瘦素对肝细胞三酰甘油沉积的影响-临床医学论文

瘦素对肝细胞三酰甘油沉积的影响-临床医学论文 【摘要】目的观察瘦素对人L02脂肪变肝细胞三酰甘油(TG)沉积 的影响，探讨瘦素在非乙醇性脂肪性肝病发生、发展中的作用。方法 人肝L02细胞培养接种于50ml培养瓶中，用50%胎牛血清1640 培养基造模，时间24h。设立正常组、模型组、瘦素处理1，2，3组， 处理组瘦素浓度分别为10-7mol/L，10-6mol/L，10-5mol/L，分别处理 6h;再以10-6mol/L浓度瘦素建立时效关系分别处理(6，12及24h)。 每组均行油红“O”染色观察脂肪化情况，高效液相色谱测细胞内TG 含量变化。结果油红“O”染色显示50%的胎牛血清的1640培养基 24h能成功地制造肝细胞脂肪变性模型，加入瘦素处理后脂肪化程度 减轻。高效液相色谱显示细胞内TG明显减少，且与瘦素呈剂量、时 间依赖性关系。结论肝细胞脂肪变性时，瘦素能使肝细胞脂肪化程度 减轻，能减少肝细胞TG的沉积,对脂肪肝防治有一定的作用。 【关键词】脂肪变肝细胞;瘦素;三酰甘油 EffectsofLeptinonDispositionofTriglycerideinFattyLiverCells ZhouHongyu,YangXuefeng (DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospital,NanhuaUniversity,Hengyang421001,China) Abstract: ObjectiveToexploretheeffectofleptinontriglyceride'sdispositioninnormalandnonalcoholicinducedfattylivercell.MethodsL 02livercellswereculturedin50mlculturedish.Fattylivercellmodelsweremad ewith50%inactivatedembryobloodserumfor24hours.ResultsOilredstainingshowedthat50%inactivatedembryobloodserumcanmakefattylivercellmodel.AfterL 02livercellswereturnedintofattylivercells,leptinwasaddedtofattylivercells.TheHPLCshowedthatthemodelgroup'striglyceridedispositionincreasedclearly,butafterleptinwasgivenintothemodelcells,triglyceride'sdispositiondecreasedobviously,whichwaspositivecorrelatedwithleptin'sconcentration.ConclusionWhenliverL 02cellswereturnedintofattylivercell,leptincaninhibittriglyceride'sdisposition.Leptinhassometherapeuticeffectonfattylivercells. Keywords:fattylivercell;leptin;triglyceride 非乙醇性脂肪肝(NAFLD)是一种肝组织学改变与乙醇性肝病相类 似，但与饮酒无明确关系的临床病理综合征，根据其病理学改变及临 床表现分为单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化、脂肪性肝 硬化[1,2]。肝脏是体内参与脂质代谢的重要场所，肝脏选择性地摄取 血中的非饱和脂肪酸，经酯化合成三酰甘油(TG)，TG在肝细胞内， 一方面氧化供能，另一方面分泌入血转化为低密度脂蛋白(LDL)和 高密度脂蛋白(HDL)被其他组织利用。肝脏所含脂质绝大部分为 TG，各种致病因素可导致肝细胞内TG异常堆积而导致脂肪肝(FLD) 的发生。瘦素是肥胖基因(obesegene)编码的蛋白产物，其受体广 泛分布于脂肪、骨骼肌、肝脏、心、肺、胰、卵巢、睾丸等外周组织。 瘦素通过与受体结合而发挥作用[3]。瘦素的主要作用是调节机体脂 肪的稳定，抑制食欲、增加能耗和减少体质量。本研究以人肝L02脂肪变细胞模型，通过油红“O”染色、高效液相色谱等方法对瘦素作用后的脂肪变细胞进行研究，了解瘦素与NAFLD的关系，并初步探讨了瘦素对其的治疗作用。 1和方法 11主要试剂和仪器 1640培养基(GIBCO)，胎牛血清 (成都哈里生物有限公司)，胰蛋白酶(Sigma)，1，2，4丁三醇(Buches瑞士)，油红“O”(北京生物化学有限公司)，正己烷、异丙醇、乙腈(国产分析物)。二氧化碳恒温培养箱(日本SANYO公司)，超净工作台(德国Heraeus公司)，倒置相差显微镜(OLYMPUS)，50ml培养瓶，24孔细胞培养板(NUNC公司)，酶标分析仪(美国BioRad550)。 12实验方法 12.1非乙醇性脂肪变肝细胞模型的建立 人肝L02细胞株培养接种于50ml培养瓶中，在含体积分数10%的灭活胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/L链霉素的1640完全培养基中，于37?，5%二氧化碳培养，饱和湿度，贴壁生长，待细胞长满80%瓶底，消化液消化传代。在更换新鲜培养液后加入胎牛血清，使其浓度为50%，继续培养24h，即形成非乙醇性肝细胞脂肪变性模型。设正常组、模型组、瘦素处理1，2，3组，瘦素处理组的瘦素浓度分别为10-7mol/L，10-6mol/L，10-5mol/L，分别处理6h; 再以10-6mol/L浓度瘦素建立6，12，24h的时效关系分别处理。每组均行油红“O”染色观察脂肪化情况，高效液相色谱测细胞内TG含量变化。 1.2.2油红“O”染色观察造模是否成功 采用Lillie氏油红“,”染色法:将细胞培养于放有无菌盖玻片的6孔培养板，用PBS冲洗盖玻片3次，每次5min，50%异丙醇固定1min，油红“O”染色液染色10min，蒸馏水冲洗3次，每次1min，苏木素染色5min，分色和返蓝后，HPIAS1000型图像分析系统收集图像。按Wada方法进行脂质染色的半定量分析即根据脂滴的面积进行细胞分类。细胞脂滴的面积小于细胞核的面积记为“-”，细胞脂滴的面积等于或大于细胞核的面积记为“+”，每一块玻片计数100个细胞。 1.2.3色谱分析和计算 安捷伦HP1100单元泵，自动进样器，紫外监测器和化学工作站进行分析。检测波长230nm，流速0.7ml/min，采用梯度洗脱A:乙腈B:水0~12min:75%A~95%A:121min~18min:75%A。将标准溶液浓度对甘油/内标峰面积比值线性回归后得回归方程用于样品甘油浓度的计算。TG 1.3统计学方法 统计分析用SPSS软件，实验数据用均数?标准差(?s)表示，两组数据资料比较用t检验及方差分析，P<0(05为有显著性差异。 2结果 21人肝L02细胞脂肪化 正常细胞用50%胎牛血清培养基培养24h后，用油红“O”染色，显微镜下观察，细胞浆内有大量脂滴存在，符合脂肪化肝细胞特点。同时用高效液相色谱分析细胞内TG明显增加，与正常肝细胞比较有显著性差异(P<0(05)，其中细胞内TG从20.19μg/g增加到77.51μg/g，说明细胞内有大量TG聚集，造模成功。 2.2瘦素对人肝L02脂肪变细胞TG的影响 人肝L02细胞用50%的胎牛血清培养24h后，分别加入瘦素10-7mol/L，10-6mol/L，10-5mol/L培养6h。油红“O”染色，显微镜下观察，细胞内脂滴依次减少。瘦素10-5mol/L时效关系显示油红“O”染色细胞数明显依次减少。高效液相色谱分析细胞内总甘油与TG模型组比较有显著性差异(P<0(05)。与瘦素呈时间、剂量依赖性关系(见表1，2)。表1瘦素对人肝L02细胞细胞内TG影响的量效关系(略)表2瘦素对人肝L02细胞细胞内TG影响的时效关系(略) 3讨论 近年来，随着人们生活水平的提高，饮食结构的变化，检测手段的提高，非乙醇脂肪肝(NAFLD)发病率呈逐年上升趋势。NAFLD根据其病理学改变及临床表现分为单纯性脂肪肝、非乙醇性脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化、脂肪性肝硬化。NAFLD曾被普遍认为发病率较低，仅发生在伴有非胰岛素依赖性糖尿病的肥胖女性并且愈后良好。但是自1994年起一系列研究结果表明NAFLD的发病在性别间 没有明显差异，在非肥胖和糖尿病人中也有较高的发病率，特别是发现NAFLD可进展至肝炎、肝纤维化和肝硬化之后，才逐渐为人们所重视。肥胖、高脂血症、2型糖尿病与NAFLD的发病密切相关。大约75%的2型糖尿病患者可发生不同形式的NAFLD;70%的肥胖患者发生脂肪肝，其中18%出现NASH[4]。NAFLD的发病尚非十分清楚，Day等[5]提出的“二次打击”(twohits)理论目前被广泛认同。多种遗传和代谢性因素的联合作用诱发胰岛素抵抗(IR)，后者通过增加的脂肪分解和FFAs转运至肝脏导致第一次打击—脂肪肝形成，并造成肝脏对第二次打击的敏感性增强。氧应激、脂质过氧化等进一步促进IR，加重氧应激和肝细胞内细胞器损伤，导致炎症反应、肝细胞变性和肝纤维化，即第二次打击。本研究结合文献,6,采用高脂培养基造模，形成典型的非乙醇性脂肪性肝细胞模型，主要研究NAFLD形成的第一步肝细胞内脂肪沉积及瘦素干预后的变化。第3期瘦素对肝细胞三酰甘油沉积的影响周红宇，等肝脏是体内参与脂质代谢的重要场所。肝脏脂质代谢稳态的变化是构成各种形式脂肪肝的基础，各种致病因素可通过一个或多个环节导致肝细胞内TG异常堆积。TG在肝细胞的沉积决定于其合成、代谢及转运三个环节。食物内的脂肪和胆固醇经小肠吸收后，以乳糜微粒与载脂蛋白结合的脂蛋白形式存在于血中，肝脏选择性摄取血中的非饱和脂肪酸，经酯化合成TG，肝细胞不能储存脂肪，TG在肝细胞内，一方面氧化分解供能，另一方面与载脂蛋白B100、C等以及磷脂、胆固醇结合生成极低密度脂蛋白，由肝细胞分泌通过血液循环运输至肝外组织。当肝细 胞合成TG增多，转运或氧化障碍时，都可能导致TG在细胞内的堆积，形成脂肪肝。本实验经过高脂培养基培养L02肝细胞，发现肝细胞普遍发生脂肪变性，细胞肿胀，内含较大的脂肪滴，可将细胞核挤压向胞膜，可见高脂环境可引起肝脏脂肪浸润(TG贮存)。而经过瘦素处理后肝细胞内脂滴明显减少，细胞形态恢复正常，高效液相色谱分析细胞内TG明显减少，与瘦素呈剂量依赖性关系。说明10-7mol/L~10-5mol/L浓度的瘦素对离体脂肪变肝细胞有积极的防治作用。瘦素是一种主要由白色脂肪组织分泌合成的由167个氨基酸残基组成的蛋白质类激素。瘦素的表达具有组织特异性，主要在白色脂肪组织中表达，其中皮下脂肪的表达最高，棕色脂肪组织、肌肉、胃黏膜、胎盘滋养层细胞和羊膜细胞也可以合成少量瘦素[7]。瘦素通过靶细胞膜上的受体及相应的信号转导体系发挥作用。OBRb共有6种异构体。OBRb的胞内结构域最长，由302个氨基酸搭配组成，并包含Janus激酶(JAK)结合结构域以及信号转导转录激活因子(STAT)结合的共同序列YXXQ，OBRb是唯一能进行信号转导并调节热量摄入和能量消耗的异形体[8]。OBRb主要存在于下丘脑中能表达NPY的细胞表面，与瘦素结合后，通过JAK以及信号转导和转录激活物(STAT)蛋白发挥信号转导作用，调控核内DNA上Leptin效应基因的转录活性。目前JAKSTAT途径被认为是Leptin受体信号转导的主要途径[9]。瘦素可与特异性运输蛋白结合，通过血脑屏障，然后与下丘脑特异受体结合，把体脂信号传递给下丘脑。下丘脑再通过一系列神经体液因素调节机体能量代谢，调整体脂， 控制体质量相对恒定。给遗传性肥胖的ob/ob小鼠进行肌内注射瘦素，能够明显抑制食欲，促进代谢，4周后脂肪下降将近75%，而且没有明显的副作用。给ob小鼠脑脊液中注入瘦素后[10]进食量明显减少，体质量渐降正常，而且减少的仅为脂肪组织。且其基础代谢率有所升高，这说明抑制食欲、增加能耗和减少体重可能是瘦素减肥的主要机制。瘦素可能具有从外周直接拮抗肝脂肪变性的作用。瘦素可以激活AMP活化蛋白激酶(AMPactivatedprotEinkinase)减少脂肪沉积[11]，还可特异性抑制肝脏的硬脂酰基-辅酶A去饱和酶(stearoylCoAdesaturase1)，使肝脏VLDL生成和脂肪沉积减少[12]。瘦素参与肝脏内糖及脂肪代谢，它通过调控肝脏磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的基因表达，促进肝脏对乳酸的摄取，减少TG合成，同时通过蛋白激酶A激活肉碱脂酰转移酶，影响肝脏对TG的氧化代谢[13]。Uygun等[14]认为非脂细胞瘦素受体发生功能障碍时细胞内TG含量能增加100倍，而持续表达的异位高瘦素血症能使细胞内TG耗竭;瘦素还干预胰岛素在肝脏中作用，一方面拮抗胰岛素诱导的PEPCK1(IRS1)的磷酸化，影响胰岛素受体后信号转导;另一方面，瘦素通过对PEPCK及糖异生的影响，限制TG的合成，提高肝脏及外周组织对胰岛素的敏感性，Stumvoil等[15]发现瘦素与脂联素等连用能促进小鼠肝脂肪燃烧及能量消耗，可逆转缺乏过氧化物酶体增殖受体(PPAR)α的脂肪萎缩小鼠的胰岛素抵抗。但是Chitturi等[16]发现NAFLD患者有高瘦素血症，且瘦素水平与肝脏的脂肪变性程度呈直接正相关。最近Chalasani 等[17]报道，瘦素水平与脂肪肝的发生并无直接关系。因此，瘦素对 肝脂肪变性的影响尚无定论。本实验经过高脂培养液培养证实细胞内 TG明显增加，经过瘦素处理后肝细胞内TG明显减少，与瘦素呈剂 量及时间依赖性关系。说明瘦素能明显减少离体脂肪变肝细胞的TG 沉积，与文献[12,18]报道一致。可见瘦素对非乙醇性脂肪肝具有治疗 作用。其对TG的作用明显，体内外实验均表明，其可抑制乙酰COA 羧化酶的表达而抑制TG的合成，可激活肉碱脂酰转移酶而促进TG 的氧化代谢。本实验通过高效液相色谱分析也显示瘦素处理后脂肪变 肝细胞内TG量明显减少，瘦素能使肝细胞内TG沉积减少达到治疗 非乙醇性脂肪性肝脏疾病的目的。 【参考文献】 \[1\]PotterJJ,WomackL,MezeyE,etal.Transdifferentiationofrathepaticstellatecellsresultsinleptinexpression\[J\].BiochemBiophysResCommun,1998,244:178-182. \[2\]LeeGH,ProencaR,MontezJM,etal.Abnormalsplicingofleptinoftheleptinreceptorindiabeticmice\[J\].Nature,1996,376:632. \[3\]DayCP.Non alcoholicsteatohepatitis(NASH):wherearewenowandwherearewegoing\[J\ ].Gut,2002,50:585-588. \[4\]MedinaJ,FernándezSalazarLI,García BueyL,etal.ApproachtothePathogenesisandTreatmentofNonalcoholicSteatohepatitis\[J\].DiabetesCare,2004,27:2057-2066. \[5\]DayCP,JamesO.Steatohepatitis:ataleoftwo“hits” \[J\]?Gastroenterology,1998,114:842-845. \[6\]徐正捷,范建高,王国良,等.乳果糖对大鼠非酒精性脂肪性肝 炎模型形成的影响\[J\].中华消化杂志,2003,23:97-100. \[7\]SchwartzM,PeskindE,RaskindM,etal.Cerebrospinalfluidleptinlevels:relationshiptoplasmalevelsandtoadiposityinhumans\[J\].NatMed,1996,2:589-593. \[8\]FEIH,OkanoHJ,LiC,etal.Anatomiclocalizationofalternativelysplicedleptinreceptors(OB-R)inmousebrainandothertissues\[J\].ProcNatlAcadSciUSA1997,94:7001-7005. \[9\]ChuaSCJr,ChungWK,Wu PengXS,etal.PhenotypesofmousediabetesandratfattyduetomutationsintheOB(leptin)receptor\[J\].Science,1996,271:994-996. \[10\]LeLaySL,BoucherJ,ReyA,etal.Decreasedresistinexpressioninmicewithdifferentsensitivitiestoahigh fatdiet\[J\].BiochemBiophysResCommun,2001,289:564-567. \[11\]MinokoshiY,KimYB,PeroniOD,etal.LeptinstimulatesfattyacidoxidationbyactivatingAMP activatedproteinkinase\[J\].Nature,2002,415:339-343. \[12\]OralEA,SimhaV,RuizE,etal.Leptin replacementtherapyforlipodystrophy\[J\].NEnglJMed,2002,346:570-578. \[13\]HuangL,WangZ,LiC,etal.Modulationofcirculatingleptinlevelsbyitssolublerecepter\[J\].JBidChem,2001,276:6343-6349. \[14\]UygunA,Kadayifei,YesiloveZ,etal.Serumleptinlevelsinpatientswithn onalcoholicteatohepaticpatients\[J\].AmJGastraenterol,2000,95(12):3584-3589. \[15\]StumvoilM,TschritterO,FritscheA,etal.AsociationofTGpolymortioninadiponection(Exon2)withobesityandinsulinsensitivity;interactionwithfamilyhistoryoftypediabetes\[J\].Diabetes,2002,51(1):37-41. \[16\]ChitturiS,FarrellG,FrostL,etal.SerumleptininNASHcorrelateswithhepaticsteatosisbutnotfibrosis:amanifestationoflipotoxicity\[J\]?Hepatology,2002,36:403-409. \[17\]ChalasaniN,CrabbDW,CummingsOW,etal.Doesleprinplayaroleinthepathogenesisofhumannonalcoholicsteatohepatitis\[J\]?AmJGastroentero,2003,98:2771-2776. \[18\]AsilmazE,CohenP,MiyazakiM.Siteandmechanismofleprinactioninarodentformofcongenitallipodystrophy\[J\].JCoinInvest,2004,113(3):414-424.