IGFI、IGFIR在人退行性变腰椎间盘中的表达及其生物学意义.doc

IGFI、IGFIR在人退行性变腰椎间盘中的达及其生物学意义.doc IGF I、IGF IR在人退行性变腰椎间盘 中的表达及其生物学意义 【摘要】 目的:观察胰岛素样生长因子 I(IGF I)、IGF I受体 (IGF IR)在人退行性变腰椎间盘组织中的表达，探讨其生物学意 义。方法:免疫组化(S P)法分别检测IGF I、IGF IR、增殖 细胞核抗原(PCNA)在正常对照组(A组，n=16)、退行性变椎间盘组 (B组，n=53)中的表达;TUNEL法检测两组椎间盘细胞凋亡情况。结 果:IGF I、IGF IR在B组中表达低于A组，两组之间差异显 著(P<0.05);细胞增殖指数(PI)B组低于A组，两组之间差异显著 (P<0.05);细胞凋亡指数(AI)B组高于A组，两组之间差异显著 (P<0.05);IGF I、IGF IR的表达与PI呈正相关 (rs=0.59,rs=0.56,均P<0.01)、与AI呈负相关(rs=-0.60,rs=-0.57,均 P<0.01);PI、AI值在IGF I、IGF IR阴性和阳性组有显著差 异(均P<0.05)。结论:IGF I、IGF IR的异常表达与人腰椎间 盘退行性变密切相关;IGF I、IGF IR促进细胞增殖，抑制细胞 凋亡，在人腰椎间盘退行性变过程中起重要作用，IGF I、IGF IR异常表达可能导致椎间盘退行性变的发生。 【关键词】 胰岛素样生长因子 I; 胰岛素样生长因子 I受体; 椎间盘退行性变 [Abstract] Objective: To observe the expression of IGF I and IGF IR in human degenerative intervertebral discs and to investigate its biological significance. Methods: 69 patients were divided into two groups: 16 cases of normal intervertebral discs in group A and 53 cases of degenerative intervertebral discs in group B. The expression of IGF I，IGF R, PCNA and apoptosis were detected by immunohistochemistry and TUNEL. Results: The expression rates of IGF I and IGF IR in group B was lower than those in group A, the difference was significant between them(P<0.05). Proliferative index(PI) in group B was lower than that in group A, the difference was significant between them(P<0.05). Apoptotic index(AI) in group B was significant higher than that in group A(P<0.05). The expression of IGF I，IGF IR had positive correlation with PI(rs=0.59, rs=0.56, all P<0.01) and negative correlation with AI(rs=0.60, rs=0.57, all P<0.01). There was significant difference in PI and AI between IGF I, IGF IR positive expression group and negative expression group(P<0.05). Conclusion: Abnormal expression of IGF I，IGF IR is closely related to degenerative intervertebral discs; IGF I and IGF IR promote cell proliferation and inhibit intervertebral discs cell apoptosis, which has an important effect on the degeneration of intervertebral discs. Abnormal expression of IGF I,IGF IR can induce degeneration of intervertebral discs. [Key words] insulin like growth factor I; insulin like growth factor I receptor; intervertebral disc degeneration 椎间盘退行性变(intervertebral disc degeneration，IDD)在成人 中有较高的发生率，传统的观点认为IDD与过度的身体负荷引起的 损伤有关。有研究显示IDD的主要机理可能是椎间盘细胞衰老、凋 亡。椎间盘活性细胞减少及随之而来的细胞外基质合成减少和成分 改变，是导致IDD的病理学基础，而椎间盘细胞过度凋亡是导致椎 间盘细胞减少的直接原因[1]。胰岛素样生长因子(insulin like growth factor ，IGF)与椎间盘细胞外基质变化和椎间盘细胞增殖、 凋亡密切相关[2]。IGF I及其受体(IGF IR)，作为IGF家族重 要成员与结合蛋白和结合蛋白酶共同构成IGF轴，它们在促进细胞 生长、有丝分裂及抗凋亡方面具有十分重要的作用[3]。本研究通过 免疫组化S P法检测IGF I、IGF IR、增殖细胞核抗原 (proliferating cell nuclear antigen，PCNA)在人退行性变腰椎间盘组织 中的表达，TUNEL法检测椎间盘细胞凋亡情况，探讨IGF I、 IGF IR在人椎间盘退行性变中的作用。 1 材料与方法 1.1 标本来源 收集2008年7月至2009年9月东南大学附属马鞍山市人民 医院病理科腰椎间盘组织存档蜡块69例。其中16例为没有腰痛病 史、影像学及病理学证实椎间盘没有退行性变、椎体爆裂性骨折患 者的椎间盘组织，作为正常对照组(A组)，包括男10例，女6例， 年龄20,40岁,平均(28.2?6.2)岁。余53例均为术前经CT或 (和)MRI诊断为腰椎间盘突出症、术后病理学检查证实为退行性变 腰的椎间盘组织，作为退变椎间盘组(B组)，包括男26例，女27 例，年龄33,71岁,平均(48.6?10.5)岁。所有患者均未行硬膜外封闭、化学溶核、经皮穿刺髓核切吸术、放化疗及免疫治疗。所有手术均采用腰椎后路术式，同法获取椎间盘组织。 1.2 试剂 兔抗人IGF I、IGF IR多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;兔抗人PCNA多克隆抗体，S P、TUNEL检测试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。 1.3 方法 石蜡标本，4 μm厚连续切片分别用于免疫组化(S P)法及TUNEL检测，具体步骤见试剂盒。以PBS液代替一抗作阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。IGF IR为细胞膜受体，在细胞内生成，变构后转移至膜上，细胞浆内、细胞膜上均有表达。IGF I则主要在细胞浆内表达。如试剂说明书所示，显微镜下，IGF IR阳性着色主要位于细胞浆、细胞膜，IGF I阳性着色主要位于细胞浆，均以出现棕黄色颗粒判定为阳性细胞。高倍镜下(×400)随机观察5个视野，以阳性细胞百分率和染色强度为判定标准，阳性细胞?30%为阴性(-)，31%,50%为弱阳性(+)，51%,80%为阳性(++)，?81%为强阳性(+++)[4]。细胞增殖指数(proliferative index，PI)以平均每100个细胞中PCNA阳性细胞数来判断。TUNEL法检测细胞凋亡，以凋亡指数(apoptotie index，AI)即平均每100个细胞中凋亡细胞数来判断结果。 1.4 统计学处理 应用SPSS 12.0统计软件进行数据处理，采用χ2检验、t检验及Spearman相关分析法进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 两组中IGF I、IGF IR阳性表达率及PI和AI IGF IR阳性着色主要位于细胞浆、细胞膜，IGF I阳性着色主要位于细胞浆。A组IGF I、IGF IR表达率分别为75.00%、68.75%，高于B组(47.17%、39.62%)，两组比较有显著差异(P<0.05)(表1，图1,4)。B组PI低于A组，两组比较有显著差异(P<0.05);B组AI高于A组，两组比较有显著差异(P<0.05)(表1，图5,8)。表1 两组IGF I、IGF IR的阳性表达率及PI和AIA组IGF I阳性12例，阴性4例;B组IGF I阳 性25例，阴性28例。IGF I在两组椎间盘中的表达与PI值呈正相关(rs=0.59,P<0.01)。A组IGF IR阳性11例，阴性5例;B组IGF IR阳性21例，阴性32例。IGF IR在两组椎间盘中的表达与PI值呈正相关(rs=0.56，P<0.01)。IGF I、IGF IR阳性椎间盘与阴性椎间盘比较，PI值差异显著(P<0.05)，见表2。表2 IGF I、IGF IR的表达与PI的关系与IGF I阳性比较,a P<0.05;与IGF IR阳性比较,b P<0.052.3 IGF I、IGF IR的表达与AI的关系 IGF I在两组椎间盘中的表达与AI值呈负相关(rs=-0.60,P<0.01),IGF IR在两组椎间盘中的表达与AI值呈负相关(rs=-0.57，P<0.01)。IGF I、IGF IR阳性椎间盘与阴性椎间盘比较，AI值有显著差异(P<0.05)，见表3。表3 IGF I、IGF IR的表达与AI的关系3 讨 论 椎间盘细胞凋亡与增殖一样都是机体自然的生理过程，两者并存，且保持动态平衡。如果椎间盘细胞生长因子缺乏，凋亡过多，不能有效调节生长发育，这种平衡破坏，就会导致IDD[5]。有研究表明，IGF I能刺激软骨细胞增殖，并可延缓及阻止多种体细胞的凋亡[6]。IGF I是一种低分子量、具有合成代谢、生长促进和胰岛素样作用的多肽，在体外培养条件下与IGF IR结合具有维持细胞表型，促进细胞外基质合成、抑制凋亡和促进细胞增殖的作用。目前细胞培养与动物实验研究均表明IGF I促进细胞增殖生长的活性主要由IGF IR介导，IGF I、IGF IR的表达下调与IDD密切相关[7]。王磊等[8]发现，在人退变椎间盘细胞培养液中加入IGF I能使其合成?型胶原的能力显著提高。本实验研究结果显示，正常及退变人体椎间盘组织中均存在IGF I、IGF IR的表达，但B组(47.17%、39.62%)明显低于A组(75.00%、68.75%)，两组比较有显著差异(P<0.05)。提示IGF I、IGF IR的异常表达与人腰IDD密切相关，并在人IDD过程中起着重要作用。本次实验所选取正常对照组为年轻外伤后手术椎间盘组织，至于年龄及外伤引起的炎症反应是否对实验结果有所影响，有待今后进一步研究。 IGF I、IGF IR的主要功能为促进细胞增殖及细胞外基质的合成。PI是评价细胞增殖活性的主要参数，现已作为一项评估细胞增殖状态的指标广泛用于各项研究。Osada等[9]证实了牛髓核细胞有IGF I mRNA的表达和IGF IR的存在，IGF I通过自分泌或旁分泌的方式发生作用，外源性IGF I可促进牛髓核细胞蛋白聚糖的合成。本研究结果显示，B组PI值低于A组，两组比较有显著差异(P<0.05)。本研究结果还显示，人体椎间盘组织IGF I、IGF IR阳性组PI值明显高于IGF I、IGF IR阴性组，两组比较有显著差异(P<0.05)，并且IGF I、IGF IR阳性率与PI值呈正相关。提示IGF I、IGF IR低表达可能通过抑制细胞增殖促进了椎间盘退行性变的发生。 IDD的发生与细胞凋亡的紊乱有关[10]，IGF I及其受体是抗凋亡信号的主要调节者。Gruber等[11]在1%血清中培养纤维环细胞，引起明显凋亡，然后在培养液中加入50,500 ng?ml-1 IGF I，椎间盘细胞凋亡的比例明显降低，体外培养椎间盘细胞中IGF I具有明显的抗细胞凋亡作用，从而保持活细胞的数量。本研究结果显示，B组AI值高于A组，两组比较有显著差异(P<0.05)。本研究结果还显示，人体椎间盘组织IGF I、IGF IR阳性组AI值明显低于IGF I、IGF IR阴性组，两组比较有显著差异(P<0.05)，并且IGF I、IGF IR阳性率与AI值呈负相关。提示IGF I、IGF IR低表达可能通过促进细胞凋亡导致了IDD的发生。 综上所述，IGF I、IGF IR的异常表达与人IDD密切相关;IGF I、IGF IR具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用，其异常表达可能导致IDD的发生。IGF I、IGF IR有望作为检测IDD及分子生物学治疗的指标，值得临床进一步探讨。 【