蛋白质的纯化方法

蛋白质的纯化方法 蛋白质 在外加电场作用下，带电的蛋白质颗的纯 粒在电场中移动的速度(v)取决于化 电场强度E，所带的净电荷q，蛋方 白质的分子量、分子形状以及与介质法 的摩擦系数f。 几种常用的电泳 纸电泳 醋酸纤维薄膜电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE 可分为圆盘电泳和垂直平板电泳) 琼脂糖凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦IEF 双向电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 电影 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE是利用 聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳蛋 法，聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙稀酰白质 胺和交联剂甲叉双丙稀酰胺交联而成的 的多孔网状凝胶。纯 不连续PAGE有分离胶、浓缩胶和样品化 胶。方法 PAGE分辨率很高。电泳过程 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 SDS(十二烷基磺酸钠)是一种阴离子 型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽蛋 链中的氨基酸残基按大约1 1.4比例白 结合。质 每一个蛋白质分子都因为结合了许多的 的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质纯化 分子原有的电荷则可以忽略。该法主方 要利用了蛋白质分子量大小不同而分法 离蛋白质。 用已知分子量的蛋白质作为，则 可以估算出不同蛋白质的分子量。 等电聚焦 将两性电解质eg:pH3-9，pH5-7同 蛋白质样品一起加入到已经灌好的蛋 凝胶中，在电场下，两性电解质首白质 先达到它的等电点而平衡，蛋白质的 样品根据它自身的等电点分别向两纯化 极移动，最后也达到平衡。方 等电聚焦:这种按等电点的大小，生物法 分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚 焦的行为称等电聚焦。 等电聚焦的特点就 在于它利用了一种 称为两性电解质载 体的物质在电场中 构成连续的pH梯 度，使蛋白质或其 他具有两性电解质 性质的样品进行聚 焦，从而达到分 离、测定和鉴定的 目的。 蛋白质双向电泳银染结果 考马斯亮染色为蓝色连续电泳 几种常用的层析法吸附层析分配层析离子交换层析凝胶过滤层析亲和层析 柱层析 离子交换层析法 此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持 物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方 法。蛋 离子交换树脂可以分为阳离子交换纤维素白质 如羧甲基纤维素CM纤维素)等，阴离子交的 换纤维素如二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纯 纤维素)等。化 带正电荷多的蛋白质与纤维素结合较强，而方 带正电荷少的蛋白质与纤维素结合则较弱。法 用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进 行梯度洗脱，通过Na的离子交换作用，可 以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。 离子交换层析法蛋白质的纯化方法 凝胶过滤法 此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所 用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或蛋 聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的白 内部是多孔的网状结构。质的 Sephadex G10-G200葡聚糖凝胶纯 Sepharose2B4B6B琼脂糖凝胶化方 Sephacryl S100S200S300S400法 聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶 分子筛层析的工作原理也叫凝胶过滤层析 亲和层析法 这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理 是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的蛋 特殊配基具有不同的识别和结合能力。白 选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作质 用的配基，然后应用化学方法将该配基与载的 体共价连接。将这种连接有配基的载体装入纯 层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过化 层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结方 合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流法 出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白 质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。 亲和层析法 常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋 白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼蛋 脂糖凝胶等。白质的纯化方法 蛋白质纯度等的测定 纯度和分子量的测定:采用电泳 (如聚丙烯酰胺凝胶电泳)、分子 筛层析、高速离心、高效液相色谱 等技术测定。 等电点的测定:利 用等电点时溶解 度最低或等电聚焦方法测定。 亚基个数的测定:采用SDS聚丙烯 酰 胺凝胶电泳方法测定。Go Home