翻译血清DHCR24自身抗体可作为丙型肝炎病程的新的生物标志物

血清DHCR24自身抗体可作为丙型肝炎病程的新的生物标志物 摘要 背景 需要新的生物标志物去鉴别丙型肝炎病毒（HCV）- 感染疾病的阶段，以降低死亡率.在此，我们调查是否血清3β-羟基甾醇Δ24还原酶抗体（DHCR24抗体）可以用作诊断丙型肝炎病毒感染进展为肝细胞癌（HCC）的标记物。方法 血清DHCR24抗体取自395例 HCV阳性患者，包括133例慢性丙型肝炎（CHC），85例丙型肝硬化（LCC），和177例丙型肝细胞癌（HCC-C）的患者; 232例乙型肝炎病毒（HBV）阳性病人，包括103例慢性乙型肝炎（CHB），56例乙型肝硬化（LCB），和73例乙型肝癌（HCC-B）的患者;和24名健康对照，测定采用酶联免疫吸附试验。 结果 血清DHCR24抗体水平CHC患者显著高于健康对照组， LCC患者高于CHC患者， LCC患者高于HCC-C患者（以上所有对比的P <0.0001）。血清DHCR24抗体在HCC-B患者中的浓度相比于CHB和LCB组没有表现出显著差异（P=0.1247）。DHCR24抗体水平早期HCC-C显著高于CHC或LCC患者,晚期HCC-C患者显著高于早期HCC-C患者。 DHCR24抗体检测HCC-C的敏感性（70.6％）高于甲胎蛋白（AFP;54.8％）和蛋白诱导维生素K缺乏或拮抗剂-Ⅱ（PIVKA-Ⅱ;42·5％）。此外，DHCR24在HCV阳性患者血清内上调，但在HBV阳性组织或HBV阴性，HCV阴性肝癌标本中并不存在这类情况。 结论  DHCR24自身抗体可作为HCV相关肝脏疾病的一个潜在的非侵入性的生物标志物并可以促进PIVKA-II和AFP阴性肝癌的诊断。 1. 介绍 丙型肝炎病毒（HCV）感染具有高的发病率，发生率，和致病性，并可能演变成肝硬化和肝癌。HCV感染被认为是一个慢性肝病，可能由丙型肝炎病毒免疫逃避产生的准种，它们有很高的复制错误率. 由于丙型肝炎病毒不整合到宿主基因组中，HCV相关的肝癌（HCC-C）主要是通过间接途径诱导，包括慢性炎症，肝硬化，细胞死亡和增殖。丙型肝炎病毒感染的一个特点是扰动脂质代谢;丙型肝炎病毒利用宿主脂类进行复制，并进一步感染。3β-羟基甾醇Δ24还原酶抗体（DHCR24抗体）催化脱氢转化成胆固醇；这种反应似乎在丙型肝炎病毒感染中很典型。先前，我们发现，丙型肝炎病毒DHCR24抗体人类肝母细胞瘤衍生RzM6-LC细胞中有所上调和丙型肝炎病毒DHCR24抗体过度表达后通过抑制乙酰并增加与MDM2原癌基因的相互作用使得p53活性受损。反过来，这也抑制了在肝细胞中发生的过氧化氢诱导的凋亡反应。在高危人群中新型生物标志物和监测策略的开发希望肝癌早发现，并提高生存率。目前，对于早期肝癌最常用的生物标志物是甲胎蛋白（AFP）。然而，15-20％HCC晚期患者AFP水平保持正常，只有10-20％的早期肝癌患者显示AFP异常值。因此，更多的肝癌 生物标记物，包括蛋白诱导的维生素K缺乏或拮抗剂-Ⅱ（PIVKA-Ⅱ;脱-γ-羧基凝血酶原），已经开发出来了。尽管如此，开发出能够检测HCC早期的新的生物标志物仍然是一个重要的问题。此外，没有生物标记物能够与对应的HCV感染的疾病，如慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病相关。因此，本研究旨在评估血清DHCR24自身抗体（DHCR24抗体）的水平与慢性肝炎疾病进展的对应关系。 2. 材料和方法 2.1 样本 受试者取自日本的东京都驹入医院，昭和大学藤丘医院，以及金泽大学附属医院。本研究经每家医院的伦理委员会同意，并按照赫尔辛基宣言实施，所有患者签署知情同意书。 日本东京都驹入医院肝脏科患者15例肝癌患者冷冻肝脏样品（癌和非癌），包括五个HCC-HCV，五个HCC-HBV五个HCC-nonBnonC（NBNC）并将此用于Western杂交和免疫组化试验。 从2007年9月至2014年11月，我们收集了395名HCV阳性患者总计651例的血清样本，其中这些患者分别是133例中度慢性丙型肝炎（CHC），85例肝硬化（LCC），和177例肝细胞癌（HCC-C）; 232例乙肝患者，包括103例慢性乙型肝炎（CHB），56例肝硬化（LCB），和73例肝癌（HCC-B）的患者;以及24名健康对照者（表1）。慢性HCV感染被定义为可检测的血清中的抗HCV抗体和HCV RNA。肝硬化表现于腹水和/或存在食管胃底静脉曲张并能被天门冬氨酸转氨酶（AST），血小板比例指数（APRI）和纤维化-4指数所定义。APRI（cutoff值≧1.00，灵敏度为89％，特异性为74％，PPV38％，NPV98％），计算如下：（AST[IU / L]/正常上限）×100 /血小板（×109 / L）。纤维化-4指数（临界值≧1.45，灵敏度70％，特异性为74％，PPV42％，NPV90％）进行了计算：年龄（岁）×AST（IU / L）/（血小板[109 / L]×[丙氨酸转氨酶（ALT; IU / L）]½）。肝癌由超声诊断并根据病理计算机断层扫描，由肝脏组织活检证实，并根据国际共识组肝细胞瘤标准可分为早期和晚期肝细胞癌。早期肝癌被定义为2至5厘米之间大小的单个病灶，或小于或等于3个病灶，每个≤3厘米。晚期肝细胞癌被定义由单个病灶大于5厘米，或大于3个病灶。慢性HBV感染是由存在于血液中大于6个月的HBV表面抗原，HBV核心抗体，并通过实时PCR检测到的HBV-DNA的结果得出诊断依据。健康对照组肝区无既往病史，病毒性肝炎标志物均为阴性， ALT和AST水平正常。表1总结了研究患者的主要特征。 2.2 蛋白质印迹法 十五例冰冻肝组织标本，在冰上用RIPA缓冲液中（1％十二烷基硫酸钠，0.5％NP40，0.15M氯化钠，10毫摩尔Tris pH为7·4，5mM的乙二胺四乙酸[EDTA]，和1mM二硫苏糖醇）通过A型玻璃匀浆（惠顿科学产品，米尔维尔，新泽西州，USA）使组织化开。蛋白质转移到的Immobilon P聚偏氟乙烯膜（默克密理博，杰夫里，NH，USA）。在室温下，用5％的Block Ace™粉末配制的（大日本制药有限公司，日本大阪）TBST（0.1％吐温20，20Tris-Cl pH值7.6，和137mM的NaCl）中摇匀封闭2小时后，将膜孵育于含有1％的Block Ace TBST配置的含有1微克/ mL的一抗中2h。洗涤后，将膜孵育于含有1％Block Ace的1:2000的辣根过氧化物酶缀合的兔抗鼠抗体（Dako公司，Glostrup的，丹麦）TBST溶液中。蛋白质印迹法使用DHCR24单克隆抗体（单抗）2-152a6作为一抗，actin（多克隆抗体;圣克鲁斯生物技术圣克鲁斯，CA，USA）作为内参。 2.3 肝组织免疫组化 肝癌患者癌和癌旁肝组织冰冻切片制备的最佳切削温度化合物（特德佩拉公司，雷丁，CA，USA），置于玻片，解冻，用磷酸盐缓冲盐水（PBS），并在PBS中用1％多聚甲醛固定10min。用含有1％牛血清白蛋白和1mM EDTA的PBS封闭1h，载玻片用PBS洗涤后在4℃下用一抗（5微克/毫升）孵育过夜。接着，将载玻片用PBS洗涤三次并孵育30分钟用1：1000的Alexa488缀合的山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）的（的Fab'）2片段或Alexa568共轭山羊抗兔IgG（的Fab'）2片段（分子探针，Eugene，OR美国）的含0.05％吐温-20的PBS。接着，将载玻片用PBS洗涤三次，使用Vector屏蔽（向量Laboratories公司，Burlingame的，CA，USA）含10微克盖滑落/毫升TOPRO-3的（分子探针）。使用常规的载玻片观察荧光或共聚焦显微镜（510meta;蔡司，科亨，德国）。 2.4 蛋白质DHCR24的纯化 DHCR24蛋白从HuH-7肝癌细胞裂解物纯化得到。HuH-7细胞（1×108个细胞）溶解在1mL裂解缓冲液C（1％的Triton X-100，20mM的HEPES pH为7·5，1毫摩尔EDTA，1毫升 二硫苏糖醇，和1mM二异丙基），超声处理，并在20400转下离心30分钟。根据制造商的操作准则，上清液在4℃，4小时与500 DHCR24单克隆抗体2-152a微克固定上的HiTrap N-羟基激活高性能柱（Amersham Bioscience公司，Amersham公司，英国）。该树脂用缓冲液C，和结合的蛋白质用0.2M的含有0.5M NaCl的碳酸氢钠（pH为8·3）和立即用相等冰冷的1M Tris pH 8。 2.5 ELISA ELISA法在平底聚苯乙烯板进行（格雷纳生物一GmbH公司Frickenhausen的，德国）预涂用50μl纯化抗原稀释至5μg/ mL的0.05M碳酸钠pH9.0，在4℃过夜。接着，将板用PBS0.1％吐温20，温育在封闭缓冲液（1％的Block Ace/ PBS-0.1％吐温20）37℃下1-2小时。洗涤后，将样品（用封闭稀释缓冲到1：100），阳性对照（小鼠的多克隆抗血清DHCR24稀释至0.5，1和2微克/毫升），以及加入空白（测定无样品）并将板在37℃下1-2小时，随后洗涤。接着，将二抗（1：1000;过氧化物酶缀合物的多克隆兔抗人IgG[Dako公司]的样本，和过氧化物酶共轭多克隆兔抗小鼠IgG[Dako公司]为阳性对照）加入并在37℃下孵育1小时。最后，将板洗涤，除去二级ABS，加入含四甲基联苯胺/H 2 O 2-TMB（Bio-Rad公司，赫拉克勒斯，CA，美国）的溶液，并将板温育在37℃下30分钟。用1N的H2SO4终止反应。使用平板分光光度计读取450nm处的吸光度值（的Thermo Fisher Scientific，Waltham的，MA，USA）在450nm。该测定是在避光下进行，由研究人员计算得出。此外，该测定重复进行的占总样品数约3％，观察显示无差异。 2.6 数据分析 描述性数据以数字和平均值±sd的方式精确表示。在连续变量的差异采用了比较Student t检验，Mann-Whitney U检验，和单向的分析方差（ANOVA）。对于分类变量的数据使用卡方检验。所有P值均为双侧的和P <0.05被认为是存在显著差异。受试者工作特征曲线下面积（AUC面积ROC）和95％的置信区间（CI）的，被用来评估在DHCR24 抗体的诊断价值，以测试的AUC为0.5的假设。此外，阳性和阴性预测值并计算其95％置信区间。所有的相关性采用Spearman相关试验进行了评估。存活率采用Kaplan-Meier曲线估计，用比较双面数秩检验。所有的统计分析使用进行版GraphPad Prism6.0E（格拉夫派得软件圣地亚哥，CA美国）或MedCalc统计软件。 3 结果 3.1 ELISA的建立 我们从2007年9月至2014年11月招募了651名参与者（图1）。研究人群的主要临床和人口统计学特征在表1中有所总结。我们用ELISA筛选了病人血清DHCR24抗体水平。ELISA的抗原是从HuH-7细胞中纯化得到（图2），但是重组DHCR24表达在大肠杆菌中没有显示出适当的反应性（数据未显示）。DHCR24抗体水平用小鼠抗DHCR24作为测定标准。DHCR24抗体浓度和光密度之间的剂量 - 反应关系是非常好的（范围，0-2微克/毫升），最低检出浓度为0.05微克/毫升。 3.2 HCV感染患者的DHCR24抗体水平 所有医院中CHC病人DHCR24抗体的浓度显著高于健康受试者（P<0.0001），但显著低于HCC-C患者（P <0.0001）（图3A，B，C，补充图1）。总体而言， HCC-C组DHCR24抗体水平（平均16.46±0.63微克/毫升）显著高于CHC（8.69±0.25微克/毫升，P<0.0001）和LCC（13.82±0.81微克/毫升，P =0.0418）患者和健康对照组（4.75±0.51微克/毫升，P<0.0001; 图。 3C）。单向ANOVA显示HCC-C和LCC和CHC（P<0.0001）之间均存在显著差异。 绘制ROC曲线以确定最佳临界值来区分HCC和HCV慢性携带者（补充图2）。诊断HCC-C DHCR24血清抗体的灵敏度和特异性分别为70.06％（95％CI：62.73-76.70％）和84.21％（95％CI： 76.88-89.95％）（临界值，11.5微克/毫升）。相应的对于AFP值分别为53.49％（95％CI：45.74-61.12％）和97.66％（95％CI：93.30-99.51％）（临界值，20毫微克/毫升），PIVKA-II抗体的值分别为42.51％（95％CI：34.91-50.39％）和100％（95％CI：96.38-100％）（临界值，40 MIU /毫升）。此外，对于HCC-C的 DHCR24抗体实行了全面准确的诊断评估（表2）。在区分来自丙肝的HCC-C患者中，相较于AFP（0.84，95％CI：0.82-0.91）和PIVKA-II（0.78，95％CI：0.73-0.84），DHCR24抗体显示0.86的AUC（95％CI：0.82-0.91）（补充图2）。HCC-C患者阳性率DHCR24抗体（125/177，71％）比AFP（93/172，54％）和PIVKA-Ⅱ（73/167，44％）都高（P <0.0001;图4A）。联合使用血清DHCR24 Ab和PIVKA-II或AFP水平能够提高HCC病例阳性检出率分别能达到87％和88％（图4A）。 此外，46％的患者（79/172）被认为AFP阴性（<20毫微克/毫升）。其中，血清DHCR24抗体水平有73.4％（58/79）的升高（图4B）。此外，56.3％（94/167）被认为PIVKAII阴性（<40 mIU /毫升）。其中，血清DHCR24抗体水平有75.5％（71/94）升高（图4B）。此外，DHCR24抗体水平在早期肝癌和肝硬化之间可存在显著差异（P=0.0306）以及慢性丙型肝炎患者中的早期肝癌与晚期肝癌之间（P=0.0142）（图4C）。我们进一步评估DHCR24抗体在区分CHC与LCC的作用; ROC曲线显示0.74（95％CI：0.66-0.83）的AUC，这类似于AFP（0.68，95％CI：0.66-0.77）而与PIVKA-II相比具有显著差异（0.56，95％CI：0.43-0.62）（补充图3）。 DHCR24 Ab和AFP或PIVKA-II水平之间的Spearman相关分析没有表现出明显的相关性（分别为RS=-0.15，95％CI：-0.30-0.01，P =0.0668，R2=0.0076;和RS=0.08，95％CI：0.24-0.083，P =0.3149，R2=0.0161（补充图。 4）。 3.3 HBV感染患者的DHCR24抗体水平 下一步，我们从CHB，LCB，和HCC-B检测DHCR24 Ab的血清水平（图5，补充图5）。医院的检测表明，相比健康对照，DHCR24抗体水平在CHB患者中较高（图5A-C）。总体而言，DHCR24抗体在HCC-B中的浓度（平均：7.16±0.50微克/毫升）与CHB（6.49±0.37微克/毫升）和LCB（7.87±0.60微克/毫升）相比没有显著差异（P =0.1247）。然而，慢性乙型肝炎（CHB，LCB，或HCC-B）DHCR24 Ab水平显著高于健康对照组（P B0.05）（图5C）。HCC-B和CHB的DHCR24抗体AUC（0.50，95％CI：0.41-0.60）并不优于PIVKA-II（0.73，95％CI的：0.64-0.82）或AFP（0.77，95％CI：0.71-0.83）（补充图6）。这表明DHCR24 Ab对于HCC-B来说不是一个很好的生物标志物。 3.4 DHCR24在肝癌组织中存在表达差异 为了确定HCV感染是否诱导DHCR24蛋白在肝癌中的表达，15例原代肝癌组织和癌旁的表达组织作为样本通过使用DHCR24单克隆抗体2-152a来进行Western印迹分析。与相邻的非肿瘤组织相比， DHCR24过度表达在所有HCV阳性肿瘤组织（图6A）以及在五分之二的HBV相关，或HBV阴性，的HCV阴性肝癌样品（图6A）。此外，免疫组化分析表明，该DHCR24蛋白表达在癌的HCV-组织中有所增加（图6B），并在癌HBV阳性（图5C）和HBV阴性，丙型肝炎-阴性组织中有所降低（图6D）。总之，这些数据表明，HCV癌组织DHCR24水平比HBV癌组织显著上调。 3.5 HCC-C患者DHCR24抗体水平与临床病理特点的关系 孤立性肝癌被认为是复发和多发性肝癌包括新发和肝内转移。我们比较了孤立性肝癌和多发肝癌之间DHCR24抗体水平。事实上，多发性肝细胞癌患者的DHCR24 Ab的浓度（18.15±1.15微克/毫升），显著高于孤立性肝癌患者（15.07±0.81微克/毫升）（P =0.0417;图7A）。 此外，对遭受过肝动脉化疗栓塞的HCC病人（N =8）治疗前和治疗后的DHCR24抗体水平进行比较。然而，DHCR24抗体水平在治疗前后没有明显差异（P=0.5664;图7B）。 4. 讨论 在血清中，抗体是稳定的和免疫反应是持久的，但是过表达的，突变的，错误折叠，或异常劣化蛋白质可以成为免疫原性的，从而导致机体产生自身抗体;最终，检测患者血清中的这些抗体可以被用于预后和/或诊断。 在这项研究中，我们发现，血清抗体DHCR24水平与丙型肝炎病毒介导的慢性肝炎，肝硬化，肝癌存在联系，但不与HBV有关疾病有关，这表明血清DHCR24的浓度测定可以用于HCV阳性病人的诊断和/或预后。此外，DHCR24抗体在判别CHC从HCC-C患者方面的灵敏度明显优于血清AFP和PIVKA-II水平，并且越高的DHCR24抗体水平对于HCC-C阳性预测越有价值。此外，DHCR24 Ab联合AFP或PIVKA-II能进一步增加HCV阳性肝癌病人的检出率。相反，在慢性HBV感染者中，DHCR24抗体水平在CHB，LCB，和HCC-B（P =0.1247）之间不存在显著差异。 此前，我们已经表明，在体外和体内在HCV感染细胞均存在DHCR24过表达，而丙型肝炎病毒在siRNA下调DHCR24表达下被沉默。然而，HBV感染对于DHCR24的表达不存在显著影响。DHCR24上调在HCV感染可能是由于增加的Sp1的磷酸化，这可能是丙型肝炎病毒诱导的氧化应激造成的共济失调的毛细血管扩张突变引起的，这种氧化应激反应能促进DHCR24转录激活。因此，慢性丙型肝炎病毒感染可诱导DHCR24的增强。此外，这种由于HCV导致的DHCR24表达的增强通过阻断核p53的乙酰化和增加细胞质中p53和MDM2之间的相互作用来抑制p53的活动，这也可能介导抑制p53的降解。因此，受损凋亡信号在p53活性的抑制可促进肝癌的发生。此外，DHCR24已被证明能够抑制胱天蛋白酶-3的活化，胱天蛋白酶-3是参与细胞凋亡的主要蛋白，这说明DHCR24在细胞生存和死亡的调控中存在一定作用。此外，我们发现，单抗2-152a克隆可以结合DHCR24并抑制丙肝病毒的复制，这表明DHCR24抗体具有抗病毒的效果，并且在HCC患者高水平DHCR24 Ab可能导致在癌组织中较低的HCV RNA水平。相比于正常的肝细胞，DHCR24据说更大量表达于肝癌细胞。因此，Tanaka et al.观察到，HCC患者非癌组织和HCV单感染显示病毒水平10~1000倍于癌组织，这可能是肝癌患者较高量DHCR24抗体水平的原因之一。 DHCR24基因已被定位于染色体1p32.3，这是一个通常在HCC扩增并且利于癌变的区域。最近，肝癌患者DHCR24基因两个位点——Q88L和R311H突变，在韩国被发现。此外，DHCR24的过表达是前列腺癌的标志，因为在低级的前列腺癌会有高水平，但随着癌症进展会慢慢降低，DHCR24的过表达同样发生在非肌层浸润性尿路上皮癌进展中。 最后，DHCR24抗体水平可能作为一种晚期肝脏疾病的新的标志物。慢性肝炎从中期到晚期DHCR24抗体水平的增加可为早期疾病进展提供一个潜在的新的标志物，并且HCV阳性患者体内血清DHCR24抗体水平的升高可能反映针对HCC产生的自身免疫相关炎症。然而，需要进一步的研究来阐明慢性丙型肝炎病毒感染时血清DHCR24抗体的诱导机制。 5. 结论 我们使用搜索项“DHCR24抗体OR Seladin-1抗体与（癌症或肿瘤或肿瘤）和诊断”和“DHCR24 ab或Seladin-1 AB和（肝癌癌或肝癌）”在Medline和PubMed上检索。然而，我们没有发现任何研究，评估了在肝癌（HCC）或其它的人类癌症患者血清中3β-羟基甾醇Δ24还原酶抗体（DHCR24抗体）的诊断意义。 在这里，第一次，我们通过多中心调查大规模测量并全面评估DHCR24抗体在肝癌中的诊断准确率并发现在丙型肝炎病毒（HCV）感染的疾病进展中DHCR24抗体水平有所增加。在DHCR24抗体的敏感性和特异性均较高，且预测值和似然比都很令人满意，不论在HCV相关的HCC患者中还是在甲胎蛋白（AFP）和诱导维生素K缺乏或拮抗剂-Ⅱ（PIVKA-II）阴性状态的患者中。因此，血清DHCR24抗体的测定可补充检测HCC中PIVKA-II和AFP阴性的情况并提高HCC-C的检出率。然而，测试无法区分乙型肝炎病毒（HBV）相关的HCC和HBV有关的慢性肝炎或肝硬化，而且我们发现，HCV阳性的患者组织中DHCR24存在上调，但这个情况不存在于HBV阳性组织中。 我们的数据表明，DHCR24抗体对于HCV慢性感染预后存在潜在作用并能够反应自身免疫反应。这方面的内容值得继续深入研究。