注射用重组葡激酶的中试研究

注射用重组葡激酶的中试研究 于敏等:注射用重组葡激酶的中试研究 厂,/注射用重组葡激酶的中试研究 ,/ , /(1997:~-9月1日收1 . 学于室 孙 _ 翠 k~ 娥 200 朱 03 运 2) 松拍舻 籼室 . l,摘要… 谱参数可直接放大至I业化生产. 关键词:重丝萱壅堕,士垫丛主 一 ,弓 葡激酶(staphyl.kinase,sAK)是由溶血性金黄色葡萄球菌分泌的一种外毒素,具有 潜在纤 溶活性_1].在人血浆中与人纤溶酶原形成1:1的复合物,如果没有纤维蛋白存在时,该复合物的 活性迅速被一抗纤溶酶抑制{有纤维蛋白存在时,纤维蛋白与町抗纤溶酶竞争纤溶酶原分子上的 赖氨酸结合位点,使a抗纤溶酶难以发挥抑制作用,复合物中的纤溶酶原激活成纤溶酶.因此 SAK能高效激活血栓周围的纤溶酶原,特异地溶解血栓而不诱发系统性纤溶状态,即其纤溶活性 具有纤维蛋白专一性.此外由于SAK分子量小,穿透性能好,对富含血小板的血栓,尤其是脑动 脉血栓和肢体静脉血栓的溶解比其它溶栓药物具有更强的疗效]. 早期的葡激酶研究主要是从金黄色葡萄球菌培液中分离纯化,由于量少及安全性差始终未能 用于临床.8O年代以来用重组DNA技术研究重组葡激酶口"],由于工程菌达量低,纯化困难而 未达到中试规模,没有用于临床的产品.1994年Collen,D.运用重组葡激酶治疗急性心肌梗塞, 虽然效果良好,但其工程菌表达r-SAK量低,纯化路线繁琐,得率仍然很低口]. 本研究室于1993年克隆了葡激酶基固并成功地实现了在大肠杆菌中的高效表达,而且建立了 小规模的r?SAK纯化路线0?.随后又开始了中试规模的放大实验性研究.我们建立了工程菌高密 度发酵工艺,并优化了纯化过程中的色谱条件.目前已建立了20L罐发酵技术和纯化工艺,批产 量8,10g蛋白.三批中试研究结果证明整个纯化路线简便,回收率高,成本低,同时由于采用径 向色谱柱,色谱参数稳定,可直接用于工业化生产]. 二,材料与方法 1,材料 (1)菌种STE.SAK,本研究室构建. (2)试剂蛋白胨(Oxoid,UK),酵母提取物(Oxoid,UK),酪蛋白水解物(Sigma,US) ?863计蜘资助项目(1031301—02). @男.1962年生,硕士.讲师;研究方向基因工程药物研制,原工作单位;山东省泰山医学院基础部 @联系人 f45 秘 , 俄 锣 言 Aq 高技术通讯1998.1 SephadexG一75(Pharmacia,Sweden),Q—ScpharoseFF(Pharmacia,Sweden),SAK标准品(中 国生物制品鉴定所提供),其它化学试剂均系国产品. (3)仪器设备发酵罐(NewBrunswickScientific,USA)高压匀浆机,离心机,液相色谱仪 (Watersdelta—prep4000,USA),薄层扫描仪(ShimadzuCS一910,Japal1),Superflo一500coluren (SERPRAGEN,USA). 2.方法 (1)发酵种子液:从LBA平板挑单个菌落接种于150mlLB培液中,30"C振摇8小时后接种 于1500ml培液中,30?继续培养8小时,作为发酵种子液.发酵:发酵罐内加入12升M.CA培 液,调节pH,温度,搅拌速度及溶氧,至参数稳定后,将种子液接种于发酵罐内,发酵开始.发 酵参数:pH6—7,温度30c,溶氧50—80.其间以20CA及20葡萄糖补料.发酵6小时后开 始升温诱导,控制温度为42?,诱导3小时后停止发酵,离心收获细菌,称重后一20~C冻存. (2)细菌破碎及离心湿菌用0.02M(pH7.4)磷酸盐缓冲液悬浮,重量(g)/体积(m1)约 为1t1O.高压匀浆泵用同样缓冲液冲洗后,加入细菌悬浮液,压力为50MPa,循环三次,匀浆液 离心后弃去沉淀. (3)硫酸铵分级沉淀离心上清在搅拌下加入固体硫酸铵,使饱和度达到30,4?静置2小 时,10,000rpm离心25min弃沉淀.上清继续加入固体硫酸铵,使饱和度达到90,静置过夜,离 心后留沉淀. (4)凝胶过滤硫酸铵沉淀用0.02M磷酸盐缓冲液(pH7.4)复溶,离心后上清过5×1000cm ScphadexG一75柱,用Waters色谱仪控制流速并记录蛋白峰,测定各组分中r—sAK活性,收集活 性主峰.测定蛋白浓度及r—SAK活性,结合sDs—PAGE及凝胶扫描数据分析各组分中r—SAK含 量. (5)离子交换Q—SepharoseFF—Superflo一500径向柱用10倍柱体积磷酸盐缓冲液平衡.凝胶 过滤收集的活性组分调节pH后上柱,以Waters色谱仪控制流速和检测蛋白峰.上样结束后用2, 3倍柱体积的磷酸盐缓冲液洗脱未结台的杂蛋白,至基线平稳后,以0r1MNaC1连续梯度洗脱, 收集洗脱组分并测定各组分r—SAK活性及蛋白质浓度.洗脱主峰为纯化的SAK 半成品.用SDS- PAGE和CS一910薄层扫描仪鉴定r—SAK的纯度. (6)注射用重组葡激酶成品半成品按如下比例加入辅剂:r—SAK:25万Hu/瓶;NaHPO: 1.33mg/瓶;NaH2PO.:0.3ling/瓶;人血清白蛋白;6rag/瓶. 无菌过滤,分装,冷冻干燥后即得注射用重组葡激酶成品. 三,结果 1.发酵 20L发酵罐高密度发酵,30?发酵6小时,然后42?诱导3小时,最终OD6可达20以上,每 升发酵液可收获细菌30克左右. 2.细菌破碎 重组葡激酶是以活性可溶性状态存在于大肠杆菌的胞浆内,以高压匀浆泵破碎细菌,离心后 除去不溶性细菌菌体蛋白.用革兰氏染色镜检匀浆前后的细菌数,结果表明,压力在50MPa左右 细菌破碎率可达95以上. 3.纯化 (1)硫酸铵分级沉淀细菌匀浆,离心后上清中加入固体硫酸铵,在饱和度30左右SAK基 一 46— 于敏等:注射用重组葡激酶的中试研究 本不沉淀,而部分细菌蛋白盐析,离心后被除去.继续加入固体硫酸铵,使饱和度达到90%,此 时绝大部分r—SAK蛋白被盐析. DCBA 囝1麓胶过滤分离r—SAK色谱囝圈2SDS-PAGE分析凝胶过滤的部分圈3离子 交换r—SAK色谱田 A:杂峰j收集液A:上样峰? B1r-SAK峰A;上样jB:杂蛋白;CD:古r_SAK组分Br-SAK峰 DCBA 塑囊 圈4SDS-PAGE分析离子交换各组分圈5薄层扫描图 A上样jB:来结合组分 C:舍r-SAK组分}D分子量标准 (2)凝肢过滤硫酸铵沉淀的蛋白质用磷酸盐缓冲液复溶后,通过SephadexG一75 柱,收集含 有r—SAK活性组分,SDS—PAGE分析表明纯度达80以上.凝胶过滤及DSD— PAGE分析结果如 图1和图2. (3)离子交换径向柱纯化Q—SepharoseFF—Superflo一500柱用磷酸盐缓冲液平衡 至柱前后pH 一 致,将凝胶过滤收集的含r—SAK组分调节pH后上柱,流速50ml/mln.,并用2,3 倍柱体积的 B==__=__=??. 1 ^ /_ , _-.? aa鲁一《b 00"0 》器害.一0 》;00一0 >0l00一, 》:0.00, >=000 >000_00 uz00一z# :^_, 嚣=#,— #JE #一'=* 00 .'o? ..N一 N一 =一 ._一 ? ?,?, 一 一一一 ?0_一 誉.0一 0 h— a.0一 .0— 一0 高技术通讯1998.1 磷酸盐缓冲液洗脱至基线平稳.以0~IMNaCI梯度洗脱r—SAK,收集含r—SAK活 性的组分,SDS. PAGE鉴定纯度可达99以上.离子交换色谱记录如图3.SDS—PAGE及薄层扫描的结果见图4和 图5. 三批中试产品各步纯 化数据见表1. 四,讨论 葡激酶能特异地激活 血浆纤溶酶系统,从而溶 解血栓,作用过程中血浆 纤维蛋白原浓度几乎不受 影响,因而具有临床应用 前景.我们在构建了高效 表达工程菌的基础上,建 衰1连续三批中试研究的结果 立了中试规模的高密度发酵方法,每升发酵液收获湿菌达30g以上.用机械法破碎细菌,速度快且 破碎效率高.由于工程菌在特定条件下短时间内大量合成r—SAK,合成其它蛋白的种类和数量显 着减少,因此表达r—SAK水平高达45以上,而且以活性可溶性状态存在].工程菌表达水平高, 杂蛋白少,经分子筛及离子交换两步法即可得到高纯度,高活性,各项质控指标达到部颁标准的产 品.与国外报道用离子交换和疏水色谱后还需加一步分子筛的纯化方法相比【,我们建立的中试工 艺,色谱过程简便,成本低,蛋白回收率和活性回收率高.此外我们采用径向柱,其色谱条件能线性 放大,多柱串联或并联使用时不影响其分离效果0].因此我们的中试工艺可用于工业化生产. 参考文献: [1]LackCH.Nature.1948,161559 [23LijnenHR,VanHoefB,DecockFeta1.J.Bio/.Chem.1991,261:11826 [3]SilenceK,CollenD,LijnenHRela1.Blood.1993,82:1175 [43CollenD.SchloftB,EngelborghsYeta1.J.Biot.Chem.,1993,268:8284 [53SakoT.SawakiS,SakuraiTeta1.Md.Gm.G.,1983.190:271 [63CollenD,DeMolM,DemarsinEeta1.Fibrinolysis,1993.7:242 [73SchlottB,MarLmannM,GuhrsKHela1.B~echnology,1994,12:185 [83宋后燕.一种重组葡激酶的制备方法,ZL94112105.4 [93刘国诠.陈国良,苏天升等.生物工程下游技术.北京化学工业出版社,1993,260 ThePilotStudiesofRecombinantStaphylOkinase forInjeetion (receivedSept.1+1997) YuMin,ZhangXiaoxuan,RenJun,CaiXu,SunCuie ZhuYunsong,SongHouyan (DepartmentofMolecularGenetics,ShanghaiMedicalUniversity,Shanghai200032) Abstract Aneffectiveandrapidpilotproductionprocedareofrecombinantstaphylokirmasewasestablished onthebasisoftheconstructionofthehighexpressionengineeringbacterium.Afterastepofgelfil— trationandastepofionexchange,thequalifiedsemi?finishedproductofrecombinantstaphylokinase /orinject|0nwasobtained.Therecoveriesofbothproteinsandactivitywereover40.Moreover,as theradialflowcdumninionexchangechromatographyWasemployed,theprocedurewaseasytobe scaleduptotheindustrialproductionofr_SAK. Keywords:Recombinantstaphylokinase,Pilotstudy 一 48—