用荧光探剂DPH测定微粒体膜脂区流动性的方法与应用

用荧光探剂DPH测定微粒体膜脂区流动性的与应用 用荧光探剂DPH测定微粒体膜脂区流动性 的方法与应用 H为甍光 探剂).其中包括DI’H的终浓度lx1O—mol/1.最适温育时同60mln左 右.样品的蛋白量50,1.(;mg,温 育及测量时的湿度以及埋冲藏的选掸同时,对正确操作与恻定的相 关经验且往意事璜也进行了归蚺与 总结 主题词娄孽重’荧光;錾塞;竺基璺曼兰旦兰; 中圈分类导Ras,33 内质网为细胞质基质中的骥性管道系统. 分布于瞧质各处,并具有蛋白质台成与分泌,糖 元受脂类合成,固酵娄激素合成与分泌,药物及 毒物代谢等多种功能.作为细胞生物膜系的… 部分.它具有生物膜的基本结构与特}正.膜脂流 动性.是指膜脂分子的运动状态,包括侧向扩 散,旋转运动,异构运动,围绕法线的振荡收缩 及翻转运动等多种运动形式0]膜流动性是生 物媵结构的基本特征之一合适的膜流动性是 达生物膜正常功能的必要前提{蘧着 SB.irfilzky等引入膜流动性的概念.其定量描述 也成为可能],从而为了解膜功能的机理及生 物学捷供了更客观,更直接的实驻基础.为探讨 内质胸膜腊流动性与内质网膜结合酶一混台功 能氧化酶系统括性之问的关系,我们在参考国 内外文献,的基础上,研究并探讨了用荧光 探剂测定内质网膜脂区流动性大小的方法和技 术;并将其应用于实际科研工作中,对该方怯的 可靠及适用性进行了验证. 1材料 1.1药品与试剂1.6二苯基一】,3.5一环己烯 (1,6-diphenyl一1,3,5-hexatriene,DPH)还原 型辅酶1(NADPH),细胞色素C等购于美国 Sigma公司;四氢咦喃为北京化37_厂产品,分祈 纯;余为市葺纯产品. l2仪器在岛津RF一540荧光分光光度计上 配备偏振器及恒温装戥用于荧光强度测定在 岛津UV一3000双波长烈光束紫外分光光度计 上进行巅粒体缅胞色素P一450系统酶学测定. 2基本方法 21肝微粒体制备肝脏经冰呤生理盐水镖 洗詹按文献”方法制戒25匀浆,依差速离心 法分别经9000×g,2Orain击沉淀及10500× g,B0rain去上清,得沉淀经Tris?HC1缓冲液 (毒EDTA10H]~IO】,l.DH7.4)冲洗.10500× z.{{)nfin,沉淀即为馓粒怿,以0,25mol/L蔗 糖格竣悬浮,置一80C冰箱保存备用Iowry 法蛋白含量一 2.2荧光探刺准备将I)PH溶于四氢呋喃, 锚成2×l0tool/1,的贮存液;用时以磷酸缓 冲液{PBS,25mmol/I,pH7.4)稀释1000倍, 剧烈振荡5rain.制成DPH稀释液. 2.3荧光标记与荧光强度测定的基本方法 将一定蛋白台量(待定)微粒体标本加1.5ml 的25mmol/I.PBS中.加入等体积的DPH 稀释液.于25C或37C水褡温育一定时同 (待定).在加偏振器的荧光分光光度计上恒温 潮定起偏器,检偏器置于不同方向(水平或垂 直)时的荧光强度.激发光被长362nm,发射光 波长432nm,光播置于激光光栅i0lllri,发射 协梆橙.等用荧光探剂DPH测定微粒俸膜脂匡筑动性的方{圭与应 用’19’ 光棚]0ntll 2.4膜脂流动性参数计算按下列公式计算 荧光偏振度P,符向异性及平均微枯艘1:P 】...Il_, 】,vtlvI:2p r【II”I,,2GIv_】’u.4I, 其寸_,C—I/I?.为校正因子.】,1为 起偏器在垂直方向,检偏器分别为垂直.水平力 向时的荧光强度:11”为起偏器置于球平位, 拙偏器分别置于垂直,水平方向时的荧光强度 膜脂流动性大小以上参数表达.P,7,1越大, 流动性越小:反之亦然. 3几个重要测定条件的确定 膜脂流动性大小受多种因素的影酮在测 定过程中,不同的测定条件测定时的理亿环境 及操作技术)会对测定结果产生较大的影响为 建立稳定,可靠的实验方法,我们在J的基车 攫{定方法的基础上.埘下几个重要的涮定条 件进行了确定 31温育时间I)Plt为扁氍形分于.亲脂性 强.可伸人膜脂深层烃链区.由于介质牯度娈 太.顺反异拘化受抑制而成为唯一能发荧光的 全反构型.因此,DPH标记成功后,应出现荧光 蜂值蓝移并伴有荧光强度增大.对多个微粒体 标本测定发现.加入DPH稀释后,随着温育时 问延长,荧光光谱逐渐蓝移.于第10ntin.发射 光潜峰值即由442IlIn移至432nrl1.激光光峰 值电位于562l:rll处【均为成功标记后的正常 峰值)但此时荧光强度仍处于持续上升过程 畸’至标记后30min,荧光强度增大至标记前 的0倍以上,并基本稳定.继续监测至 120min,荧光强度仍基本稳定(图1).同时,溯 定并计算微粒体膜荧光偏振度,结果见图2. 幽结果可见.标记30min后,膜荧光偏振 度也基本稳定因此,可将温育时间定为 60rain左右 3.2待测样品的蛋白质含量所加入的待最l 微粒体样品的蛋白质含量的多少会影响到标记 后测定的敏感性与稳定性为确立加入的样本 的台适的蛋白量,我们对同一样本及多个样本 分别进行加入不同蛋白量后荧光偏振度测定及 重复测定,结果见图3及4. 撤发光谱发射光谱 图IDPt{标记般粒体簇脂区后光光谱和发射光 谱A:样率LDP}{B:DPI-IC:样本D:缓冲踱 DPH:1.6一二|苯基1.3,5一环己烯 l_23c u 甍ll _I』{一 厦2zcI 时例I* 圈2微粒体簇用DPH标记时温育时闰对荧光信振度 ?的影响. 结果可见,多敬样本均表现为在样本 蛋白含量50,150Yg范围内,测定结果较稳定 【图3).同…样本重复测定也发现,在50,12.5 g蛋白古量范围内,测定结果较稳定,标准差 较小(图4).因此,可将测定样本的蛋白含量确 定在以上范围内如需节约样本用量,最低可仅 用50g蛋白古量的样本用量 3.3茬9定及温育的温度生物膜脂分子在不 圊的温度下处于不同的运动状态,正常生理条 ?20湖北医科大学第17卷 件下,膜脂多呈液晶态.当温度降至某一点时, 则由流动的液晶态转为晶态(凝胶态),即相变. 对不同温度下的膜脂流动性测定表明,不厨的 测量及温育温度其测定结果则完全不同(资料 {1 莪 庀【j 摄 蛊 Il!l5Jl75Ioo125l一 蛋白音量(?) 未给出).其中生理温度(37C)及常用的酶学 测定温度(25?)下微粒体膜的流动性参数见 表l. 羹{ j壬?一{一{.,-{ ‘?lj75-0【l1蟑150 蚤白音量(pg) 圈3不同搬敉体标本用DPH标记时蛋白古量对荧光圈4不同叠自 含量对萤光儡攘虞舅量的影响 儡撮虞量的辩响. 裹1不同蕊度下成年殛老年大豆肝徽牧体蠢脂区漉动性比较(土) 每缢6,8只大鼠,一P<2001+与25C时量值比较 结果可见,25?下温育及测定的微粒体膜 脂P,7及均明显高于37?下的测定结果(P <0,01).因此,仅讨论膜流动性的大小而不指 明特定的温育及测定温度是毫无意义的.具体 测定时可根据测定目的不同而选择37?, 25?或其它温度,并注意结果的可比性. 3+4缓冲液 参考文献]方法,我们选择了磷酸缓冲液 (25mmol/L,pH7.4).对不同组分的PBS(钠 盐,钾盐及钠/钾盐)应用结果表明,PBS的组 分不同对测定结果影响不大(资料未给出).但 PBS的浓度及pH值对测定结果有一定影响, 特别是pH值.因此,应强调PBS的pH值的准 确配定. 4应用 为探讨膜脂区流动性与散粒体混合功能氧 化酶系统活性之间的关系,我们依以上建立的 测定条件及方法对散粒体膜脂流动性进行了测 定(25?)],同时测定样品的细胞色素P一450 含量【’及NADPH细胞色素C还原酶活性, 结果见表2. 结果表明,经PB诱导的大鼠,肝散粒体细 胞色素P450含量及NADPH?细脆色素C还 原酶活性均明显增加(P<0.O1);同时徽粒体 膜脂流动性亦明显增大(p<0.01).相关性研 究表明,在PB诱导的大鼠及正常的大鼠,其肝 微粒体膜腊流动性与膜结合酶——NADPH-细 胞色素c还原群括性之间存在明显的相关性 博柳樵.等用荧光探剂DP!j测定错柱体膜脂区横c动住的方法与应 用 (柯荚性检验.<0.05).结果见困5 表2苯巴此妥大鼠与正常大鼠肝微粒体睡脂区流动性及NADPH一 细胞色素C 还原酶活性的比较t:jC刮土 黄光偏振度 囤5正常及苯巴此妥诱导大鼠肝散粒体睡睹区荧光 偏振度与NADPH衄胞色素C还原酶活性的散点图. 以上应用实例结果表明,如上所建立的内 质网膜脂流动性测定条件及方法能较好地反映 膜脂区流动性变化,具有较高的可靠性与适用 忖. 5技术要点 出于微粒体膜脂流动性受多种复杂因素的 影响,因此,要得到正确的测量结果,除了须遵 循以上所述测定方法外,操作过程中,还须特别 注意以下几点. 5.1温度的准确控制由于温度对测定结果 影响很大,因此测定过程中应尽量保持恒定的 温度.如尽量保持温育温度,测定环境及测定标 本室温度的致性,以减小温差对结果的影响. 届时,注意保持温度的恒定不变,以减少样品闻 测定条件的差异. 5.2温育时间的一致性虽然在一定的温育 时间范围内对测定结果影响不大,但在样本数 量较大的情况下.如果不注意,会出现温育时间 的差异过大.从而影响测定结果.因此,应预先 计划及协调如加样标记的时间问隔,臧小温育 对间不同耐结果造成的影响 5.3数据的读取样品标记后侧量时,上样 后,相对荧光强度数值往往在个范围内波动, 并存在一定的衰减因此.读取数据时,应待荧 .光强度相对稳定时尽早读取.特别是读取偏振 器皇上于不嗣状态下时的数据时,操作须熟练.操 作顺序一致,问隔时问应尽量缩短同时应注意 同标本读取数据时间的…致性, 54平行管为了尽量减少操作误差对测定 结果造成的影响.应作平行管测定. 55样本保存所搜9定的微粒体标本最好新 鲜制各如需保存则应置于深低温冰箱,并将样 本分装于小渣氮管中,尽量减少样本的解冻次 数.对同一样本的多次测定可取分装的小样本 进行. 参考文献 】杨福愉.生物膜的流动性.生物化学与生物物理学 报.1984;16;233. 2ShinitzkyM.BarenholzYFluidityparametersof lipidregionsde;erminedbyfluorescencepolariza一 ;ionBiochimBiophysActa.1978{515:367 3韩克椿,聂按青,薄惠卿.等用荧光拇剂DPH研究 暄水癌细胞膜脂琉动性.生物化学与生物物理进 展,1981;6:32 4聂橙青.薄惠卿.林克椿.蜂王浆对大鼠红细簏瑛脂 麓动性的影响.北京医学院1983;15:249 5CandyR,PeterGDecreasedmicrosoma[Yllem ;?0a_},1E5 芒耋鬟?’c《z ? 22?湖北医{1学学推 rr.fIuiditviI,l1L(I?IopmLIl1(IfchoI_1{1OIir 111llfIac1lerosclossraII})tt.Exl_M0lIJh.11h(.1 8:.264 ,-ang(IS.StrickharlFSh1’i】1_1heeitc:Lf tcmperal2,:567 O~]JuraT,SateR.t’hecarh(1nmonoxid*binding plgm~r【c?fl1,’er][1icroso[11.Cl”id~ncvf(rils ]le111oprot~:i11GJIIl_r?l1r1Ch~’m-】lI_.:?39 237l_ HYangCS.StrickhartFS,KichaLI1,”}r;tClio~ h~[wccDNADPIt~2ytochromeP4581…f-一 andhepaticmicrosomesBioehlmBiopb}Acta, 1978:509:326. 1]995-n15收稿) TheDeterminationofMicrosomalMembraneLipidRegionFluidity byUsingDPHasFluorescentProbeanditsApplication FuIiusong—PengRenxiu.KongRui DepartmentofPharmacology,HubeiMedicalUniversitY,Wuhan430071.C hina) Abstrct l’hereexislsatightconneclnbetweenmend>ranefunctionandmembranefluidity.Tore sc;trchO[/therctationshipbetweenmicrosoma[membranetipidregionflu[dityandmicrosoma[ nl(.nlhralleconjugatedenzymaticsystem——cylochromeP450systemacti vitY,amethodofdeter— minationofmicrosomaltrmnlbranetipidregionftuiditybyusingDPHasfluorescentprobehas 1TrEeIinvestiga~edandestablishedOilthebasis(Jfthe,tsualme/hodofrlleri-lbrancfluidkyrIlcas~re— Ilcln!~cveralimportantexperimenlalconditionsx3,eredelermined,i.C.afina【conccntratLonOf nPH1,\10mol/I,aincubationtimeofaround”On,inules,asampleproteincontentel5O,100 rI_.thelemperal 【]reofmcuhaticnaudl,*leasuringandselectlugofbufferDetailedinformation col;cernJngthecorrectmeasurenlentandproced~il-eswLsalsointreduced. 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