压应力对小鼠单核细胞RAW264.7 DNAX活化蛋白12、抗酒石酸酸性磷酸酶表达的影响

压应力对小鼠单核细胞RAW264.7 DNAX活化蛋白12、抗酒石酸酸性磷酸酶达的影响 压应力对小鼠单核细胞RAW264.7 DNAX活化蛋白12、抗酒 石酸酸性磷酸酶表达的影响 [摘要] 目的 探讨压应力对小鼠单核细胞raw264.7 dnax活化蛋白12(dap12)、抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)表 达的影响。 以小鼠单核细胞raw264.7为研究对象，采用四点弯曲体外细胞加载装置加载压应力0、3、6、12 h，分别以逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)、蛋白免疫印迹法检测dap12、trap mrna和dap12蛋白的表达情况。结果 小鼠单核细胞raw264.7经破骨细胞培养液培养后，体积变大，核数目增多，trap染色阳性。受压应力刺激后，dap12、trap mrna及dap12蛋白表达随加力时间延长而增加(p1.4.2 逆转录生成cdna第一链 取1 μg总rna，按逆转录试剂盒说明进行逆转录，生成20 μl cdna第一链。 1.4.3 pcr扩增 实验引物序列具体如下。dap12上游引物序列:5’-ggctgggattgttctgggtgac-3’，下游引物序列:5’ -ccgctgatgggcatagag-tgg-3’。trap上游引物序列:5’-acacagtgat-gctgtgtggcaactc-3’，下游引物序列:5’-cc-agaggcttccacatatatgatgg-3’。gapdh上游引物序列:5’-aagcccatcaccatcttcca-3’，下游引物序列:5’ -cctgcttcaccaccttcttg-3’。 按照takara taqtm pcr试剂盒说明生成20 μl pcr产物。pcr扩增条件如下。dap12:94 ?预变性5 min，开始循环94 ? 20 s， 58 ?退火20 s，72 ?延伸25 s，共35个循环，72 ?彻底延伸10 min，4 ?保存。trap:94 ?预变性5 min，开始循环94 ? 30 s，58 ?退火30 s，72 ?延伸25 s，共35个循环，72 ?彻底延伸10 min，4 ?保存。gapdh:95 ?预变性 5 min，开始循环95 ? 30 s，58 ?退火30 s，72 ? 30 s，共30个循环，72 ?彻底延伸10 min，4 ?保存。 1.4.4 pcr产物凝胶电泳 各取20 μl pcr产物进行1.5%琼脂糖凝胶上电泳(电压100 v)，凝胶成像系 统照相并用quantity one-4.0.3凝胶图像软件测量其积分光密度值(integral optical density value， iod)。分别计算dap12 mrna、trap mrna与gapdh mrna rt-pcr 产物电泳带iod值之比。 1.5 蛋白免疫印迹法检测dap12蛋白的表达 首先应根据欲分离的蛋白质相对分子质量大小选择适合的凝胶浓度。本研究分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为4%。常规提取蛋白质，并测定浓度。 1.6 统计学分析 采用spss 17.0统计软件对实验数据进行分析。实验结果以mean?sd表示，p3.2 压应力刺激对破骨细胞分化的影响 trap是破骨细胞特有的标志酶，是破骨细胞分化的标记物，也与破骨细胞骨吸收功能密切相关[6-7]。 检测trap的表达情况可反映raw264.7细胞的功能状态。 本研究发现:在rankl和m-csf联合作用下，压应力刺激可提高raw264.7的破骨细胞特征，而对照组这种变化并不明显。机械外力的这种诱导能力与其对细胞刺激的时间长短有关，刺激时间过短，并不能引起破骨细胞的高度活化，只有机械外力刺激一定的时间后破骨细胞的活化才变得更加明显。这与临床上正畸牙的移动情况有些相似，短暂的力学刺激(咬合力或短暂的正畸力等)作用于牙齿并不能引起牙齿的移动，只有持续的正畸力才能引起牙齿移动。 3.3 压应力刺激对raw264.7细胞dap12 mrna和 蛋白表达的变化 破骨细胞来源于骨髓造血系统的单核细胞系，破骨细胞的分化与成骨细胞密切相关。成骨细胞可表达rankl，通过细胞间接触与破骨前体细胞胞膜上的rank受体结合，激活rank介导的信号传导通路来诱导破骨前体细胞向破骨细胞分化[8]。近年来 的研究表明破骨细胞的分化除了要激活与rankl和 m-csf相对应的细胞膜受体及相对应的细胞内信号通路外，还需要其他的信号通路参与调节[9-10]。itam 信号传导通路在骨代谢平衡或病理性骨改建(像炎 症性骨吸收等)过程中起重要调节作用。dap12作为itam信号传导通路的一种主要衔接蛋白，其介导的信号传导通路在破骨细胞分化过程中发挥重要作用。正畸牙移动是个炎症反应过程[11]，这可能引起局部 的免疫反应。dap12介导的信号传导通路作为在炎症性骨吸收过程 中发挥重要作用的信号通路是否也参与调节正畸移动过程中牙槽骨的改建和调节机械力诱导破骨细胞分化，目前尚未清楚。 本研究发现压应力在刺激raw264.7细胞后，dap12 mrna表达随着压应力刺激时间的延长逐渐增加。表明dap12可能参与了破骨细胞对机械力刺激的应答反应。如前所述，2 500 μtrain的压应力随着作用时间的增加可逐步上调破骨细胞分化标记物trap mrna的表达，这与dap12 mrna表达的趋势类似，故笔者推测dap12可能参与调节机械压应力诱导raw264.7细胞的破骨细胞表征的过程。mrna是从转录水平进行研究，它并不能完全体现蛋白质的表达水平。蛋白质是生理功能的执行者，对蛋白质的研究更能阐明各种生理或病理条件下生命现象的变化机制。本实验发现在受到压应力刺激3 h后，dap12蛋白表达水平增加并不明显;随着压应力刺激时间的延长(6、12 h)，dap12蛋白表达水平逐渐增高。这与mrna的变化基本相似。综上所述，受到压应力刺激后，raw264.7细胞dap12 mrna和蛋白表达发生改变，提示dap12参与调节机械力学刺激诱导破骨细胞的分化。 [参考文献] [1] zou w， zhu t， craft cs， et al. cytoskeletal dysfunction domi- nates in dap12-deficient osteoclasts[j]. j cell sci， 2010， 123(pt 17):2955-2963. [2] humphrey mb， daws mr， spusta sc， et al. trem2， a dap12- associated receptor， regulates osteoclast differentiation and func- tion[j]. j bone miner res， 2006， 21(2):237-245. [3] burr db， milgrom c， fyhrie d， et al. in vivo measurement of human tibial strains during vigorous activity[j]. bone， 1996， 18(5): 405-410. [4] torstveit mk. bone adaptation to mechanical loading[j]. tidsskr nor laegeforen， 2002， 122(21):2109-2111. [5] cullen dm， smith rt， akhter mp. bone-loading response varies with strain magnitude and cycle number[j]. j appl physiol， 2001， 91(5):1971-1976. [6] halleen jm， tiitinen sl， ylipahkala h， et al. tartrate-resistant acid phosphatase 5b(tracp 5b) as a marker of bone resorption [j]. clin lab， 2006， 52(9/10):499-509. [7] rissanen jp， suominen mi， peng z， et al. secreted tartrate-re- sistant acid phosphatase 5b is a marker of osteoclast number in human osteoclast cultures and the rat ovariectomy model[j]. calcif tissue int， 2008， 82(2):108-115. [8] suda t， udagawa n， nakamura i， et al. modulation of osteoclast differentiation by local factors[j]. bone， 1995， 17(2 suppl):87s- 91s. [9] theill le， boyle wj， penninger jm. rank-l and rank: t cells， bone loss， and mammalian evolution[j]. annu rev immunol， 2002， 20:795-823. [10] boyle wj， simonet ws， lacey dl. osteoclast differentiation and activation[j]. nature， 2003， 423(6937):337-342. [11] garlet tp， coelho u， silva js， et al. cytokine expression pattern in compression and tension sides of the periodontal ligament du- ring orthodontic tooth movement in humans[j]. eur j oral sci， 2007， 115(5):355-362. (本文编辑 杜冰)