杀虫剂亚致死剂量对棉铃虫靶标酶的影响

杀虫剂亚致死剂量对棉铃虫靶标酶的影响 杀虫剂亚致死剂量对棉铃虫靶标酶的影响 第5卷第3期 2006年6月 现代农药 ModemAgrochemicals V0I.5No.3 Jun.2006 杀虫剂亚致死剂量对棉铃虫靶标酶的影响 魏波,郝赤,李会仙 (山西农业大学农学院,山西太谷03080I) 摘要:高效氯氰菊酯,氯氟氰菊酯,辛硫磷,杀螟硫磷4种杀虫剂亚致死剂量(LC5o)预处理 棉铃虫HelicoverpadrmigeFd(Hiibner)3龄幼虫一定时间后,4种杀虫药剂对棉铃虫的毒力影响有 明显差异.酶动力学研究表明:用4种药剂的亚致死浓度LC5.剂量处理棉铃虫3龄幼虫,在药剂 处理后的144h内,幼虫GSTs活性发育变化规律与对照有一定的差异.GSTs比活力在对照组 GSTs比活力值附近波动,说明昆虫在杀虫药剂刺激一段时间后,其GSTs处于动态的调整之中. 在48--,120h之间,Na+一K+一ATP酶比活力与对照组相比有回升的趋势,说明昆虫在外界刺激 物的作用下,其Na+一K+一ATP酶也处于动态的调整之中. 关键词:棉铃虫;谷胱甘肽一s一转移酶;Na一K一ATP酶;毒性;亚致死剂量 中图分类号:S481.i文献标识码:A文章编号;1671.5284(2006)03.0035.04 Insecticides'SublethalEffectonTargetEnzymesofHelicoverpaarmigera(Hflbner) WEIBo,HAOChi,LIHui-xian (CollegeofAgriculture,ShanxiAgricultureUniversity,ShanxiTaigu030801,China) Abstract:Effectsontoxicityofinsecticidesbysublethaldosesofagentsbeta?eypermethrin,eyhalothrin,phoximand fenitrothionwereinvestigatedinthe3rdinstarofthecoRonbollworm,Helicoverpaarmigera(H~bner).Theresults indieatedthattoxicityoffourinsecticideshadsignificantdifferencesaftertreatments.TheenzymeactivityofcoRon bollwormwasindicated;afterI44hoursteatedwiththesubthaldose(LCs0)ofthepesticiedes,thedifferencewasdetected intheGSTsactivitieswhencomparedwithcontrast.ThevibrateoftheGSTsactivitynearthatofthecontrastindicate thattheGSTswasindynamicadjustaftertreatedwithpesticides.ThedevelopmenttrendwasrevealedintheNa一K 一 ATPenzymeactivitiesaftertreated48to120hours.thismeansthatNa一K一 ATPenzymeactivitieswasin adjustmentwhentheinsectwasinstimulate. Keywords:Helicoverpaarmigera,H~bner);GSTs;Na一K一 ATP;toxicity;sublethaldosage 谷胱甘肽一s一转移酶(GSTs)是害虫体内重 要的解毒酶,对外源化合物的解毒代谢和杀虫剂的 抗性机制起着重要作用【J;Na+一K+一ATP酶是生 物膜上的一种蛋白酶,在物质运送,能量转换以及 信息传递过程中执行重要的生理功能,也是拟除虫 菊酯和有机磷药剂的靶标酶.致死剂量的杀虫剂施 用于田间后,除了对目标害虫直接杀死外,农药在 环境中的毒力随着时间和状态的改变逐渐递减到 一 定水平时,就会变为亚致死剂量.体内生理生化 机制的变异是导致害虫对杀虫剂产生抗药性的重 要机制之一【JJ. 棉铃虫是一种极重要的害虫,为害多种农作 物.2O世纪9O年代以来,棉铃虫在我国广大棉区连 年大发生.长期以来杀虫剂的不合理使用,使田间 棉铃虫种群对拟除虫菊酯和有机磷这两类杀虫剂 产生了抗性,但有关拟除虫菊酯和有机磷杀虫药剂 对害虫亚致死剂量处理害虫靶标酶的影响国内外 的研究还不是很多【l刊.目前已有研究发现,亚致死 收稿日期:2005—12—09 基金项目:山西省自然科学基金项目(20001087)和山西省归国留学人员科研基金 项目(2001030) 作者简介:奠波(1978--).男,山西曲沃人,硕士.主要从事昆虫生理生化研究. 36现代农药第5卷第3期 剂量的杀虫剂对害虫体内重要靶标酶和代谢酶都 有不同程度的影响L2J.本研究的目的在于阐明高效 氯氰菊酯,氯氟氰菊酯和辛硫磷,杀螟硫磷4种药 剂亚致死剂量对棉铃虫体内GSTs,Na一K一ATP 酶生物化学和毒理学性质的影响,为深入研究棉铃 虫的抗性以及杀虫药剂的合理使用提供理论依据. 1材料与方法 1.1供试虫源及饲养 棉铃虫为室内人工饲养多代的试虫.最初 虫源来自河南济源实业有限公司.饲养条件:温度 (27?1)?,相对湿度60%~80%,光周期14:10(L :D).幼虫人工饲料主要参照Brewer等人介绍的 配方经略加修改而成J. 1.2供试药剂 95%高效氯氰菊酯原粉(天津农药厂);95%氯氟 氰菊酯原粉(南京红太阳集团);90,2%辛硫磷原油 (鲁南化工厂);90.6%杀螟硫磷原油(天津农药厂). 13供试药剂及仪器 ATP酶,谷胱甘肽一S一转移酶及乙酰胆碱酯酶 试剂盒(购于南京建成生物工程研究所);uV一754 紫外可见光光度计(山东高密新虹仪器有限公司); 3K18型高速冷冻离心机(德国SIGMA公司生产); XS225A型电子天平(瑞士PRECISA公司生产);取 液器(北京青云航空仪表公司). 1.4生物测定方法 采用人工饲料渗毒法【,j.将供试药用丙酮稀释 配成设计浓度,分别取各浓度用丙酮稀释的杀虫剂 5mL,加入到100g刚配制好的棉铃虫人工饲料中, 并以丙酮对照,将饲料搅拌均匀,待丙酮挥发后存 入0..-4?冰箱中备用.试验时,在指形管中装入 1.5---2.0g饲料.每管接入大小一致的3龄幼虫, 然后置于(27?1)?的养虫室中饲养.72h后检查 棉铃虫的死亡率.结果检查:用软毛笔轻触虫体, 腹足完全不动者为死亡.每处理10头,各处理重 复3次.其死亡率一浓度数据由SAS软件进行统计 分析,求出LCso,毒力回归方程及斜率(b). 1.5亚致死剂量杀虫剂对棉铃虫体内重要 靶标酶的影响 挑选健康一致的同日龄3龄棉铃虫幼虫.分别用4种杀虫剂LCso~1]量处理的人工饲料进行饲喂作 为处理组,另一组用丙酮处理的人工饲料饲喂作为 对照组,于养虫室内进行饲养.在处理后的不同时 间制取酶液,并分别测定. 1.5.1酶源制备 将棉铃虫按3龄(7,14mg/头)4头/mL,4 龄(50---65mg/头)l头/mL,5龄l头/mL于冰冷 的磷酸缓冲液(0.1M,pH6.5)中匀浆.匀浆液 于10000g,0-'~4"C离心10min,上清液用作酶 源,冰浴待测J. 1.5.2谷胱甘肽一s一转移酶(GSTs)活性测定 GSTs活性测定:参照ClarkIlal等方法,酶液100 ,严格按照谷胱甘肽一s一转移酶测定试剂盒说 明书进行操作.测出非酶管OD,酶管OD,标准管 OD以及空白管OD,酶源经蛋白含量测定,按照如 下公式求出GSTs活力. 掰力单位=× 蛋白含量测定:蛋白质组分具有一NH3,当棕 红色的CBBG250显色剂加入蛋白标准液或样品 时.CBBG250染料上的阴离子与蛋自一NH3+结合, 使溶液变为蓝色,通过吸光度可计算出蛋白含量. 严格按照考马斯亮兰蛋自测定试剂盒说明书进行 操作测出空白管OD,标准管OD和测定管OD, 按照以下公式求出蛋白含量. 蛋白含量=监 1rJ,f匠'目?,D【l儿J量 1.5.3Na一K一ATP酶活性测定 酶源制备:同上.仅将缓冲液由PBS改为Tris — HC1(0.1M,pH7.2). 0.1M,pH7.2的Tris—HCI溶液配制:3.29g Tris溶于57mL0.4MHC1中,再用蒸馏水定容至 500mL. 测定过程严格按照ATP酶测试盒说明进行操作. 在660hill处测得测定管OD值,对照管OD值及标 准管OD值.根据如下公式求出酶液中A1]P酶活力. 酶液中酶活力=塑×堑塑塑型丝釜番 2006年6月魏波,等:杀虫剂亚致死剂量对棉铃虫靶标酶的影响37 2结果与分析 2.1亚致死剂量的测定 ,4种药剂对棉铃虫3龄幼虫毒力 从表1看出 (LC5o)以高效氯氰菊酯的毒力最大,LC5o是337.389 mg/L,其次为杀螟硫磷,辛硫磷和氯氟氰菊酯. 表1杀虫剂对棉铃虫的毒力 杀蜊觯b勒施,蹦 高效氯2,909~0.312y=2.0909x--0.2473337.389171.7504585.234 氯氟1.339~0.293_1.3394x+1.992633.590513.739~772.008 辛硫礴2,086~0.212y=2.0865x-0.5847485.850414.5304544.126 杀螟藏磷2.241?O.524y=2.241Ix--0.8263414.562256.I164786.759 注:表中斜率表示x?SD 2.2亚致死剂量杀虫剂对棉铃虫生化水平 的影响 2.2.1谷胱甘肽一s一转移酶(GSTs)活性测定 用4种药剂的亚致死浓度LC5o剂量处理棉铃虫 3龄幼虫,在药剂处理后的144h内,幼虫GSTs 活性发育变化规律与对照有一定的差异(见图1).4 种药剂处理后GSTs在144h内的变化趋势同对照 基本相似,96h内GSTs比活力均有一定程度的增 长,96,144h间高效氯氰菊酯和杀螟硫磷的波动 性较大. 同时从本讨论结果还可看出,氯氟氰菊酯在处 理后72h,GSTs活性达到活性高峰,比对照组增 长了49%.辛硫磷在处理后24h达到活性高峰, GSTs比活力比对照组增长了53%.而辛硫磷在处 理后48h达到活性高峰,GSTs比活力比对照组增 长52%.在处理后96,144h内,处理组GSTs比 活力在对照组GSTs比活力值附近波动,说明昆虫 在杀虫药剂刺激一段时间后,其GSTs处于动态的 调整之中,表明亚致死剂量处理后,棉铃虫GSTs 比活力的变化同处理药剂的种类有关,并存在一定的时间效应. 2448729612O144 时间,ll -- ?—一CK — ?一高效氯氰菊酯 — ?一氯氟氰菊酯 — ?一-普硫磷 — ?一杀螟硫磷 图1亚致死剂量杀虫剂对棉铃虫@STs活性的影响 2.2.2Na+一K+一ATP酶活性测定 从4种药剂亚致死剂量处理棉铃虫后Na一 K一ATP酶活性不同时间的动态变化看(图2), Na+一K+一ATP酶比活力在120h内的变化趋势 同对照基本相似.高效氯氰菊酯,辛硫磷和杀螟 硫磷处理棉铃虫24h后,Na+一K一ATP酶活性 比对照组有所增加,其活性分别为对照的1.35倍, 1.96倍和1.91倍.随着处理时间的延长,这两个 处理组的Na+一K+一ATP酶活性又呈现被抑制 状态,在处理48h的酶活力单位高效氯氰菊醋和 氯氟氰菊酯比对照有所下降;而辛硫磷和杀螟硫磷 比对照级有所增加.在48---120h之间,Na一K 一 ATP酶比活力与对照组相比又有回升的趋势. ,Na+一K一 氯氟氰菊酯在处理棉铃虫48h后 ATP酶活力被抑制达最低谷,仅为对照组的 16.2%.在24---108h之间,其Na一K一ATP 酶活力一直低于对照.而在处理108h之后,酶 比活力比对照组有所增长.氯氟氰菊酯在处理 24---72h之间,Na+一K+一ATP酶比活力低于对 照组.随后,Na一K一ATP酶比活力逐渐增加, 在对照组Na+一K一ATP酶比活力值附近波动. 说明昆虫在外界刺激物的作用下,其Na一K一 ATP酶处于动态的调整之中,表明亚致死剂量处 理后,棉铃虫Na+一K+一ATP酶比活力的变化同 处理药剂的种类有关. O.8 点0.6 毒o- _R 蚂0.2 丑 O 24487296l2O 时问,h -- ?_-CK — ?一高效氰氰菊酯 — ?一氯氟鲁【菊酯 — ??一半硫磷 — ?一杀螟硫瓣 图2亚致死剂量杀虫剂对棉铃虫Na一K'一ATP酶活性的影响 3结论与讨论 上述结果表明,4种药剂亚致死剂量对棉铃 虫敏感品系的GSTs活性有一定的诱导作用.谷 胱甘肽一s一转移酶是昆虫对杀虫剂代谢中重要 的共轭酶系之一,它能使有毒的亲电化合物与其 内源性的还原型谷胱甘肽(GST)进行共轭代谢, 而保护其他亲核的中心,如蛋白质和核酸.这与 夏冰【6用亚致死浓度的阿维菌素和高效氯氰菊酯 38现代农药第5卷第3期 处理敏感品系小菜蛾对小菜蛾GSTs解毒酶的影 响是一致的.Rumpft161用氯氰菊酯亚致死剂量处 理褐蛉Mcromustasmaniae幼虫后,也发现其 GSTs活性明显增加,而用苯氧威亚致死剂量处理 后GSTs活性却明显降低.高希武用LD5剂 量的对硫磷处理3龄棉铃虫幼虫24h后,发现 GSTs活性与对照组没有显着差异,而灭多威处理 组的GSTs活性下降了78%.表明亚致死剂量的 不同杀虫药剂对不同昆虫的GSTs活性的影响可 能存在差异. 张宗炳??,宁黔冀【lZJ,何运转等报道,昆虫神 经系统的Na一K一ATP酶是拟除虫菊酯类药剂的 靶标之一.钠离子在神经细胞内外的流动依靠Na, K离子泵,而Na,K+离子泵由Na一K一ATP 酶所控制.Na一K一ATP酶的基本功能是催化 ATP末端磷酸水解,并利用该反应产生的自由能来 逆转电化学梯度,进行Na+,的主动运输,从而 维持细胞膜内外Na+,离子浓度的相对恒定及渗 透压的平衡,以保证细胞正常的神经传导或物质吸 收等重要的生理功能?.酶活性测定结果表明,4 种药剂亚致死剂量处理棉铃虫后,对Na一K一 ATP酶比活力有可逆性激活作用,但最终表现为抑 制酶活力,此结果与前人报道基本一致.田雨等?刮 研究也表明,不同浓度的溴氰菊酯可抑制突触膜上 的Na一K+一ATP酶,且浓度越高抑制作用也越大. ATP酶对生物体的能量代谢,信息传递,生长发育 等方面发挥重要作用.Na一K一ATP酶受抑制时, 膜对离子通透性降低,若被激活,则膜对离子通透 性增强,无论是受抑制还是被激活,膜电位都会发 生变化,影响神经传导.所以,4种药剂亚致死剂量 对ATP酶这种可逆性激活作用,最终会严重影响试 虫机体细胞的代谢生长,破坏其神经细胞的传导功 能,从而使试虫表现出特异行为(如忌避作用),抑 制生长发育,最终达到控制害虫的目的. 总之,杀虫剂亚致死效应及其机制的研究是害 虫可持续治理中一项较复杂,重要的课题,认真研 究其毒理学原因,探讨杀虫药剂亚致死效应的生物 化学和分子生物学机制,对于合理使用杀虫剂,减 少其副作用及协调生防与化防的关系,都具有积极 的意义. 参考文献 …1张文吉,张友军,韩熹莱.棉铃虫不同龄期幼虫羧酸醇酶,谷胱甘 肚转移酶,乙酰胆碱露}群研究【J】_植物保护,1996,23(2):157 一 l62 【2】刘披,高希武郑炳宗.抗胆碱碡奠剂亚致死剂量对棉铃虫毒力的 影响及对乙酰胆碱碡酶的诱导作用[J】,昆虫,2003.46(6): 69l一696. 【3】ChaddEM,BradyJ.SublethallnsecticideEffectsontheProbing ResponsivenessofTsetseFieldsandBlow?fliesPhysiol[J】.Entomol, I982.7:I33一I4I. 【4】沈晋良,吴益东.棉锋虫的抗性及其治理【M】.北京:中国农业出 版杜,1995:33—67. 【5】王旭,高希武.有机磷药剂对棉铃虫羧酸碡奠的抑制作用[J】.昆 虫,1998,41(增):12—18. 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