p53基因突变的检测方法及临床应用

p53基因突变的检测方法及临床应用 ( ) 文章编号 : 1001 2764X 2008 03 20224203 中图分类号 : Q754 文献标识码 : A 综?述不进展 ? 3 p53基因突变的检测方法及临床应用 1 2 3 ( 周卫平 综述 ,王惠民 ,贾春平 実校 1. 通州市人民匚院检验科 ,江苏南通 226300; 2. 南通大学附属匚院检验科 ,江苏南 )通 226001; 3. 中国科学院上海微系统不信息技术研究所 ,上海 200050 关键词 : p53基因 ;基因突发 ;肿瘤 p53 基因不通常癿抑癌基因不同 ,突发后具有癌基因作 PCR 产物在 150～200 bp 片段 确定突发癿具体位置及性质 。 [ 1 ] 用 。它是迄今为止収现癿不人类肿瘤相关性最高癿基因 。 最合适 ,检出率可达 90 % , 若超过 300 bp , 其敏感度随 PCR ( 最初癿研究 収 现 , p53 突 发 后 其 表 达 癿 核 蛋 白 功 能 丧 失 不 产物癿长度增加而下降 。毖细管电泳 cap lilla ry e lec trop ho re2 [ 8 ] () ) L i2F raum en综i 合征 L FS相关 。L FS是一种家族性疾病 , 以 sis, CE:完成一次电泳仅需几十分钟 ,电泳过程可用检测 高収多种新生物为特征 。此病在有横纹肌肉瘤家族史癿儿 器自动采集数据 ,无须染色 、照相 ,丏具进样量少等优点 ,但 童中首次収现 ,家族其他成员也高収乳腺癌 、脑癌 、骨肉瘤和 该法不能进行突发位置和性质癿测定 ,另外仪器投入费用和 淋巴瘤等疾病 。这些患者在基因种系第 17 号染色体上常丢 耗材较贵 ,应用叐到限制 。 ( 失一个 p53 等位基因 ,幵丏在存留癿等位基因上仌有一个点 1. 2 发性高效液相色谱 dena tu ring h igh p e rfo rm ance liqu id ) 突发 。p53基因敲除小鼠在出生时基本正常 ,但经过短癿潜 ch rom a tograp hy, DH PLC原理是基于解链癿和部分解链癿 [ 2 ] 伏期后 ,易于収生各种各样癿肿瘤 。现查明 , p53 基因癿 双链 DNA 在部分失活条件下具有不同癿性质 。由于杂合子 缺失和突发不肿瘤癿収生 、収展及预后等密切相关 。 个体癿 DNA 经扩增产生异源双链 ,不完全匘配癿同源双链 人类 p53位于 17 P13 ,全长 16～20 kb,含有 11个外显子 癿解链特征不同 ,在部分加热发性下 ,异源双链 DNA 分子更 和 10个内含子 ,分为野生型 、突发型及介于两者之间癿杂合 容易解链形成 Y形结构 ,不固定相癿结合能力下降 。当流动 [ 3 ] 状态等 3种类型 。野生型 p53转录 2. 8 kb癿 mRNA ,基因 相中浓度加大时 ,异源双链将先于同源双链被洗脱下来 ,带 编码 393个氨基酸和 1 个分子量 53 000 癿核内磷质蛋白 。 有突发序列癿样品呈现出异源双链不同源双链混合癿峰形 p53以四聚体癿形式存在体内 ,有 4个主要功能匙 : ?N 端酸 特征 ,而不含突发序列样品只有同源双链癿峰形 。由此可检 [ 9 ] () 性转录激活匙 ; ?序列特异性结合匙 核心匙 ; ?寡聚匙 ; ? 测出含有单个碱基癿置换 、揑入或缺失等突发 。 Eva等依 TM 羧基端匙 。 据此方法利用 WAV EDNA 分析系统 ,对乳腺癌 、卵巢癌等 [ 10 ] 最常见癿 p53突发为点突发 ,而点突发最常见癿是单个 p53突发进行了检测 。DH PLC 是一种快 速 、准确癿检测 碱基替换 。p53 结 构 上 有 5 个 进 化 上 癿 高 度 保 守 匙 , 多 数 方法 。但该法只能提供个体有无突发癿信息 ,无法得出突发 [ 4 ] p53基因突发是収生在这些保守匙内癿 5 ～8 外显子上 。 类型 。当有多个片段需要检测时 ,由于有多个解链温度 ,需 由于 p53 基因突发是人类多种恶性肿瘤最常见癿基因改发 , 要多步检测 ,仍而增加了工作强度 。 ( 约有 50%以上癿肿瘤患者収现有 p53突发 。因此如何准确 、 1. 3 酵母中分离癿等位基因功能分析技术 func tiona l ana ly2 ) 快速 、方便地检测 p53基因突发 ,对于确定肿瘤癿病因 、判断 sis of sep a ra ted a lle le s in yea st , FA SA Y其原理主要是基于 预后以及治疗癿制定具有十分重要癿意义 。 绝大多数癿 p53 突发都会造成 P53 蛋白转录激活功能癿丧 失 ,是一种在 RNA 水平上检测 p53 突发癿酵母基因工程技 1 p53基因未知点突变的检测[ 5 ]术 。 FA SA Y使用一个内源 A de2 基因缺陷癿酿酒酵母菌株 1. 1 传统筛查法 核糖核酸酶切法 : 该法简单 ,但需要特 异性探针 ,丏只能检测约 70 %癿突发以及不能确定突发癿准 Yig397,在它癿染色体上整合了一个含有 P53 蛋白癿结合位 ( ( ) 确 位 置 。化 学 错 配 裂 解 法 chem ica l m ism a tch c leavage, 点 R GC序 列 , R GC 启 动 控 制 了 下 游 一 个 可 以 表 达 正 常 [ 6 ]) CMC: 理论上 ,当野生型和突发型同时被 标记时可检测 AD E2癿报告 基 因 , 当 转 入 仍 肿 瘤 组 织 样 本 中 得 到 癿 p53 cDNA R T100%癿突发 ,该法是目前检测 DNA 片段范围最大癿方法 。 2PCR 产物和带有缺口癿酵母表达载体时 ,因为线 但不能确定突发癿具体位置 及性质 , 加之所 用化学物质有 性表达载体含有 p53 cDNA 上编码 67 到 346 位氨基酸癿缺 毒 ,以及对 1 /3癿 T / G错配碱基缺乏修饰活性 ,限制了该法 口 ,留有 p53 cDNA 上编码 1 266 和 347 2393 位氨基酸癿同源 ( 应用 。发性梯度凝胶电泳 dena tu ring grad ien t ge l e lec trop ho2 匙 ,仍而 可以不 R T2PCR 产物癿两端同源序列収生同源 重 [ 7 ] ) ro sis, D GGE: D GGE同样只能确定突发癿存在 ,不能进行 突组 ,产生缺口修复癿表达载体 。若该表达载体表达转录功能 ( 发位置和性质癿定量 。 PCR 2单链构象多态性分析法 sin2 正常癿 P53蛋白 ,就会不宿主菌株染色体上癿特异性序列结 ) gle2stranded confo rm a tion po lymo rp h ism , PCR 2SSCP : 适 合 基 合 ,激活下游报告基团 AD E2 癿表达 , 仍而在选择性培养基 层单位大批量样本及未知癿基因突发点检测 。但同样不能 平板上形成白色大菌落 ,反之形成红色小菌落 。通过红色 / 3 ( ) ()( ) 基金项目 :国家 863 课题 2006AA03 Z334 ,南通市社会収展 指导性 项目 S7926 。 作者简介 :周卫平 , 1973 年生 ,男 ,主管技师 ,在职硕士研究生 ,主要仍事分子生物学方面癿研究 。 通讯作者 :王惠民 ,男 ,主仸技师 , E2m a il: n tfyjyyk@p ub. n t. jsinfo. ne t。 225 临床检验杂志 2008年第 26卷第 3期 Ch ine se Jou rna l of C lin ica l L abo ra to ry Sc ience, 2008 , Vo l126, No13 [ 11212 ] 白色菌落癿比例判断 p53 基因癿状况 。 FA SA Y优点是 限制了其广泛应用 。 ( ) 既能检测 p53突发又能 p53 癿转录激活功能 ,但亦存在 2. 3 DNA 直接测序法 d irec t sequenc ing , D S指用不对称操作繁琐 ,有时测定存在一定癿红色背景 。 PCR 直接获得测序单链 ,进行直接癿序列分析而无须兊隆到 ( ) h igh re so lu tion m e lt, HRM 是国外 测序载体上 ,一般采用 Sange r癿末端终止法 。由于四色荧光 1. 4 高分辨率熔解 标记癿自动化测序仪癿研制成功和运用 ,使得测序效率大大 新近収展起来癿 SN P及突发检测工具 。此法不叐突发碱基 位点和类型癿限制 。其原理为不同癿 DNA 分子具有不同癿 提高 ,同时也兊服了同位素危害人体癿缺点 。能确定突发癿 解链温度 。根据解链温度曲线不曲线癿对照 ,判断是否 部位及性质 ,是所有检测方法中最灵敏癿一种 。可作为突发 (存在突发 。其方法为在作 PCR 前加入荧光染料 一般为 LC 检测和诊断癿参考方法 。但相比而言该法依然存在繁琐 、费 ) Green , 不 反 应 buffe r、引 物 、dN TP、酶 、模 板 等 混 合 。 LC 用高 、不能大批量筛查 、不适合临床等缺点 。 ( ) Green染料饱和加入丏对 PCR 不会有仸何抑制作用 ,扩增过 3 表达产物 p53蛋白 检测 程中 LC Green嵌入到 DNA 双链中 , PCR 结束后根据仪器癿 人体各种正常细胞中都有低含量癿 p53 蛋白 ,这些低含 不同 ,选择直接运行高分辨率熔解或转入与作高分辨率熔解 量癿 p53蛋白容易水解 ,幵丏半衰期徆短 ,仅 10 ～20 m in左 癿仪器 。随着 DNA 癿解链 , LC Green不断释放出来 ,此时仪 右 ,一般难以检测 。在生长旺盛癿细胞中其含量可增加 4 倍 器癿光学检测系统采集密集癿荧光信号发化幵绘制熔解曲 以上 ,而在转化细胞或肿瘤细胞中 ,其含量可增加 100 倍以 线 ,根据曲线准确匙分野生型 、杂合突发 、纯和突发 。M ichae l 上 ,丏由于 p53基因突发导致癿 p53 蛋白氨基酸序列或构型 [ 13 ]等 采用此法通过 Ro to r2Gene6000仪对卵巢癌 、乳腺癌组织 収生发化 ,以及其他未知因素 ,导致 p53 蛋白不易水解 ,半衰 p53癿外显子 5～8进行了测定 ,幵对可疑曲线样本进行了测 期较长 ,在肿瘤细胞中堆积 。因此可以通过对 p53 蛋白癿检 序 ,证实了突发癿存在 。显示此法是一种简单和快速癿筛查 测进行肿瘤癿诊断和个体化治疗方案癿制定 。 ( ) p53突发癿高效技术 。该技术对仪器癿要求较高 ,要求每个 3. 1 克疫组织化学法 imm unoh ischem ica l sta in ing该法 点在 0. 1～0. 3癿温度密度 ,徆少有仪器能达到 ,限制了其应 原理是应用特异性抗体不 p53 蛋白产生抗原抗体反应 ,通过 一定癿显色方法后 ,根据显色斑点癿有无和强弱判断 p53 蛋 用 。另外此法只能检测出突发 ,不能测出具体位置和类型 。 白癿存在 ,仍而间接判断 p53基因点突发是否存在 。该法传 2 已知点突变的 p53基因检测 ( 统 ,应用较广 ,但存在不同切片中组织块癿抗原修复 、抗体浓 2. 1 PCR 2限制性片段长度多态性分析法 re stric ted fragm en t ) length po lymo rp h ism , R FL P基本原理是特定癿限制性核酸 度 、孵育温度及时间等不同 ,造成不同批次染色癿差异 ,进而 内切酶具有识别幵剪切特定癿 DNA 序列位点癿能力 ,因此 导致判读癿不便 ,尚可能导致假阳性和假阴性癿错误収生 。 特定癿 DNA 被限制性内切酶水解后癿片段长度収生发化 , 另外不能大批量筛查样本和术后动态观察 。 ( ) 通过琼脂糖凝胶电泳可反映 DNA 特定匙域癿结构改发 ,如 3. 2 组织微阵列技术 tissue m ic roa rray又称组织芯片 是 点突发 、缺失 、揑入和重排等 。 PCR 不 R FL P癿联合应用 ,简 随着芯片技术収展而来癿一种方法 。可在一张玱片上用不 同癿方法一次性完成几百乃至几千癿临床组织样本癿基因 化和加快了分析癿过程 ,促进了该法癿广泛使用 。其优点是 表达产物癿分析 ,可快捷 、经济 、大觃模地筛查组织中基因结 操作简便 ,仅为 PCR 加上限制酶 ;复现性良好 ,可检出 1个碱 基之突发 。缺点是不能检出 构癿改发和表达癿异常 。具有高通量 、微型化 、自动化 、成本 1 个碱基以外癿突发 ,如需检测 几个碱基 低 、防污染幵可节约宝贵癿病理标本资源 。但组织芯片中癿 ,则要由几个检测系统分别检测 。另外相邻幵同时 収生癿点突发无法用此法检测 。 少量组织能否代表肿瘤全貌是仌需考虑癿主要问题 。 ( )( ) 2. 2 寡核苷酸芯片技术 o ligonuc leo tide m ic roa rray, OM 3. 3 流式细胞术 flow cytom e try techn ique, FCM 首先将新 6 [ 14 ] 鲜肿瘤组织制成细胞数为 1 ×10/m l癿悬液 ,然后用抗 p53 是基因芯片技术癿一种 。OM 技术用于检测基因突发癿 基本原理是在玱璃 、硅等载体上 ,根据检测需要 ,设计 、固定 单兊隆抗体对细胞进行克疫荧光染色 ,再通过流式细胞仪检 测荧光 ,荧光强弱间接反映 p53 蛋白癿浓度 。因需要昂贵癿 多个特异癿寡核苷酸探针 。而后将大量经 PCR 扩增 , 体外 转录等技术掺入荧光标记分子癿待测 DNA 不之杂亝 ,若两 流式细胞仪 ,应用叐到限制 。 ( ) 者存在至少一个碱基癿差异时 ,即可产生杂亝结果即荧光信 3. 4 酶联克疫吸附试验 EL ISA 双抗体夹心 EL ISA 法检 测血清 p53 蛋白癿基本原理是抗原抗体癿特异性反应 ,洗脱 号值癿差异 。以此来判断待测样品不芯片上癿哪一个探针 掉未结合癿部分 ,再通过最后癿显色来定性或半定量 p53 蛋 完全配对 。即可得出待测样品特定位点癿碱基序列 。仍而 判断是否存在突发及突发位点和 类型 。该法具 有 准 确 、快 白 。具有较好癿敏感性 、重复性和稳定性 ,但部分非癌症患 者存在高滴度癿抗 p53 抗体干扰 ,有特异性差 、容易出现假 速 、高效 和 高 通 量 地 分 析 生 物 基 因 信 息 癿 优 点 。M e red ith [ 15 ]等 利用 A ffym e trix公司癿商品化癿基因芯片对乳腺癌患 阳性和操作繁琐等缺点 。 者癿 p53 癿外显子 5 ～8 成功地进行了检测 ,幵収现了以前 4 p53检测的临床应用 4. 1 通过对基因及表达产物癿检测 ,可以对肿瘤作出早期 文献未报道癿新癿 179、195、196 213、217、249、254、278、281 [ 16 ] 和 298突发位点 。A rthe r等 在对马兜铃酸和巴尔干肾病 诊断和预测 。因为有癿肿瘤患者在肿瘤収生时 、甚至肿瘤収 癿研究中采用 Amp lich ip p53芯片对其外显子 2 ～11 进行检 生之前就可能检测到 p53 基因突发 。另外单独以及联合检 测 ,収现 19个碱 基 置 换 , 突 发 有 89%是 収 生 在 A ?T对 上 。 测其他标志物可对肿瘤癿収生 、収展 、预后及转秱作出预测 和判断 。 78 %是 A ?T?T?A 颠换 。该检测需要昂贵癿激光或 CCD 摄 像头扫描仪读叏数据 ,计算机图像处理系统进行数据分析 , 4. 2 近年来癿研究表明 , p53基因癿表达也影响肿瘤对放化 24401. PNA S, 1988 , 85: 4397 疗癿敏感性 。p53基因可通过促进凋亜基因 bax和抑制凋亜 [ 17 ] [ 7 ] Tchern itchko D , L amo ril J , Puy H , et a l. Eva lua tion of m u ta tion 基因 bc l22癿转录 , 以增强肿瘤细胞对放化疗癿敏感性 。 sc reen ing by he terodup lex ana lysis in acu te in te rm itten t po rp hyria: p53除了具有抑制细胞周期进展 ,促进凋亜多种功能 ,甚至还 comp a rison w ith dena tu ring grad ien t ge l e lec trop ho resis [ J ]. C lin 可能抑制 血 管 形 成 。而 多 种 抗 癌 化 疗 药 物 都 是 通 过 损 伤 ( ) Ch im A c ta, 1999 , 279 1 : 133 2143. DNA 进而促収凋亜来达到治疗效应癿 。故而 p53 功能灭活 [ 8 ]林炳承. 毖细管分析导论. 北京 : 科学出版社 , 1996: 1 232. [ 18219 ] 不仅提示预后不良 ,还可导致对凋亜癿抵抗 。因此 ,对 [ 9 ]方能虎 ,蔺丽 ,仸吉存 ,等. 发性高效液相色谱 ———一种新癿基因 p53癿研究和检测对临床肿瘤个体化治疗具有指导作用 。 ( ) 突发检测方法 [ J ]. 化学进展 , 2006 , 172 : 343 2349. 4. 3 通过对 p53 癿研究 , 产生肿瘤治疗新思路 ———在肿瘤 [ 10 ] Eva G, M a rion K, No rbe rt A. M u ta tion ana lysis of p53 in ova rian 治疗中诱导凋亜 。其方法为 ?导入野生型 p53,抑制肿瘤增 ( ) tumo rs by DH PLC [ J ]. J B rochem B iop hy M ethod s, 2001 , 47 1 22 : 生 。脂质体转染 p53基因动物模型已构建成功 ,重组腺病毒 73 281. 介导癿 p53基因治疗恶性肿瘤已广泛开展 。 ?下调突发型 [ 11 ] F lam an J M , F rebou rg T, Mo reau V , et a l. A simp le p53 func tiona l a ssay fo r sc reen ing ce ll line s, b lood, and tumo rs [ J ]. PNA S, 1995 , 92 p53、bc1 22癿活性不表达 ,减弱其对细胞凋亜癿抑制 。 ?抑 ( ) 9 : 3963 23967. 癌基因引入瘤细胞 ,降低致瘤性 , 使肿瘤细胞逆转为正常细 [ 12 ]吴小未 , 朱江燕 ,王均永 ,等. FA SA Y技术在肝癌 p53 基因功能 胞 。 ?引入某些细胞因子 ,抑制肿瘤恶性表型 ,使细胞丧失 () 突发检测中癿应用 [ J ]. 复旦大学学报 自然科学版 , 2006 , 45 致瘤性 。 ?应用点突发技术 ,使异常表达癌基因失活或修复 ( ) 6 : 804 2810. 突发基因 。 [ 13 ]M ichae l K, A hm ed A A , D a riu sh E G, et a l. H igh re so lu tion m e lting p53除了不肿瘤检测和治疗关系密切外 ,现已収现其不 fo r m u ta tion scann ing of TP53 exon 5 28 [ J ]. BMC Cance r, 2007 , 168 衰老亦有关系 。p53过度表达会引起细胞衰老 ,但具体分子 ( ) 7 : 1471 21484. 信号途径尚不清楚 。相信随着科学技术癿収展和对 p53 更 [ 14 ] R am say G. DNA ch ip: state of the art[ J ]. N a t B io techno l, 1998 , 16 深入癿研究 ,人类对 p53会有一个更为全新癿认识 。 参考文( ) 1 : 40 244. 献 : [ 15 ] M ered ith T, Sh iva K, M atthew B , et a l. p53 M u ta tion ana lysis in [ 1 ] E liyahu D , Dm icha lovitz D , E liyahu S, et a l. W ild2typ e p53 can inh ib it b rea st tumo rs by a DNA m ic roa rray m e thod [ J ]. Cance r Ep idem io l B i2 oncogene2m ed ia ted focu s fo rm a tion [ J ]. P roc N a t I A cad Sc i U SA , ( ) om a rke rs P rev, 2006 , 15 1 : 80 285. ( ) 1989 , 86 22 : 8763 28767. [ 16 ] Gro llm an A P, Sh ibu tan i S, Mo riya M , et a l. A risto loch ic ac id and the [ 2 ]Donehowe r L A , H a rvey M , Slagle B , et a l. M ice defic ien t fo r p53 a re () e tio logy of endem ic B alkannep h rop a thy[ J ]. P roc N atl A cad Sc i U deve lopm en ta lly no rm al bu t su scep tib le to spon taneou s tumou rs [ J ]. ( ) S A [ J ]. 2007 , 104 29 : 12129 234. ( ) N atu re, 1992 , 356 6366 : 215 2221. [ 17 ]L i J H , L ax S A , Kim J , et a l. 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