獭兔KAP和FGF5基因的多态性与经济性状的关系

獭兔KAP和FGF5基因的多态性与经济性状的关系 獭兔KAP和FGF5基因的多态性与经济性 状的关系 丽北磨'}2009,18(6):1217 ActaAgriculturaeBorealioccidentalisSinica 獭兔KAP和FGF5基因的多态性与经济性状的关系 宦霞娟,陈玉林 (西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100) 摘要:分析獭兔KAP基因和FGF5基因的多态性与经济性状的关系,为獭兔下一步的性状改良提供理论 基础.利用PCR-SSCP技术对KAP基因的4个位点进行遗传变异检测,通过SPSS软件下的GLM程序分析 15O只獭兔KAP基因2个多态位点及FGF5基因2个多态位点不同基因型的最小二乘均值(LSM),最小二 乘效应值(LSE)及其遗传方差;通过标记位点与胴体性状和毛皮性状的遗传相关预测了选择反应.结果表 明:獭兔KAP3.2位点可作为胴体深和被毛密度的标记位点,KAP6—1位点可作为獭兔体质量,胴体质量和被 毛长度性状的标记基因型的标记位点,FGF5—1位点可作为体质量,胴体质量,皮质量和被毛密度的标记位 点. 关键词:獭兔;KAP;FGF5;经济性状;PCR-SSCP 中图分类号:$813.3文献标识码:A文章编号:1004—1389(2009)06—0012—06 TheRelationshipbetweenPolymorphismofKAPGene,FGF5 GeneandEconomicTraitsforRexRabbit HUANXiajuanandCHENYulin (CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA8LFUniversity,YanglingShaanxi 712100,China) Abstract:RexrabbitsgeneticpolymorphismofKAPandFGF5genewasstudiedandtherelationship betweenpolymorphismlOCiandeconomictraitswasanalyzedinordertofindmolecularmarkerof MAS,providingtheorybasisfornextmolecularbreeding.ThepolymorphismofgeneswasstudiedU— singPCR— SSCP.Theleastsquaremean(LSM),theleasteffect(LSE)andgeneticvarianceofdifferent genotypeat4polymorphismlociwereanalyzed,usingGLMprocedureofSPSSsoftware.Theselection reactionwasforecastedbygeneticcorrelationbetweenmarker1OCiandgeneticvarianceofeconomic traits.Theresultsshowedthat:KAP3.2一 BBwerethefavorablemarkergenotypesforRexrabbittho— racicdeepthandwooldensitytraits,FGF5—1一 AAwerethefavorablemarkergenotypesforRexrabbit bodyweight.carcassweight.tareweightandwooldensitytrait.FGF5—3一 AAcouldbeusedasthe bestmarkergenotypesforRexrabbitbodyweight,carcassweightandthewoollengthtrait. Keywords:Rexrabbits;KAP;FGF5;Economictraits;PCR—SSCP 獭兔(Rexrabbit)是世界上着名的毛皮兼用 型兔种,獭兔毛皮具有很高的利用价值,而且肉 质细嫩,因此,对獭兔皮张性状和胴体性状进行深 入分析,为獭兔选育提供依据是十分必要的.在 鼠中,有70多种基因突变影响被毛形态,许多突 变对被毛的长度无影响,有些则使被毛变短,到目 前为止只有一种突变即angora鼠(最初命名为 go基因突变)引起被毛变长].这一突变现象引 起了众多学者的兴趣,研究证明安哥拉鼠是由 FGF5突变引起的.通过研究发现,兔毛生长发 育过程与毛囊/毛乳头有着密切联系l2].因此,研 究影响毛囊/毛乳头生长的相关因子对兔毛性状 收稿日期:2009—03—09修回日期:200906—12 作者简介:宦霞娟(1982一),女,江苏扬州人,硕士,专业方向:动物生物技术与分子生 物学研究.E—mail..huanxj@gmail.com *通讯作者:陈玉林(1964一),教授,博导,主要从事动物遗传资源与饲料资源开发研 究.E—mail:myxy11@263.net 6期宦霞娟等:獭兔KAP和FGF5基因的多态性与经济性状的关系 的选育有重要意义.大量的研究表明成纤维 细胞生长因子(FibroblastGrowthFactor一5 FGF5)是影响毛囊周期性活动及被毛生长的重 要生长因子. 毛纤维的主要结构蛋白为角蛋白(Kertain) 和角蛋白辅助蛋白(KertainAssociatedProtein, KAP).KAP蛋白又分为3类,一类为高甘氨酸 酪氨酸蛋白(high—glycine—tyrosineKAPs),由 KAP6.n,KAP7和KAP8编码;一类为高硫蛋 白(high—sulferKAPs),由KAP1.n,KAP2.n和 KAP3.n多基因家族编码;还有一类为超高硫蛋 白(Ultra—high—sulferKAPs),由KAP4.n和 KAP5.n多基因家族编码?1.KAP蛋白与角蛋 白中间丝相互交联,在毛发纤维形成过程中起到 非常重要的作用口.近几年,在毛发研究领域 中KAP基因的研究成为热点. 本试验通过PCRSSCP方法,研究KA_P 3.2,KAP6—1和FGF5基因外显子1和3在獭兔 不同基因型与毛皮性状和胴体性状的相关性,以 期找到与其高度相关的遗传标记,从而为獭兔毛 皮性状和动态性状的分子育种提供理论依据. 1材料与方法 1.1试验材料 在西安长安县应用随机抽样的方式抽取150 只獭兔,颈静脉采血,每只所采血样均为5mL,加 肝素钠抗凝剂,一80?冰箱冻存备用,采样同时记 录对应獭兔的生产性能.血液中的基因组DNA 酚仿抽提法,所提取的DNA样品溶于TE缓冲液 中,4?保存. 1.2主要试剂 蛋白酶K(ProteinaseK),Merck公司产品; TaqDNAPolymerase,Fermentas公司产品; dNTP,Fermentas公司产品;DNAMarker1,东 盛生物公司产品;三羟甲基氨基甲烷(Tris),丙烯 酰胺(Acrylamide),甲叉双丙烯酰胺(Bis—Acryl— amide),过硫酸胺,琼脂糖(Agrose),北京鼎国生 物技术发展中心产品;Tirs饱和酚,去离子甲酰 胺,西安沃尔森公司产品;十二烷基硫酸钠 (SDs),润德生物公司产品;四甲基乙二氨 (TEMED),华美生物工程公司产品. 1.3方法 1.3.1引物设计利用Primer5.0和Oligo6.0 引物设计软件,根据GenBank上报道的兔 KAP6—1基因全序列和FGF5基因1和3外显子 设计引物;KAP3.2基因的引物是根据GenBank 上其他物种,利用同源性克隆出獭兔KAP3.2基 因3部分外显子序列.引物均由上海生物工程 公司合成.引物序列及退火温度见表1. 表14个位点的引物序列和退火温度 Table1Primersequenceandannealingtemperatureof4loci 1.3.2PCR扩增4对引物均采用15ffLPCR 反应体系,组成为:10×Buffer(不含Mg)1.5 ffL,MgC12(25.0mmol/L)1.0肚L,dNTP(2.5 mmol/L)1.5"L,TaqDNA聚合酶(5U/taL) 0.2uL,Primer(10pmol/ffL)上下游各0.5ffL, DNA(8Ong/ffL)1.0L,ddH2O9.8/xL. 反应程序为:94nC预变性5min;94?变性30S,退 火30S,72?延伸45S,34个循环;72.C延伸10 min;一2O.C保存.PCR产物用1.5的琼脂糖 凝胶电泳检测. 1.3.3SSCP分析反应结束后取5LPCR产 物置于PCR管中,加1OL变性Buffer,98?变 性10min,迅速冰浴10min,PAGE电泳12,l4 h后,用银染显色.观察并结果,应用UDP GDS800成像仪照相. 1.3.4PCR产物的回收与测序经SSCP后, 将纯化回收不同基因型个体PCR产物,交由上海 生物工程技术服务有限公司测序. ? 14?西北农业18卷 1.4数据统计分析_】.] 1.4.1数据的统计分析所有数据在SPSS (16.0)统计分析下完成.对獭兔不同生产水平群 体经济性状资料进行最小二乘校正,以消除年龄, 性别等因素对遗传分析的影响.Yijk=+Sexi +Agej+eijk.Yijk为个体表型值,为群体均 值,Sexi为性别效应值,Agej为年龄效应值,eijk 为随机误差. 1.4.2各位点基因型与经济性状相关性数学模 型根据最小二乘线性模型,对群体KAP基因 各位点基因经济性状最小二乘均值(LSM)和最 ibz_乘效应值(LSE),采用如下模型:Yij一4- Markeri+eij.其中yij为个体表型值,为总体 均值,Markeri为基因型效应值,eij为随机误差. 由此模型估计出群体均值()和标记基因型 效应(Markeri),各基因型经济性状的最小二乘均 值LSM=+Markeri,而最小二乘效应值LSE — y一,并对各位点基因型间的LSM进行显着 性检验. 1.4.3遗传方差分析设P和q分别为A和B 2.2 分析 的等位基因频率,一1/2(LSMAA—L-sMRB);d— LSMA一1/2(LSM+LSMs),则该基因型的 加性方差一2g[盘+(g一)].,显性方差. 一 (2pqd),遗传方差VG—VA+VD.其中AA, BB分别代表纯合基因型,AB代表杂合基因型. 1.4.4标记位点与经济性状间的遗传相关(rA.) 估计RAG—iAArAG.由于:rAG—C0,AG/ (VAVG)";C0G—C0P—VA,VG—VD+VA, VD一(2pqd).,VA一2pq[a+d(q--p)].,所以,rA" 一 (/v;).式中,为标记性状的加性方 差,.为标记性状的显性方差. 2结果与分析 2.1SSCP检测结果 对4对引物的扩增产物分别进行SSCP检测 后,发现4个位点均存在多态性,均由1对等位基 因控制,出现3种基因型,分别标记为AA,AB和 BB型(图1). BBBBABABABABABABAAABBBABAAABBBBB 图1FGF5—3SSCP聚丙烯电泳 Fig.1FGF5'3geneSSCPanalysisofPCRamplification 獭兔体质量和毛皮性状标记基因型的效应BB型(P%0.05),而AA基因型和BB基 因型的 4个位点上不同基因型的体质量,胴体性状 及毛皮性状的最小二乘均值(LsM)和最小二乘 效应值(LSE)见表2.对各个位点不同基因型值 间进行显着性检验,结果表明:KAP3.2位点在 胴深和被毛密度性状上,BB基因型的LSM极显 着地高于AA基因型(P<0.01),而AA基因型 的LSM也极显着地高于AB基因型(P<0.01), 表明KAP3.2位点的BB基因型可作为胴深和被 毛密度性状的首选标记基因型;KAP6—1位点在 体质量和被毛长度性状上,AB基因型的LSM极 显着地高于AA型和BB型(P<0.01),AA基因 型也极显着高于BB基因型(P%0.01),胴体质量 性状上,AB基因型的LSM显着地高于AA型和 LSM差异不显着(P>O.05),说明KAP6—1位点 的AB基因型可作为体质量,胴体质量和被毛长 度性状的首选标记基因型;FGF5—1位点在体质 量和胴体质量性状上,AA基因型的LSM极显着 地高于AB和BB基因型(P<0.01),AB基因型 也极显着高于BB基因型(P<0.01),在皮质量性 状上,AA基因型的LSM显着地高于AB型和 BB型(P<0.05),而AB基因型和BB基因型的 LSM差异不显着(P>0.05),在被毛密度性状 上,AA基因型的LsM极显着地高于AB和BB 基因型(尸<0.01),AB基因型也极显着高于BB 基因型(P<0.01),说明FGF5—1位点的AA基 因型可作为体质量,胴体质量,皮质量和被毛密度 性状的首选标记基因型;FGF5—3位点在体质量 6期宦霞娟等:獭兔KAP和FGF5基因的多态性与经济性状的关系 性状上,BB基因型的LSM极显着地高于AB型因型,在被毛长度性状上,BB基因型的LSM极 和AA型(P<0.01),AA基因型显着高于AB基显着地高于AB型和AA型(P<0.01),AA基因 因型(P<O.05),在被胴体质量性状上,BB基因型显着高于AB基因型(P<O.05). 说明FGF5, 型的LSM极显着地高于AB型和AA型(P<3位点的BB基因型可作为体质量,胴体质量和被 0.01),BB和AB基因型都极显着地高于AA基毛长度的首选标记基因型. 表24个位点各基因型的体质量,胴体性状及毛皮性状的LSM和LSE Table2LSMandLSEforweight,carcasstraitsandfurtraitsat4loci 注:同一位点同列不同小写字母表示差异显着(P<0.05),不同大写字母表示差异极显着(P<0.01). Note:Atthesamelocus,differentsmalllettersinthesamecolumnindicatesignificantdifferen ce(P<0.05) thesamecolumnindicatequite. 2.3獭兔经济性状标记位点的遗传方差组分分 析 体质量,胴体性状及毛皮性状分别与4个位 点的加性方差,显性方差,遗传方差,选择反应及 遗传相关估计见表3.结果表明,FGF5—1位点的 遗传方差在体质量,胴体质量,皮质量和被毛密度 性状上均较大,而且加性效应分别占到98.99/6, 95.1,83.8和84.2,说明FGF5—1位点对 獭兔多性状标记辅助选择具有一定的可靠性.而 KA_P3.2和KAP6—1位点各性状上的遗传方差 有5O左右来自于显性效应,说明环境因素对獭 兔的生长发育也有着至关重要的作用.由此结果 可见,每个位点对经济性状的效应是不同的,有的 位点之间甚至相差很大,而且不同位点基因型的 效应并不完全相同,同一位点不同基因型的效应 也不相同,在不同位点基因型效应中加性效应和 显性效应所占比例亦不相同,这完全符合数量遗 传学中表型值剖分的有关理论.结合基因型的选 择,獭兔KAP3.2位点可作为胴体深和被毛密度 的标记位点,KAP6.1位点可作为獭兔体质量, 西北农业18卷 胴体质量和被毛长度性状的标记基因型的标记位量和被毛密度的标记位点. 点,FGF5,1位点可作为体质量,胴体质量,皮质 表3獭兔各性状各标记基因的遗传方差及选择反应 Table3Thevarianceanalysis,geneticcorrelationandselectionreaction ofdifferentmarkergeneforsometraitsinRexrabbits 3讨论与结论 3.1利用非连锁遗传的性状资料对数量性状进 行分子标记时,首先要分析各标记位点的基因型 效应值,基因型效应值不仅包含基因的加性效应, 还包含基因的显性效应,但能真正遗传给后代的 却只有基因的加性效应,因此加性效应是标记辅 助选择的重点.本研究分别对獭兔体质量,胴体 性状及毛皮性状的各标记基因进行了方差分析, 计算出了各基因型的加性效应和显性效应以及各 标记位点与生产性状的遗传相关,进一步确定了 各位点用于标记辅助选择的可靠性.通过生产性 6期宦霞娟等:獭兔KAP和FGF5基因的多态性与经济性状的关系 状与标记位点的遗传相关计算了各位点的选择反 应,确定了各性状的优势标记位点和优势标记基 因型,一般在几个标记位点中选择反应大的位点 可作为优势标记位点.例如,分别用KAP6.1和 FGF5基因标记獭兔体质量性状时,两个基因各 位点各基因型的LSM均有明显差异,但各位点 的加性效应分别占32.3,99.4和3.0,说明 KAP6.1和FGF5—1位点可作为獭兔体质量的标 记位点,FGF5—3不能作为獭兔体质量的性状的 分子标记. 3.2分别用KAP3.2和FGF5—1基因位点标记 獭兔被毛密度性状时,两个位点各基因型的LSM 均有明显差异,虽然,FGF5—1位点的遗传相关 (0.918)和加性效应(0.8421)都大于KAlP3.2位 点遗传相关(0.795)和加性效应(0.6320)的,但其 选择反应(1.781×10)小于KAP3.2(6.320× 10),所以,选择KAP3.2位点作为獭兔被毛密 度性状的优势标记基因.可选择KAP3.2位点 的BB基因型作为胴体深和被毛密度性状的优势 基因型,KAP6.1位点的AB基因型可作为獭兔 胴体质量和被毛长度的优势基因型,FGF5—1位 点的AA基因型作为胴体质量,皮质量性状的优 势基因型. 参考文献: [1]PennycuikPR,RaphaelKA.Theangoralocus(go)inthe [2] [3] [4] mousehairmorphology,durationofgrowthcycleandsite ofaction[J].JClinInvest,1999,104(7):855—64. PausR,CotsarelisG.Thebiologyofhairfollicles[J].N EnglJMed,1999,341(7):491-497. PausR.CotsarelisG.Thebiologyofhairfollicles[J].NEn— glJMed,1999,341(7):491497. H6betJM,RosenquistT,GtzJ,ela1.FGF5asaregulator ofthehairgrowthcycle:evidencefromtargetedandspon [5] [6] [7] [8] [9] El0] [11] [12] [132 [14] taneousmutations[J].Cell,1994,78(6):10171025. RosenquistTA,MartinGR.Fibroblastgrowthfactorsig— nailinginthehairgrowthcycle:expressionofthefibroblast growthfactorreceptorandligandgenesinthemarinehair follicle[J].DevDyn,1996,205(4):379—386. OtaY,SaitohY,SuzukiS,eta1.Fibroblastgrowthfactor5 inhibitshairgrowthbyblockingdermalpapillacellactiva— tion[J].BiochemBiophysResCommun,2002,290(1):169— 176. SuzukiS,KatoT,TakimotoH,eta1.Localizationofrat FGF5proteininskinmacrophage?likecellsandFGF-? 5Sproteininhairfollicle:possibleinvolvementoftwoFGF一 5geneproductsinhairgrowthcycleregulation[J].JInvest Dermatol,1998,111(6):963-972. SuzukiS,OtaY,OzawaK,eta1.Dual—moderegulationof hairgrowthcyclebytwoFGF-5geneproducts[J].Jinvest Dermatol,2000,114(3):456463. hoC,SaitohY,FujitaY,eta1.Decapeptidewithfibroblast growthfactor(FGF)一5partialsequenceinhibitshairgrowth suppressingactivityofFGF一5[J].JCellPhysiol,2003,197 (2):272—283. 张亚妮,张恩平,吴迪,等.KAP基因的多态性与辽宁 绒山羊经济性状的关系研究[J].中国农业科学,2007,40 (9):20622067. MichaelA.Rogers,LutzLangbein,eta1.HairKeratin AssociatedProteins:CharacterizationofaSecondHigh SulfurKAPGerieDomainonHumanChromosome211 lJ].InvestDermatol2004,122:147—158. MulsantP,deRochambeafiH,Th6baultRG.Anoteon linkagebetweentheangoraandFGF5genesinrabbits[J]. WorldRabbitSci,2004,l2(1):106. ZhouHM,AllainD,LIJQ,eta1.Efectsofnon—genetic factorsonproductiontraitsofInnerMongoliacashmere goatsinChinaEJ].SmallRuminantResearch,2003,47: 85—89. LandeR,ThompsonR.Eficiencyofmarker—assistedse— lectionintheimprovementofquantitativetraits[J].Ge— netics,1990,124:743,756.