实验七食物中脂溶性维生素含量分

实验七食物中脂溶性维生素含量分 实验七食物中脂溶性维生素含量 (高效液相色谱法——HPLC)一、 实验目的与要求 1 目的了解高效液相色谱仪的。 2 要求掌握HPLC测定食物中脂溶性维生素含量的方法。 二、 实验原理 样品中的维生素A及维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法 C18反相柱将维生素A和维生素E分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。最小检出量分别为维生素A: 0.8ng，αE: 91.8ng，γE: 36.6ng，δE: 20.6ng。 三、 实验仪器与试剂 1 仪器 (1) 实验室常用设备; (2) 小离心管: 1.5~3.0ml带盖塑料离心管(与高速离心机配套); (3) 高速离心机; (4) 旋转蒸发器; (5) 恒温水浴锅; (6) 紫外分光光度计; (7) 高压液相色谱仪带紫外分光检测器。 2 试剂 (1) 高纯氮气; (2) 无水乙醚: 不含有过氧化物。 ? 过氧化物检查方法: 用5ml乙醚加1ml 10%碘化钾溶液，振摇 1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉液，水层呈蓝色。该醚需处理后使用。 ? 去除过氧化物的方法: 熏蒸乙醚时，瓶中放入纯铁丝或铁末少许，弃去10%蒸馏水和10%残留液。 (3) 无水乙醇: 不得含有醛类物质。 ? 检查方法: 取2ml银氨溶液于试管中，加入少量乙醛，摇匀，再加入10%氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。 ? 脱醛方法: 取2g硝酸银溶于少量水中，取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入1L乙醇中，振摇后，放置暗处两天(不时摇动，促进反应)，经过滤，置蒸馏瓶中蒸馏，弃去初蒸出的50ml。当乙醇中含醛较多时，硝酸银用量适当增加。 (4) 无水硫酸钠。 (5) 甲醇: 重蒸后使用。 (6) 重蒸水: 水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏。 (7) 10%抗坏血酸溶液(100g/L): 临用前配制。 (8) 1?1氢氧化钾溶液。 (9) 10%氢氧化钠溶液(100g/L)。 (10) 5%硝酸银溶液(50g/L)。 (11) 银氨溶液: 加氨水至5%硝酸银溶液中，直至生成的沉淀重新溶解为止，再加10%氢氧化钠溶液数滴，如发生沉淀，再加氨水直至溶解。 (12) 维生素A液: 视黄醇(纯度85%)或视黄醇乙酸酯(纯度90%)经皂化处理后使用，用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1ml相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。 (13) 维生素E标准液: α生育酚(纯度95%)，γ生育酚(纯度95%)，δ生育酚(纯度95%)。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品，使其浓度大约为1ml相当于1mg。临 用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素E的准确浓度。 (14) 内标溶液: 称取苯并\[e\]芘\[纯度98%\]，用脱醛乙醇配制成每1ml相当于10μg苯并\[e\]芘的内标溶液。 (15) pH 1~14试纸。 四、 实验步骤 1 样品处理 (1) 皂化: 称取1~10g样品(含维生素A约3μg，维生素E各异构体约40μg)于皂化瓶中，加30ml无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加5ml 10%抗坏血酸，苯并\[e\]芘标准液2.00ml，混匀。加10ml 1?1氢氧化钾，混匀。于沸水浴上回流30min使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。 (2) 提取: 将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50ml水分2~3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100ml乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有残渣，可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。 (3) 洗涤: 用约50ml水洗分液漏斗中的乙醚层，用pH试纸检验直至水层不显碱性(最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加)。