土壤真菌的分离

土壤真菌的分离 实验目的:掌握从土壤中初步分离培养真菌的方法，从而获得真菌纯培养技能;了解基本接种技术。建立严格的无菌操作概念，掌握无菌操作技术。 实验原理:土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。真菌在土壤中的数量仅次于细菌和放线菌，主要在有机质丰富、透气性好的偏酸性土壤中较多。分离土壤中的真菌并不难，但由于其菌落大，容易扩展，技术准确性较低。本实验采用加有链霉素(或氯霉素、庆大霉素)和孟加拉红的马丁氏培养基分离及计数土壤中的真菌。在此培养基上，放线菌和细菌被链霉素和孟加拉红所抑制，但大多数真菌能够生存，且其菌落受孟加拉红的抑制而较小，从而避免了某些真菌的扩散蔓延而带来的数量上的误差。 实验器材和材料: (1) 器材:台秤、电子秤、烧杯、试管、三角瓶、量筒、酒精灯、 移液管、移液枪、1mL无菌吸管、无菌培养皿、接种环。 (2) 材料:新鲜土样、无菌水、马丁-孟加拉红培养基。 试验方法和步骤: 1. 培养基的制备 (1) 配方: 葡萄糖10.0g 、蛋白胨5.0g 、琼脂 20g 、KHPO24 1.0g、MgSO7,O 0.5g 、1/3000孟加拉红水溶液100mL、 ? 42 0.03?链霉素稀释液100mL、自来水800mL。 (2) 操作步骤: 1) 用搪瓷杯量取自来水500mL置小铝锅中，在电炉上加热。 2) 按配方分别称取各种药品，加入自来水中，边加边搅拌，然后 量取100mL1/3000孟加拉红水溶液加入。 3) 加入20g浸洗过的琼脂煮沸至溶化。 4) 总体积定容至900mL，无需调节pH值。 5) 趁热分装于18mm×180mm试管，每管15mL，塞好棉塞，贴 好标签，装入小铁丝筐，并用旧报纸将棉塞部分包好。 6) 高压蒸汽灭菌，121?灭菌30min。 注意: 1) 取国产链霉素1g/瓶，用无菌吸管吸入10mL无菌水溶解，得到 10%链霉素溶液。取0.3mL该溶液定容于100mL灭菌容量瓶即可 得到0.03%链霉素溶液。 2) 使用前，将上述培养基熔化冷却至55,60?，按每10mL培养 基加入1mL0.03%链霉素溶液，即可使每毫升培养基含30ug链 霉素。 2. 土壤稀释液的制备 -5用“稀释平板计数法”中的方法进行，将土样稀释至10。 称取土样10g放入盛90mL无菌水的三角瓶中，振摇约20分钟，使土与水充分混合，将菌分散。在无菌操作条件下，用1mL无菌移 -1液管吸取lmL10浓度的菌液于一管9mL无菌水中，将移液管吹洗三 -2-5次，摇匀即为10浓度菌液。同样方法，依次稀释到10。 注意:在土壤稀释过程中，吸取不同梯度的菌液需换用不同的吸管。 3. 平板分离 (1)倒平板 将加入链霉素溶液的马丁氏培养基倒平板(方法:右手持盛培养基的试管或三角瓶，左手拿平皿并松动棉塞，用小指和无名指夹住拔出，试管(瓶)口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开少许，迅速注入培养基约15mL左右，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板)。 (2)涂布 -1-2-3将上述每种培养基的三个平板分别标上10、10、10三种稀释 -1-2-3度，然后用三支1mL无菌吸管分别由10、10、10三管土壤稀释液中各吸取0.1mL对号放于已标好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。 4. 恒温培养 将上述接种土壤悬液的平板倒置于28?培养3-5d。 5. 挑菌纯化 从长有单菌落的平板中选取典型的真菌菌落转接斜面，并同时制片作纯度检查，若不纯，应进一步挑取该菌落制成菌悬液进一步作稀释分离，直至获得纯培养体为止。 6. 计数 选择每皿出现10,100个菌落的平板，计算土壤真菌(包括酵母 菌)的含量。 选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算: 每g样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍数 注意:同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊。 这样求得的是每克原始土样中的活菌数，若要折算为每克干土的含菌数，还应将此数值除以干土在土样中所占的质量分数(烘干土的质量/原土样的质量) 注:土壤含水量的测定是将一定质量的土样在105,110?下烘干至恒重，再称干重。 7. 菌种保存 将分离到的真菌转接到PDA斜面上培养，待长好后，置于冰籍中保存，必要时进行深入研究。 注意事项 1. 涂布法接种时一定要涂抹均匀，否则就会无法记数。 2. 接种后的培养皿应静置15分钟以上，然后倒置培养。