膜与颅骨粘连要更加小心。 1.6.2 4 %多聚甲醛缓冲液心脏灌注取脑 灌注液配制方法:称取40 g多聚甲醛,置于三角烧瓶中,加入500,800 mL蒸馏水置加热至60 ?水浴锅内,持续搅拌使粉末完全溶解,需加少量的NaOH才能使溶液清亮。待多聚甲醛完全溶解液体清亮后,称取并加入NaH2PO4?2H2O 2.964 g、Na2HPO4?12H2O 29.012 g,搅拌至完全溶解,将液体倒入量筒,加蒸馏水定容至1 000 mL并调pH值为7.4,4 ?保存备用。 灌注取脑具体步骤:大鼠腹腔注射10 %水合氯醛0.4 mL/100 g深麻醉,固定于大鼠手术台,依次剪开左前胸皮肤、肌肉,暴露肋骨,在胸骨左缘剪断肋骨,拉开胸腔露出搏动的心脏,辨别左右心室(暗红色为右心室粉红色为左心室),用连接有生理盐水静脉输液器(已排尽空气)的9号注射针头在心尖部穿刺入左心室,灌注生理盐水200 mL,冲出血液后灌注4%多聚甲醛缓冲液约300,400 mL,灌注时见大鼠四肢抽动、尾巴翘起、头后仰,最后整个身体强直僵硬。整个过程需要1 h左右。灌注完毕取脑(方法同前)。整个灌注取脑过程须在通风厨或有换气扇的实验室进行。 灌注取脑注意事项:配置灌注液时最好待多聚甲醛完全溶解后加入NaH2PO4?2H2O、Na2HPO4?12H2O,否则会有部分多聚甲醛残留不溶,需用过滤才能除去。穿刺注射针头一定要入左心室,否则灌注将不成功;灌注前一定要排尽输液器内空气,否则可造成气体栓塞影响灌注固定效果;灌注完毕取脑亦宜在冰浴中进行。 2 结果 2.1 术后评分 用SPSS15.0软件对单纯梗死组、再灌注组、假手术组术后评分进行组间独立样本t检验,结果再灌注组评分高于单纯梗死组,差异有统计学意义(P<0.05)。单纯梗死组、再灌注组评分均高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.01)。详见表1。表1 各组大鼠术后评分 2.2 常规病理观察 将对照组的12只大鼠随机分为3组,进行同一灌注液不同灌注时间对脑组织病理改变影响的观察。 2.2.1 非灌注组 采用冰浴直接断头取脑然后整块脑组织浸泡入灌注液的方法。取材后肉眼观察,见脑组织呈红色,表面有血迹,质软;HE染色光镜观察,见大脑皮质神经细胞胞体大,核大、核呈三角形,核仁浓缩;海马锥体细胞1、2、3、4区神经细胞结构基本清楚,神经细胞变性、坏死严重,血管周围间隙不大,未见水肿液,见图3。皮质下脑白质及核团神经组织形态改变较重,细胞小、有固缩,核呈三角形、条形,核仁浓缩。见图4。 2.2.2 短期灌注组 采用心脏穿刺快速灌注20 min,其中生理盐水灌注50,100 mL,4 %多聚甲醛缓冲液灌注150 mL,然后断头在冰浴中取脑,然后整块脑组织浸泡入灌注液的方法。取材肉眼观察,见脑组织呈苍白色表面无血迹,质稍硬;HE染色光镜观察,见皮质神经细胞胞体大,核大、核仁清楚;海马锥体细胞1、2、3、4区神经细胞结构较清楚,未见变性、坏死,血管周围间隙不大,未见水肿液。皮质下脑白质及核团神经组织结构自溶改变较轻,偶见细胞小、核固缩。见图5。 2.2.3 长期灌注组 方法同短期灌注组,但是灌注时间延长到1 h,其中生理盐水灌注200 mL,4 %多聚甲醛缓冲液灌注400 mL,断头在冰浴中取脑,然后整块脑组织浸泡入灌注液的方法。取材肉眼:见脑组织呈苍白色表面无血迹,质硬;HE染色光镜基本同短期灌注组,只是皮质下脑白质及核团结构保护较前明显完整。见图6。 3 讨论 目前,研究缺血性脑损伤的主要途径是选择不同种属的动物通过不同的手段来建立脑缺血动物模型,再通过相应的干预手段研究缺血后的病理生理改变以及治疗措施的效果。在各种实验动物模型中,大鼠的脑血管与人脑血管最为相似,均由颈动脉和椎基底动脉系统共同构成脑底动脉环,再发出分支完成脑供血。由于应用大鼠制备脑缺血模型具有费用低廉、操作方便、动物耐受性好等优点,因此,大鼠是建立脑缺血模型的最适宜动物,在缺血性脑损伤研究中被广泛应用。经过几十年科研工作者的不断努力,脑缺血动物模型的制备已渐成熟。大鼠脑缺血模型的制作方法很多,目前在实验中应用最多的是线栓法。 关于大鼠大脑中动脉脑缺血动物模型的制备方法的研究比比皆是,但是作为实验研究有的规范操作起来不大可行,如廖维靖等[5]所述,模型建立条件要求很高,而且要求术者有相当的熟练程度,这些是在国内普通实验室难以达到的。如何完成这类实验的模型建立已成为同行者面临的课。1984年国际脑血管病委员会对此类动物模型提出了明确的手术和要求,手术方式要避免颅内组织暴露以减少脑部手术性损伤,即避免破坏颅内内环境的稳定性,模型设计单根血管可重复阻滞;阻滞血管引起的改变可从血流变化等方面进行观察;避免在血管阻塞期间使用巴比妥盐,利于观察神经功能障碍,同时可避免巴比妥盐的神经保护和影响血流的作用;尽量模拟人类病变;可再通的阻滞血管,需恢复60 %的再灌注。结合以上标准我们认为建立可信模型的关键是要有标准、科学的对照,通过实验研究发现,合理的对照和较大的样本量基本上可以控制好模型的质量。所谓的规范也只能是高级实验室的经验和体会,只能用来参考。通过预实验的手术训练,我们设计前文所述的分组方法,从大鼠神经功能缺损评分研究认为再灌注组的评分高于单纯梗死组,与蒋大海等[5]的研究一致。通过实验过程,我们将每个步骤的注意事项记述如上,与同行共勉。 关于模型建立后的灌注取脑问题前人研究甚少,可能在早期的病理学研究中涉及到。大多数人认为脑组织需要固定液灌注后取材以最大程度地保护结构不被自溶所破坏。但是,很多研究的灌注时间和灌注方法不尽相同。我们参照文献报道、免疫组化检测对组织固定的要求以及陈钟和等[6]的灌注方法后稍作改进,并设计了不同灌注方法的对照研究,结论如下:非灌注组组织结构保留差;短期灌注组脑组织结构保留基本良好,与长期灌注组相比稍差,研究皮层和海马结构损伤基本可以满足;长期灌注组结构保留最好,但是耗时长、固定液用量大,致使试验进度慢等缺点不容忽视。我们推荐,对皮层和海马缺血再灌注损伤研究选择短期灌注取脑尚可满足需要,深部脑白质及核团缺血再灌注损伤研究还是要用长期灌注固定取脑法,或者在取脑后立即根据实验取材要求将脑切成块再浸泡入固定液充分固定。 【参考文献】 [1] Koizumi J,Yoshida Y,Nakazawa T,et al.Experimental studies of ischemic brain edema.A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area[J].Jan J Stroke,1986,8:1-8. [2] 刘运权,戴颖.线栓法大鼠局灶性脑缺血模型的改进[J].中国临床解剖学杂志,2005,23(2):222-223. [3] Zea Ionga E,Weinsten PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomyin rats[J].Stroke,1989,20:84-91. [4] 杨安峰,王平.大鼠的解剖和组织[M].北京:科学出版社,1995:7. [5] 蒋海山,陆兵勋.线栓法大鼠缺血/再灌注脑损伤模型的改良[J].第一军医大学学报,2004,24(10):1156-1159. [6] 陈钟和,杨宝麟.神经组织切片技术指导[M].北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1994:14-16.
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