柱 层 析、薄 层 层 析.doc

柱 层 析、薄 层 层 析.doc 柱色谱、薄层色谱 一、实验目的 1、了解色谱法分离提纯有机化合物的基本原理和应用。 2、掌握柱层析、薄层层析的操作技术。 二、实验原理 色谱法(Chromatography)亦称色层法、层析法等。 色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能(分配)的不同，或其亲和性的差异，使混合物的溶液流经该种物质进行反复的吸附或分配作用，从而使各组分分离。 色谱法在有机化学中的应用主要包括以下几方面: 1、分离混合物 一些结构类似、理化性质也相似的化合物组成的混合物，一般应用化学方法分离很困难，但应用色谱法分离，有时可得到满意的结果。 2、精制提纯化合物 有机化合物中含有少量结构类似的杂质，不易除去，可利用色谱法分离以除去杂质，得到纯品。 3、鉴定化合物 在条件完全一致的情况，纯粹的化合物在薄层色谱或纸色谱中都呈现一定的移动距离，称比移值(Rf值)，所以利用色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。所以，要获得重现的比移值就比较困难。为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。 4、观察一些化学反应是否完成，可以利用薄层色谱或纸色谱观察原料色点的逐步消失，以证明反应完成与否。 吸附色谱主要是以氧化铝、硅胶等为吸附剂，将一些物质自溶液中吸附到它的面上，而后用溶剂洗脱或展开，利用不同化合物受到吸附剂的不同吸附作用，和它们在溶剂中不同的溶解度，也就是利用不同化合物在吸附剂上和溶液之间分布情况的不同而得到分离。吸附色谱分离可采用柱色谱和薄层色谱两种方式。 柱色谱常用的有吸附色谱和分配色谱两种。吸附色谱常用氧化铝和硅胶为吸附剂。分配色谱以硅胶、硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收较大量的液体作为固定相。 柱色谱常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。供色谱使用的氧化铝有酸性、中性和碱性三种。碱性氧化铝适用于碳氢化合物、生物碱以及其它碱性化合物的分离。中性氧化铝应用最广，适用于醛、酮、醌以及酯类化合物的分离。酸性氧化铝适用于有机酸类的分离。氧化铝的活化分 I~V 五级， I 级的吸附作用太强， V 级的吸附作用太弱。所以一般常采用 II ， III 级。 化合物的吸附性和它们的极性成正比，化合物分子中含有极性较大的基团其吸附性较强。氧化铝对各种化合物的吸附性按下列顺序递减。 酸、碱 > 醇、胺、硫醇 > 酯、醛、酮 > 芳香族化合物 > 卤代物、醚 > 烯 > 饱和烃。 试样吸附在氧化铝柱上后，用合适的溶剂进行洗脱，这种溶剂称为洗脱剂。常用洗脱溶剂的极性按以下次序递增: 己烷、石油醚,环已烷,四氯化碳,三氯乙烯,二硫化碳,甲苯,苯,二氯甲烷,三氯甲烷,乙醚,乙酸乙酯,丙酮,丙醇,乙醇,甲醇,水,吡啶,乙酸 薄层色谱又叫薄板层析，是色谱法中的一种，是快速分离和定性少量物质的一种很重要的实验技术，属固-液吸附色谱，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品(几微克，甚至0.01微克)的分离;另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。此外，薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”。 薄层色谱分为薄层吸附色谱与薄层分配色谱两种，本节介绍的是薄层吸附色谱。薄层色谱是将吸附剂均匀地涂在玻璃板(或某些高分子薄膜)上作为固定相，经干燥、活化后点上待分离的样品用适当极性的有机溶剂作为展开剂(即流动相)。当展开剂在吸附剂上展开时，由于样品中各组分对吸附剂吸附能力不同，发生了无数次吸附和解吸过程，吸附能力弱的部分(即极性较弱的)随流动相迅速向前移动，吸附能力强的组分(即极性较强的)移动慢。利用各组分在展开剂中溶解能力和被吸附能力的不同，最终将各组分彼此分开。如果 各组分本身有颜色则薄层板干燥后会出现一系列高低不同的斑点，如果本身无色，则可用各种显色方法使之显色，以确定斑点位置。在薄板上混合物的每个组分上升的高度与展开剂上升的前沿之比称为该化合物的,f值，又称比移值。对于一个化合物当实验条件相同时其,f值是一样的。 薄层色谱最常用的吸附剂是硅胶及氧化铝。 硅胶是无定形多孔物质。略具酸性，适用于中性或者酸性物质的分离，薄层色谱用的硅胶可分为: 硅胶H--不含粘合剂和其他添加剂。 硅胶G--含煅烧石膏(CaSO?1/2HO)、粘合剂。 42 硅胶HF--含荧光物质，可在波长254nm紫外光下观察荧光。 254 硅胶GF--含煅烧石膏及荧光物质。 254 与硅胶相似氧化铝也因含粘合剂或荧光剂而分为氧化铝G及GF及氧化铝HF。氧化铝的极性比硅胶大，254254 比较适用分离极性小的化合物。 通常将薄板按加粘合剂和不加粘合剂分为两种，加粘合剂的薄层称硬板，不加粘合剂的称软板。常用的粘合剂除煅烧石膏外还有淀粉、羧甲基纤维素钠(CMC)。 化合物的吸附能力与它们的极性成正比，极性大则与吸附剂的作用强，随展开剂移动慢，Rf值小;反之极性小则Rf值大，因此利用硅胶或氧化铝薄层色谱可把不同极性的化合物分离，甚至结构相近的顺、反异构体也可分开。 三、基本操作:(含仪器装置和主要) 1、柱色谱操作步骤: (1) (2) (3) 薄层板在不同的层析缸中展开的方式 柱色谱装置 ( 1 )装柱:取清洁、干燥色谱柱，在玻璃管底铺一层玻璃棉或脱脂棉，轻轻塞紧，再在玻璃棉上盖一层厚约 0.5cm 的石英砂(或用一张比柱直径略小的滤纸代替)，而后将氧化铝装入管内(湿法或干法)。 湿法装柱:是将备用的溶剂装入管内，约为柱高的四分之三，而后将氧化铝和溶剂调成糊状，慢慢地倒入管中。此时应将管的下端旋塞打开。 干法装柱:是在管的上端放一干燥漏斗，使氧化铝均匀地经干燥漏斗成一细流慢慢装入管中，中间不应间断，时时轻轻敲打柱身，使装填均匀，全部加入后，再加入溶剂，使氧化铝全部润湿。另外也可先将溶剂加入管内，约为柱高的四分之三处，而后将氧化铝通过一粗颈玻璃漏斗慢慢倒入并轻轻敲击柱身。此法较简便。 (2)加样:把要分离的试样配制成适当浓度的溶液。将氧化铝上多余的溶剂放出，直到柱内液体表面到达氧化铝表面时，停止放出溶剂。沿管壁加入试样溶液，注意不要使溶液把氧化铝冲松浮起，试样溶液加完后，开启下端旋塞，使液体渐渐放出，至溶剂液面和氧化铝表面相齐(勿使氧化铝表面干燥)即可用溶剂洗脱。 (3)洗脱和分离:在洗脱和分离的过程中，应当注意: ? 不断加入洗脱剂，并保持一定高度的液面，在整个操作中勿使氧化铝表面的溶液流干，一旦流干，再加溶剂，易使氧化铝柱产生气泡和裂缝，影响分离效果。 ?收集洗脱液，如试样各组分有颜色，在氧化铝柱上可直接观察。洗脱后分别收集各个组分。在多数情况下，化合物没有颜色，收集洗脱液时，多采用等份收集，每份洗脱剂的体积随所用氧化铝的量及试样的分离情况而定。 ? 控制洗脱液的流出速度，一般不宜太快，太快了柱中交换来不及达到平衡，因而影响分离效果。 ?由于氧化铝表面活性较大，有时可能促使某些成分破坏，所以应尽量在一定时间内完成一个柱色谱的分离，以免试样在柱上停留的时间过长，发生变化。 2、薄层色谱操作步骤: (1) 点样 在距薄板一端1cm处用铅笔轻轻划一横线作为起始线。将样品溶于低沸点溶剂(如甲醇、乙醇、丙醇、氯仿、苯、乙醚及四氯化碳)配成1%左右的溶液，用内径1mm管口平齐的毛细管点样，垂直轻轻的点在起点线上。若溶液太稀。一次点样不够，则可待前一次试样点干后，在原点样处再点，点样后的直径不要超过2mm，点样斑点过大，往往会造成脱尾、扩散等现象，影响分离效果。一块薄层板可以点多个样，但点样点之间距离以0.5,1.5cm为宜。 (2) 展开剂的选择和展开 展开剂的选择主要是根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素。溶液的极性越大，则对化合物解吸的能力越强，也就是说,f值也越大。如果出现样品各组分,f值都较小，则可加入适量极性较大的溶剂。 薄层色谱的展开需要在密闭容器内进行。将选择的展开剂倒入层析槽或层析缸中(液层高度约为0.5cm)，待容器内容积蒸汽达到饱和后，再将点好的薄层板放入槽或缸中进行展开(含粘合剂的板可倾斜45?~60?角)，注意点样的位置必须要在展开剂液面之上。当展开剂展开，其前沿上升到板顶端5,10mm处时，取出薄板，用铅笔划处前沿的位置、晾干。 (3) 显色 晾干后若分离的化合物本身有色，在薄层板上可看到分开的各组分斑点。如果本身无色，用的是含荧光剂的薄层板在紫外光下一般呈暗色斑点;有时用腐蚀性的显色剂如浓硫酸、浓盐酸和浓磷酸等显色;也可待溶剂挥发后的薄板放入有几粒碘并充满碘蒸汽的密闭容器中许多化合物都能与碘形成黄色斑点，但要注意当碘蒸汽挥发后斑点易消失。除此之外，也可以在薄层板上溶剂蒸发前喷雾显色。 用各种显色方法使斑点出现后，应立即用铅笔划出斑点的位置，并计算,f值。 四、实验内容: 1 、柱层析 (1)试剂 荧光黄和碱性湖蓝 BB 的分离 分离样品:0.5毫升溶有0.5毫克荧光黄和0.5毫克碱性湖蓝 BB的95,乙醇溶液 色谱柱:25 mL酸式滴定管 展开剂:95% 乙醇 固定相:色谱用中性氧化铝(100,200目) (2)步骤 取少量脱脂棉放于色谱柱底部，轻轻压紧，在脱脂棉上盖一层0.5 cm的石英砂，关闭活塞，向色谱柱内倒入95,乙醇至12毫升刻度处。 向色谱柱内加入5克色谱用中性氧化铝，打开活塞，并用95,乙醇洗涤色谱柱壁残留的氧化铝，用吸耳球轻敲色谱柱，使氧化铝填充密实平整，在氧化铝上层加一层0.5 cm的石英砂。操作过程中一直保持液面不能低于石英砂的上层。 当溶剂液面刚好流至石英砂面时，关闭活塞，沿柱壁加入0.5 mL已配好的含有荧光黄和碱性湖蓝BB的95,乙醇溶液，立即打开活塞，当此溶液流至接近石英砂面时，用0.5 mL95%乙醇洗下管壁的有色物质，如此2次，然后向色谱柱中加入15 mL乙醇，开始洗脱。 蓝色的碱性湖蓝BB极性小，首先向柱下移动，极性较大的荧光黄留在柱的上端。当蓝色的色带到达色谱柱下端时，更换接收器，继续洗脱，至滴出液接近无色，再更换一接收器。在此过程中如色谱柱中乙醇不够，可适量补加。 向色谱柱中加满水做洗脱剂至黄绿色的荧光黄开始滴出，用另一接收器收集至黄绿色带几乎完全洗出为止。分别得到两种染料的溶液。在此过程中可以一直保持色谱柱中加满水以加快流速。 2 、薄层色谱 实验内容:用薄层色谱法分离偶氮苯的两种几何异构体。 偶氮苯有顺反两种异构体，多种情况下以反式形式存在，但在日光或紫外光照射下，反式可以部分转化成顺式。 反应式: 光照 NN NN 顺式反式 ( 1 )用 1 块薄层板，在离薄层板一端约 1cm 处，用铅笔轻轻画一直线。取管口平整的毛细管，插入试样溶液中，注意毛细管必须专用，不可弄混，于画线处轻轻点样。 ( 2 )在起点线上中间左侧点被日光或紫外光照射过的偶氮苯溶液、右侧点未被日光或紫外光照射过的偶氮苯溶液;间距为1—1.5cm。晾干、备用。 ( 3 )展开 以体积比 9 : 1 的环已烷/氯仿为展开剂，在层析缸(或大的广口瓶)中加入展开剂，使其高度不超过 1cm 。将点好样的薄层板小心放入层析缸中，点样一端朝下，浸入展开剂约 0.5cm 。盖好瓶盖，观察展开剂前沿上升到一定高度时取出，尽快在展开剂的前沿画出标记 。晾干，观察混合试样斑点出现的位置及相应样品斑点是否相符。计算 R f 值。 五、实验关键及注意事项: 1、柱层析时，棉花塞得太紧，影响洗脱液的流速。 2、柱层析时，柱子要致密紧实，无气泡。 3、点样时，各样点间距1—1.5cm，样点直径应不超过2mm， 4、点样时，毛细管刚接触薄板即可。点样过量影响分离效果。 5、展开剂不超过点样线。 6、取出薄板应立即在展开剂前沿画出标记，如不注意，展开剂挥发后，无法确定其上升的高度。也可先 画出前沿，待展开剂到达立即取出。 六、思考 1、为什么极性大的组分要用极性较大的溶剂洗脱, 2、柱子中若有气泡或装填不均匀，将给分离造成什么样的结果,如何避免, 3、如何利用Rf值来鉴定化合物, 4、展开剂的高度超过点样线，对薄层色谱有什么影响,