14种高原植物抑制植物病原菌活性的初步研究

14种高原植物抑制植物病原菌活性的初步研究 14种高原植物抑制植物病原菌活性的初步 研究 2011年5月 第48卷第3期 四川大学(自然科学版) JournalofSiehuanUniversity(NaturalScienceEdition) May.2. 011 Vo1.48No.3 doi:103969/j.issn.0490—6756.2011.03.044 14种高原植物抑制植物病原菌 活性的初步研究 杨茜,王 全鑫 晶,达 ,陶科, 娃.,杨从军, 侯太平 (1.四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都610064; 2.西藏高原生物研究所,拉萨850000) 摘要:采用生长速率法检测了11科14种高原植物的乙醇提取物对6 种植物病原真菌的抑 制活性.实验结果显示,在样品的作用浓度为1mg/mL时,香青,铁线莲, 露蕊乌头的乙醇提取 物对苹果腐烂病原茵有明显的抑制作用,抑制率分别为 77.10,68.14,67.53;香青,露 蕊乌头,金露梅,木鳖子对苹果炭疽病原茵也有值得关注的抑制作用, 抑制率分别为81.O2, 66.53,62.1O,61.34%.进一步对香青的正己烷,乙酸乙酯,甲醇萃取物 进行抑茵活性检测 发现,正己烷部位为抑茵活性物质主要存在部位. 关键词:植物农药;香青;生长速率法;抑菌活性 中图分类号:Q946文献标识码:A文章编 号:0490—6756(2011)030720—05 Antimicrobialactivityoftheextractsoffourteenplantsfrom theQinghai—Tibetplateauagainstphyt0pathogen Y_ANGQian,W_ANGJing,Dn.,yANGCong—Jun,QUANXin,丁 A0KP,H0U丁口—Ping (1.KeyLaboratoryOfBio—resourcesandEeo—environmentofMinistryofEducation, CollegeofLifeSciences,SichuanUniversity,Chengdu610064,China; 2.TibetPlateauInstituteofBiology,Ihasa850000,China) Abstract:Fourteenplants,belongingto11familiesfromtheQinghai—Tibetp lateauofChina,wereextrac— tedwith95ethano1.Theextractswereevaluatedantifungalactivityagainstsixplantpathogenicfungi usedthemycelialgrowthinhibitionassayinvitro.Attheconcentrationof1mg/mL.theextractsfrom A.sinicaHance.,C.connata,A.gymnandrumshowedtheobviousinhibitoryactionagainstthefungiV. ceratospermaby77.10%,68.149,6,67.539/6;theextractsfromA.sinicaHance.,A.gymnandrum,P. fruticosaL.,M.cochinchinensisalsoshowedhighinhibitoryagainstC.gtoeospOriOideswiththeinhibito— ryof81.O2%,66.53,62.1O%,61.34%.Throughthefurtherstudyonthedifferentsolventextractions oftheethanolextractfromA.sinicaHance..theresultsindicatedthattheeffectiveinhibitorycompo— nentswereincludedinthen—hexaneextract. Keywords:Plantpesticide,A.sinicaHance.,themycelialgrowthinhibitionassay,antimicrobialactivi- ty 收稿日期 基金项目 作者简介 通讯作者 2O1O一03—18 国家自然科学基金(30871657;20972106) 杨茜(1985--),女,湖北省天门市人,在读硕士研究生,主要从事植物天然产物研究.E—mail:yangqian1382@126.tom 侯太平.E—mail:houtplab@SCU.edu.cn 第3期杨茜等:14种高原植物抑制植物病原茵活性的初步研究721 1引言2材料与方法 2O世纪5O年代以来,随着合成农药的迅速发 展,化学农药成为植物病虫害防治的主要手段.但 随着时间的积累,化学农药的大量使用给人类带来 的诸多难题13益突出[1].化学农药对生态环境的污 染引起的生态效应十分深远,对生物多样性的破坏 作用极大.化学农药残留在食物链上的传递与富 集,可使处于高生物位上的生命体甚至人类遭受高 剂量有毒化学物质危害的风险.农药污染已成为全 球性关注的重要环境问题之一[2].进人21世纪以 来,随着人们崇尚自然,保护环境,关注食品安全的 呼声日渐高涨,无公害生物农药的研发已成为世界 关注的研究热点]. 在植物的生理生化过程中,能产生的化学物质 估计有4O多万种,统称为植物的次生代谢物,其中 有些成分具有抑菌杀虫活性,可以作为植物农药中 的有效成分.如目前的研究热点印楝素,除虫菊素 等,已进入产业化阶段,取得了很好的防治效果[3]. 植物农药由于源于自然,它们与环境相容性高,无 残留,对人畜及害虫天敌比较安全,害虫不易产生 抗药性,因此将是未来农药的重要发展方向.目前 世界各国都在积极寻找具有开发前景的植物,以期 从中发现可作为生物农药的先导化合物. 青藏高原强烈的地形变化,独特的大气环流系 统和气候的多样性,提供了多样性的生物栖息环 境,形成了非常丰富的生物物种,是世界重要的生 物资源宝库[4].尤其是青藏高原东缘,是世界公认 的25个生物多样性热点地区之一,拥有大量植物 资源[5].本次研究选择从青藏高原东缘的若尔盖地 区采集的11科l4种高原植物.在本实验室的前期 工作中,用打孔法测定了这14种植物的乙醇提取 物对4种植物病原细菌柑橘溃疡病原菌,大白菜软 腐病原菌,姜瘟病原菌,白叶枯病原菌的抑菌活性, 发现所有植物样品对上述前三种细菌均无抑制作 用,有部分植物样品对白叶枯病原菌有抑制效果, 其中香青的抑菌效果最好,在lmg/mL的作用浓 度下对白叶枯病原菌的抑菌圈达到17mm].在此 基础上,本次实验进一步测定这14种植物提取物 对6种植物病原真菌的抑菌活性,寻找抑菌活性最 高的植物. 2.1材料 植物样品均采自青藏高原东部的若尔盖草原, 洗净,晾干存放,供试部位如表1所示.植物样品标 本保存于四川大学生命科学学院农药及作物保护 研究所. 供试菌种:6种植物病原真菌,分别为玉米小 斑病原菌(Bipolarismaydis),番茄灰霉病原菌 (BotrytiscinereaPers.),苹果腐烂病原菌(Valsa ceratosperma),棉花枯萎病原菌(Fusariumoxys— porumf.sp.Vasinfectum),苹果斑点落叶病原菌 (Alternariamali),苹果炭疽病原菌(Colletotri— chumgzDe0sp0r0(fPs).4种植物病原细菌,分别为 大白菜软腐病原菌(ErwiniCarotoVOra),柑橘溃疡 病原菌(Xanthomonascampestris),姜瘟病原菌 (Ralstoniasolanacearum),白叶枯病原菌(Xan- thomonasoryzae).以上菌种均由教育部生物资源 与生态环境重点实验室提供. 2.2方法 2.2.1植物样品的处理将植物样品碎成粉末, 取200g粉末按1O:1(V:w)的比例用2000mL 95乙醇浸泡,45?水浴,搅拌8个小时.如此重 复提取三次,合并提取液,减压浓缩至恒重,得到乙 醇提取物浸膏,置于4?冷柜保藏待用. 香青乙醇提取物拌以硅藻土后35?烘干,依 次用正己烷,乙酸乙酯,甲醇萃取完全,减压浓缩萃 取液,得到三种不同极性部位浸膏,4?保存待用. 2.2.2抑菌活性检测方法活性测定方法遵循 《创制农药生物活性评价SOP》[7并参考文 献[8]的方法. 抑制真菌活性的检测方法:采用生长速率法检 测对真菌的抑制效果.取样品浸膏50mg,用0.4 mL溶液(丙酮:二甲基亚砜=1:1)溶解充分后, 加入4.5mL灭菌的l‰Tween一80吐温水,摇匀 后倒人45mLPDA培养基中(培养基温度为45, 5O?),加入0.1mL链霉素水溶液(最终作用浓度 为0.05mg/mL),最终配成待测样品浓度为1 mg/mL的50mL含药培养基,倒三个平板.待培 养基凝固后,在平板中央接上直径6mm的菌饼, 菌丝面紧贴培养基,置于28?恒温箱内培养.同时 四川大学(自然科学版)第48卷 表1供试植物样品名录 Tab.1CatalogueofCompositaeplantstested 按相同方法制作仅不加样品浸膏的空白对照,当空 白对照菌落直径长到6Omm左右,十字交叉法测 量含药平板的菌落直径,根据如下公式计算出抑制 效果: 抑制效果()一 瑟.空白对照组菌落直径一菌饼直径…, 抑制细菌活性的检测方法:采用打孔法[1..n]检测 对细菌的抑制效果.精确称取10mg样品,完全溶 于1mL溶剂(丙酮:二甲基亚砜一7:3)后,加人 9mL灭菌的1‰Tween一80吐温水中,}昆合均匀, 最终制成样品浓度为1mg/mL的样品溶液.密封, 4?冷藏待用.另外配制牛肉膏蛋白胨培养基,于 50~54?加人适量新鲜菌液,摇匀后倒于90mm 平板,待平板冷却,每平板用打孔器均匀打6个孔, 孔径6mm.用移液枪按0.1mL体积分别向6个 孔中加人4种样品溶液和一个空白对照(空白溶 剂),一个阳性对照(0.05mg/mL链霉素).做三次 重复实验.35?恒温箱培养24小时后,测量抑菌 圈直径. 3结果与 3.114种样品活性测定结果 从表2中可以看出,对于苹果腐烂病原菌,14 种样品对其均有不同程度的抑制.其中抑制率最高 为香青(77.109/6),接下来是铁线莲(68.149/6),露 蕊乌头(67.53),甘青赛莨菪(52.17).有12种 样品对棉花枯萎病原菌有抑制效果,抑制效果最好 的有香青(36.49),商陆(28.70%).14种样品对 苹果炭疽病原菌的生长都有不同程度的抑制,抑制 效果最明显的样品依次为香青(81.02),露蕊乌 头(66.53),金露梅(62.10),木鳖子 (61.34%).对于苹果斑点落叶病原菌,共12种样 品有抑制作用,最好的两种样品为香青(49.60%), 商陆(29.42).13种植物样品对番茄灰霉病原菌 有抑制作用,效果最好的为商陆(48.62),香青 (33.06),川楝(32.39).有12种样品对玉米小 斑病原菌有抑制作用,作用最明显的是香青 (52.38%),商陆(44.25).综合比较14种植物样 品的抑菌活性,可见对供试真菌抑制效果最好的是 香青,对6种真菌均有明显的抑制性,而且对苹果 腐烂病原菌,苹果炭疽病原菌的抑制率超过75, 对玉米小斑病原菌的抑制率超过50%.对比本实 验室前期抑细菌活性的实验结果,香青乙醇提取物 在这14种植物乙醇提取物中抑细菌活性也最高. 因此我们选择香青进行下一步研究,对香青不同极 性部位分别进行对植物病原真菌和植物病原细菌 的抑菌活性实验,寻找最高抑菌活性部位. 第3期杨茜等:14种高原植物抑制植物病原茵活性的初步研究 3.2香青不同极性部位的活性测定结果 分别采用生长速率法和打孔法测定香青不同 极性部位在作用浓度为1mg/mL下对植物病原真 菌和植物病原细菌的抑菌活性.其中抑制真菌的活 性测定结果如表3所示. 表2l4种植物乙醇提取物对6种植物病原真菌的抑菌率 Tab.2Antifungalactivityofthefourteenextractsagainstsixpathogenicfungi 样品作用浓度为1mg/mL;”…”表示为0或为负数 表3不同萃取部位对6种植物病原真菌的抑菌率 Tab.3Antifungalactivityofthedifferentsolventextractionsagainstsixpatho genicfungi 样品作用浓度为1mg/mL 从表2,3可以看出,不同极性部位对真菌的抑 制效果明显不同,其中正己烷部位对除苹果炭疽病 原菌的其他5种真菌的抑制率均明显高于乙酸乙 酯部位和甲醇部位.而且正己烷部位对四种植物病 原真菌棉花枯萎病原菌,苹果腐烂病原菌,玉米小 斑病原菌,番茄灰霉病原菌的抑制率均高于乙醇提 取物,推测活性成分在正己烷部位得到集中. 抑制植物病原细菌的结果显示,香青不同极性 部位只对白叶枯病原菌有抑制作用,对其它三种病 原细菌没有抑制作用.香青不同极性部位对白叶枯 病原菌的抑制圈直径分别为:正己烷部位(17 ram),乙酸乙酯部位(12mn1)和甲醇部位(11 ram).可见,正己烷部位对白叶枯病原菌的抑制作 用明显高于其他两个极性部位. 综合比较香青不同极性部位对植物病原真菌 和植物病原细菌的抑制活性结果,可见香青正己烷 部位的抑菌活性最高,是有效抑菌成分主要存在部 位. 4讨论 本文对14种高原植物乙醇提取物做了初步的 抑菌活性筛选,所选菌为我国农作物病害中有代表 724四川大学(自然科学版)第48卷 性的6种植物病原真菌[1,为寻找植物源杀菌 剂提供一定参考依据.分析实验结果可见,不同植 物样品对同一病原菌的抑制活性差异较大,同一植 物样品对不同菌种的活性亦存在显着差异.综合比 较14种供试植物的抑真菌活性结果,发现抑菌活 性最好的植物样品为香青乙醇提取物,该结果与本 实验室前期的抑细菌活性实验结果相同,活性最好 的植物样品均为香青.因此确定香青为进一步研究 对象,接下来对香青的不同极性部位分别进行对植 物病原真菌和植物病原细菌的抑菌活性筛选.检测 结果显示,正己烷部位抑菌活性最高,对真菌和细 菌均有一定的抑制作用,活性明显高于乙酸乙酯部 位和甲醇部位.综合分析可见,香青乙醇提取物中 的抑菌活性成分经过萃取得到集中,存在于正己烷 部位中. 香青是菊科香青属的一种,可全草入药,具有 平喘,镇咳,祛痰,消炎等作用.目前,对香青的研究 多见于植物化学及中医药利用,对其抑菌活性的研 究未见报道.据报道,香青属植物主要含黄酮类, 吡喃酮类,内酯类及萜类等成分[1?].滑艳从香青 中分离得到8个化合物,其中来自石油醚部分的有 J3一谷甾醇和豆甾醇[】. 参考文献: [1]谢联辉.21世纪我国植物保护问题的若干思考[J]. 中国农业科技导报,2003,5(5):5. [2]林玉锁,龚瑞忠.农药环境管理与污染控制[J].环 境导报,2000,9(3):4. [3]侯太平.植物农药研究进展[J].中国农业科技导 报,2006,8(6):12. [4]牛亚菲.青藏高原生态环境问题研究[J].地理科学 进展,1999,18(2):163. [5]MyersN,MittermeierRA,MittermeierCG,eta1. Biodiversityhotspotsforconservationpriorities[J]. Nature,2000,403(24):853. [6]王威,耿字聪,杨茜.青藏高原28种特有植物提取 物抑菌成分活性研究[J].黑龙江科技信息,2009, 33:l4. [7]张宗俭.创制农药的开发及生物活性筛选的原则和 方法[C]?中国植物保护学会第四届全国青年植物 保护科技工作者学术研讨会.大连:中国农业科学 院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验 室,2003. [8]滕云,余志义,崔文华,等.高山绣线菊提取物对几 种植物真菌的抑制活性及其活性成分[J].中国农业 科学,2009,42(7):2380. [9]周丽,高飞,滕云,等.17种高原草地有毒植物对植 物病原真菌生物活性的初步研究[J].四川大学学 报:自然科学版,2008,45(1):215. [1O]RehmanA,ChoudharyMI.Bioassaytechniquesfor drugdevelopment[M].Amsterdam:HarwoodAc— ademiePublishers,2001:16. [11]祖丽皮亚?玉努斯.新疆圆柏叶内生菌的分离及其 抑菌特性研究[J].食品科学,2009,30(23): 294. [12] [13] [14] 冯洁,孙文姬,石磊岩.中国棉花枯萎菌生理小种 的RAPD分析[J].菌物系统,2000,19(1):45. 曹克强,国立耘,李保华,等.中国苹果树腐烂病 发生和防治情况调查[J].植物保护,2009,35 (2):114. 李保聚,朱国仁.番茄灰霉病发展症状诊断及综合 防治[j].植物保护,2009,24(6):18. RanZY,ZhangY,ShiYP.Simultaneousdetermi— nationofnineflavonoidsinAnaphalismargaritacea bycapillaryzonee1ectroph0resis[J].Talanta, 2009,78(3):959. AhmedAA,HusseinTA,MahmoudAA,eta1. Norentkauranediterpenesandhydroxyla—etones fromAntennariageyeriandAnaphalismargarita— cea[J].Phytchemistry,2004,65(18):2539. 滑艳,何荔,汪汉卿.香青化学成分的研究[J].中 草药,2004,35(2):142. [责任编辑:白林舍] 刀 I=In