甲状腺微粒体过氧化物酶及其单克隆抗体的制备

甲状腺微粒体过氧化物酶及其单克隆抗体的制备 甲状腺微粒体过氧化物酶及其 3 单克隆抗体的制备 免疫学教研室 薛 茵 牛乃谦 王金龙 潘菊芬 摘要 本工作共分 3 部分: ?取健康人甲状腺组织, 经匀浆、 超声波处理及不同速度离心去除其中细胞碎片, 胞核和线粒体, 再经超速离心沉淀, 即获得粗提的甲状腺微 ()粒体过氧化物酶 。?以此粗提 免疫小鼠, 取其脾细胞与 细ƒ2ƒT PO T PO BA L B C SP O 胞杂交,经组化染色这些单抗能与人甲获得分泌抗 单抗的杂交瘤细胞系多株, T PO 状腺微粒体结合。?用这些单抗与活化的 偶联, 将粗提 作亲和层析, 4Sep h a ro se B T PO 获两个洗脱峰, 将洗脱液用邻甲基氧基苯酚法测定 活性, 证明第二个峰有 活 T PO T PO 性, 其比活性为 277178ƒ纯度比粗提品高 40 倍。本研究对目前由于 抗原纯, Gu m gT PO 自身抗体检出率的难可能有重要参考价值。度不够而影响抗 TM 关键词 纯化; 抗 单克隆抗体; 亲和层析T PO T PO 引言材料和方法 自身免疫性甲状腺炎患者血清中可出现多一、 粗提 的制备: 将甲状腺组织粉 T PO 种自身抗体。 其中, 甲状腺球蛋白自身抗体 碎, 混悬于 0115内, 于匀浆器内, 制成 M KC l () () 和甲状腺微粒体自身抗体 已 T GA b TM A b ( 组织匀浆。经超声波处理后 15, 10 秒ƒ次KH z经作为诊断这类疾病的重要, 并且认为 1, 2 ) ×4, 用不同离心速度, 离心组织匀浆, 除去 比 更具诊断意义。 最近还证 TM A b T GA b 其中的细胞碎片、 细胞核和线粒体。 最后超速 实诱导 的自身抗原是甲状腺微粒体中 TM A b 3 () 的过氧化物酶 。T PO 离心, 收集沉淀物, 溶于 202缓冲 mM T r isH C l 检测 和 以往多采用间接血 ()T GA b TM A b 液 810, 含 011。此即为粗制 ,pH mM K IT PO 凝技术, 由于其敏感性较差, 近年来, 用酶联 于- 70?保存, 用于进一步纯化, 或用于制备 () 免疫吸附测定 技术检测 和 EL ISA TM A b 单克隆抗体。T PO 日渐增多。 在建立 的 检 T GA b TM A b EL ISA 二、的纯化: 取粗提 制备的单克 T PO T PO 测方法中, 遇到的主要问题是不易获得高纯度 隆 抗 体 按 2单 克 隆 抗 体ƒ活 化 琼 脂 糖 m g m l 的 或 抗原。 按常规方法制备的 TM T PO TM的比例, 使 单克隆抗体与活4Sep h a ro se B T PO 化 偶联。柱床体积为 30。层析 4Sep h a ro se B m l ( 柱用缓冲液 218 含10, 7或 抗原常混有 抗原, 方 A mM T r isH C lpH 影响 T PO T G EL ISA ) 011% 脱氧胆酸盐平 法的特异性。011, 015, mM K IM KC l 针对上述问题,我们利用亲和层析技术制衡。将粗制 加于柱床。加样体积为每克湿 T PO 重琼脂糖 115样品。 层析柱于 4?静置 2 小备了较高纯度的 。 我们还进一步制备了 m l T PO 单克隆抗体, 为提纯甲状腺微粒体抗原或 ,首先用缓冲液洗脱, 其次用缓冲液时后 T PO A B ( 15% 脱 0建立检测 的方法打下基础。011411, 1, , 0T PO M N H O H M K IM KC l 3 本工作为市科委资助课题 934009005 的一部分 表 1 4亲合层析纯化 各过程的活性 Sep h a ro se B T PO )氧胆酸盐。流速为 015ƒ。洗脱液收集于 m lm inT PO 蛋白浓度比活性 T PO 试管内,215。 于 280测定各管每管 m lnm OD 步 骤总活性 ( ) ) (Λgm gm g ƒGU ƒ() ƒGU m l 值。 26108 108 107 03匀浆 三、活性的测定: 用邻甲基氧基苯酚 T PO 500?g 18196 0104 2111 ( 法测定。将待测 样品溶于 2714T PO m l PB pH 5000?g 12198 0106 4162 )含 40邻甲基氧基苯酚。 反应开始时加入 mM 20, 000g? 6139 0106 9139 160, 000? g , 使其终浓度为 013。在室温下检测邻 H 2O 2 mM 2170 0107 25193 盐析 甲 基 氧 基 苯 酚 的 氧 化 反 应。 检 测 波 长 为 2170 0117 62196 亲合层析 4 470。nm 0136 0110 277178 以上述粗提四、单克隆抗体的制备: T PO 1?, 1 注:离心后, 收集沉淀物免疫 6, 8 周龄ƒ小鼠。 初次免疫 T PO BA L b c 21 盐析, 60% 饱和硫酸铵用 60加等体积弗氏完全佐剂, 制成乳 Λg T PO 剂, 注入腹腔, 每周 1 次, 共 2 周。 于第 3 和 第 6 周进行加强免疫,剂量为 30。。1 周后, Λg8 7 制备小鼠脾细胞, 以 3×10脾细胞与 3×10 Sp 20 细胞融合, 促融剂为 。 融合后, 细胞ƒP E G 混悬于 培养液内, 于 37?5%1640R PM IHA T 下培养 7 天。然后改用培养液, 继续培 CO 2 H T 养 10, 14 天。以 粗提物为抗原用 T PO EL ISA 法检测培养物上清液中的 抗体。 用有限 T PO 稀释法将选出的阳性杂交瘤细胞进行了 3 次再 克隆。选择能稳定分泌抗体的细胞株, 注入 10 天前腹腔注入 的 小鼠腹腔。ƒP r istan e BA L b c 10, 14 天后, 收集腹水, 测定抗体效价, 保存 于-70?。将杂交瘤培养上清经小鼠 分型血 Ig () 清作免疫球蛋白型别鉴定 双扩散法。 五、组织化学染色: 甲状腺组织切片与 单克隆抗体作用后, 用 染色观察 T PO A BC 单克隆抗体与甲状腺微粒体的结合。生物 T PO 24亲合层析 图 1Sep h a ro seB 素标记第二抗体和酶标记生物素—亲和素复合 二、单克隆抗体: 共获三株能稳定分 T PO 物由军事医学科学院提供。 泌 单克隆抗体的杂交瘤细胞。 用小鼠 T PO Ig结 果 分 类血清鉴定, 其分泌 的 单 克 隆 抗 体 均 为一、的纯化: 表 1 结果表明, 按常规 T PO 。 甲状腺组织切片经用此单克隆抗体作 1IgG方法制备的 抗原的纯度较低。 虽然经超T PO 染色显示, 微粒体均已着色, 与文献报道 A BC ()完全相同 图 2。表明我们制备的单克隆抗体 ,抗原的比活性仅为速 离心和盐析后T PO 能与甲状腺微粒体抗原结合。 为了进一步鉴定 62196ƒ。在此基础上, 用亲和层析方法进 GU m g单克隆抗体的特异性, 将纯化 抗原与单 T PO 一步纯化, 经缓冲液和依次洗脱, 可获两A B 克隆抗体充分混合, 于 4?过夜。次日, 加适量 个洗脱峰。第一峰较大,无 活性。第二峰 T PO () 于 4?过夜。离心后, 测的 6000, P E G M W 较 小, 但 表 现 出 活 性, 其 比 活 性 为 T PO 活性。图 3 显示, 经上述处 定上清液内的 T PO () 277178ƒ纯度提高达 40 倍 图 1。, GU m g 理后, 上清液内 活性明显减弱。上述结果 。经盐析浓缩后, 以 层析。这 2T PO T PO Sep h a ro se B 5, 6 表明, 制备的单克隆抗体是甲状腺微粒体过氧 种方法制备的 常常混有 。 针对这 T PO T G 化物酶的抗体。 一问题, 我们在此方法的基础上, 合并使用了 亲和层析。经此改良后, 制备的 抗原纯度 T PO 可提高 40 倍。用 方法鉴定, 与 单克EL ISA T G 隆抗体无交叉反应, 基本达到“免疫纯”的纯度。纯度的提高, 主要是在亲和层析中使 T PO 用了 单克隆抗体。这表明 单克隆抗 T PO T PO 体将成为 纯化、抗体和 抗原检 T PO T PO T PO 测的重要工具。 长期以来, 对自身免疫性甲状腺炎的研究 重点之一就是 和 的检测及其临 T GA b TM A b 床意义。 我室也曾观察到甲状腺疾病患者血清 中 和 水平升高的现象, 并认为 T GA b TM A b 和 水平可作为自身免疫性甲状 T GA b TM A b 7 腺炎的诊断标准。但是, 就我们所知, 尚未见 图 2 甲状腺组织切片与本工作制备的单克隆抗体作到有关患者血清 抗原的报道。因此, 我们 T PO 用染色, 见微粒体均已着色用后,A BC 8 既往的报道, 检测了甲状腺疾病患者血清中 的 抗原。共检测 6 种甲状腺疾病 81 例患 T PO 者。发现 抗原阳性率高达 5119% , T PO TM A b 阳性率为 2814% , 阳性率仅为 1213% , T GA b 血清中的 抗原可能与甲状腺组织损伤程T PO 度有关, 换言之,血清 抗原可能不是自身 T PO 免疫性甲状腺炎的诱因, 而是其结果。 即甲状腺组织损伤后释入血清。 这种假设尚待进一步 证实。 参 考 文 献 1 , A lde r T R e t a lS tud ie s o f com p lem en t ac t iva t io n and IgG 2, subc la ss re st r ic t io n o f an t ith y ro g lo bu linC lin E xp Im 2 . 1984; 56: 383m uno l 2 , 2Po gue r U e t a lA n t ibo dyD ep enden t C e llM ed ia ted C y to to x2 ic ity aga in st H um an T h y ro id ce lls in H a sh im o to ’ s T h y ro id i2 , . 1984;t is bu t N o t G rave s D isea seC lin E ndo c r ino l M e tab 59: 734 与对照组比图 3 经本工作制备的单克隆抗体处理后,3 , . , C za rno ck aBe t a lP u r if ica t io n o f th e h um an th y ro id p e ro x i2 较 活性明显降低T PO da se and it s iden t if ica t io n a s th e m ic ro som a l an t igen invo lved 讨 论. . 1985; 190: 147o n au to imm une th y ro id d isea se sF EB S L e t t 制备高纯度 抗原是建立检测 T PO T PO 4 N ak agaw a, H. e t a l, A new p ro tea se in ho g th y ro id ly so 2 抗体或 抗原 方法的关键。以往采 T PO EL ISA 2. som e s IT h e p re sence o f a leup ep t in sen sit ive p ro tea se in 用的常规提取方法主要是将甲状腺组织匀浆离 . .th e so lub le f rac t io n o f th y ro id ly so som e sA c ta E ndo c r ino l 心, 除去其中的细胞碎片、细胞核、线粒体。再 1981; 98: 383 ()下转第 9 页 用去垢剂、 高渗盐溶液或蛋白酶处理, 释出 1984; ( ) 4 娄建石、张海波、刘艳霞等 1 无创性心功能血流动力学计算 6 2: 94, 97中华物理学杂志( )( ) 1996206213 收稿 机实时监测系统 中国药理学通报 1996; 12 1: 94, 98 5 刘忠权、徐瑞俊、王近中等 1 狗的心阻抗微分图正常值分析 D ETERM INA T IO N A ND A NALY S IS O F HEA RT FUNCT IO N BY IM PED A NCE CA RD IO GRA PHY IN M ICE X ie Sh ao fen e t a l (), , D ep a r tm en t of P h a rm acology T ianj in N u rsing S ch oolT ianj in 2A bstra c t T h e h ea r t fu n c t io n w e re de te rm in ed b y im p edan ce ca r id io g rap h y w ith no n in va sive 30 h ea r t fu n c t io n an d h em o dyn am ic com p u te r m o n ito r in g sy stem in m ice u n de r in t rap e r ito n ea l . , , so d ium p en to b a rb ita l an e sth e siaT h e C A an d C w ave s w h ich app ea red c lea r ly in im p edan ce ca r2 , . d io g rap h y p a ra lle led an d re spo n ded th e P Q R S an d T w ave s in EC GT h e re su lt s show ed th a t th e 55215?8017 ƒ186?4180, 58183?9113, 2150?0188ƒ , 25H R w a s b ea tm in P E P m sL V E T m sCO m l 218?18616 。, 464, ƒm in H I o hm sT h e d iffe ren ce w a s no t fo u n d b e tw een m a le an d fem a le m iceb u t , , .fo u n d am o n g m icera t srab b it s an d o th e r sp ec ie s ; ; Key word s h ea r t fu n c t io ninp edan ce ca rd io g rap h ym ice 魏宏生等, 几种非甲状腺疾病血清甲状腺自身抗体测定的评7 () 上接第 6 页价。天津医药 11989; 5: 272 5 , , H aw k in s BR e t a lD iagno st ic sign if icance if th y ro id m ic ro 2 8 薛茵等, 甲状腺微粒体过氧化物酶单克隆抗体制备和应用 1 . .som a l an t ibo d ie s in random ly se lec ted pop u la t io nL ance t ( ) 天津医药 1996; 23 8: 502, 503 ( ) 1980; 2 8203: 1057 ( )1996201216 收稿 6 . . , M a r io t t iSe t a lSo lub iliza t io n o f H um an T h y ro id M ic ro so 2 . . . . 1979; 48: 207m a l A n t igenJC linE ndo c r ino lM e ta ()- PREPA RA T IO N O F A NT ITHY RO PERO X ID A SE TPO M O NOCLO NAL A NT IBODY A ND TPO PUR IF ICA T IO N N iu N a iq ian e t a l ()D ep a r tm en t of Im m u nology 1. A bstra c t T h ree m a jo r co n ten t s w e re de sc r ib ed in th is p ap e r: H ea lth y th y ro id t issu e w e re t rea ted b y hom o gen iza t io n , sup e r so n ic, an d cen t r ifu ga t io n o f d iffe ren t sp eed, th e ce ll deb r is, n u c le i () , an d m ito cho d r ia co llec ted in th e p e lle t w e re d isca rdedan d th e c ru de th y rop e ro x ida se T PO w a s . 2. ƒo b ta in ed b y u lt racen t r ifu ga t io nT h e sp leen ce lls o f BA L B c m ice imm u n ized b y c ru de T PO 20 , ƒw e re fu sed w ith SP ce ll lin ean d h yb r idom a ce lls sec re ted T PO m o no c lo n a l an t ibo dy () . M cA b w e re o b ta in edT h e imm u no h isto ch em ist ry sta in in g show ed th a t th e T PO M cA b s can re2 . 3. ac t w ith m ic ro som e o f h um an th y ro id ce lls sp ec if ica llyT h e c ru de T PO w a s p u r if ied b y aff in ity 24, ch rom a to g rap h y co lo um in se r ted b y an t iT PO M cA b co n ju ga ted ac t iva ted Sep h ro se B Tw o e lu2 2, , t io n p eak s w e re o b ta in edb y u sin g O m e tho x yp h eno l m e tho dit w a s dem o n st ra ted th a t th e seco n d . , 277178ƒ, 40 p eak h ad T PO ac t iv ityth e ac t iv ity ra t io w a s GU m gan d show ed t im e p u re th an th a t . o f th e c ru de T POIt is su gge sted th a t th e se re la t ive p u re T PO m igh t sa t isfy a se ro lo g ica l a ssay 2.fo r de tec t in g th e an t iT PO au to an t ibo dy in p a t ien t’ s se rum 2; ; Key word s an t iT PO m o no c lo n a l an t ibo dyT PO p u r if ica t io naff in ity ch rom a to g rap h y